一种磨砂玻璃作为细菌载体进行扫描电镜观察的方法

第３４卷第４期２０１５年８月

电一子一显一微一学一报

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｏｃｉｅｔｙ

Ｖｏｌ ３４，Ｎｏ ４２０１５?０８

文章编号：１０００?６２８１（２０１５）０４?０３５５?０４一一

一种磨砂玻璃作为细菌载体进行扫描电镜观察的方法

孙会忠１，宋月芹１，王小东１*，朱金峰２，侯小改１

（１．河南科技大学农学院，河南洛阳４７１００３；２．河南省烟草公司漯河市分公司，河南漯河４６２０００）

摘一要：通过对多种细菌材料的超微形态观察实验，优化出一种以磨砂玻璃作为黏附载体对细菌进行扫描电镜观察的新方法三该方法主要包括收集菌体二二重漂洗二加压黏附二固定二脱水二置换二临界点干燥二粘台二离子溅射和观察等步骤，创新点集中体现在采用磨砂玻璃作为黏附菌体的载体，同时，通过离心加压的方法提高菌体对玻璃表面黏附的牢固性三该方法可操作性强，实际观察效果优良，稳定性好，具有一定的借鉴意义三关键词：磨砂玻璃；细菌；制样方法；扫描电镜

中图分类号：Ｑ３３６；Ｑ９３?３一一文献标识码：Ａ一一ｄｏｉ：１０ ３９６９／ｊ．１０００?６２８１ ２０１５ ０４ ０１４

一收稿日期：２０１５?０２?１２；修订日期：２０１５?０３?２１

一基金项目：河南省烟草公司科学研究与技术开发面上项目（Ｎｏ．ＨＹＫＪ２０１２Ｍ０４）；河南省烟草公司科学研究与技术开发重点项目（Ｎｏ．

ＨＹＫＪ２０１３０２）；上海烟草集团责任有限公司科技项目（Ｎｏ．ＳＺＢＣＷ２０１４?００８３０）；河南科技大学博士科研启动基金（Ｎｏ．４０２６?

１３４８００４７，Ｎｏ．４０２４?１３４８００４５）．

一作者简介：孙会忠（１９７６－），男，河南人，副教授．Ｅ?ｍａｉｌ：ｈｕｉｚｈｏｎｇ６６＠１６３．ｃｏｍ?通讯作者：王小东（１９７７－），男，河南人，副教授．Ｅ?ｍａｉｌ：ｌｙｌｈｓｙｓ＠１２６．ｃｏｍ

一一在微生物学科的显微观测实验中，扫描电镜（ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＳＥＭ）已得到极为广泛的应用［１ ３］三不同生物材料超微结构扫描电镜观察成败的关键取决于样品的制备方法，细菌作为一类个体微小的生物体，超微形态特征的客观体现在菌株的多项分类二发育生物学等研究方面尤为重要三文献报道的细菌电镜观察方法有多种［４ ６］，一种好的方法可以大大提高实验效率，减少耗材浪费，节约

时间［７］三作者通过对多种细菌材料的扫描电镜观察研究实践，优化总结出了一套用磨砂玻璃作为菌体黏附载体的观察新方法三

１一材料和方法

１．１一实验材料

细菌材料：鞘氨醇单胞菌属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ

ｓｐ．）；节杆菌属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）；葡萄球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）；根瘤菌属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．）；微杆菌属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）；勒克菌属（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａｓｐ．），菌种保存于河南科技大学微生物平台实验室三

载体材料：磨砂玻璃（选用磨砂载玻片的磨砂部分），并切割成５ ７ｍｍ２方块三１．２一实验仪器

Ｓｉｇｍａ３?１６ＫＬ型离心机二英国ＱｕｏｒｕｍＫ８５０型临界点干燥仪二日立Ｅ?１０４５型离子溅射仪二日立ＨｉｔａｃｈｉＳ?４８００型场发射扫描电镜三

１ ３一方法与步骤

将细菌材料经液体摇床培养或固体平板划线培养２４ｈ左右，获取旺盛生长的菌体材料三

（１）收集菌体：取培养好的菌液１０ｍＬ，移入１０

ｍＬ无菌离心管，６０００ ８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，留沉淀菌体三

（２）二重漂洗：向菌体沉淀加入５ｍＬｐＨ７ ２，

０ ０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液悬浮漂洗１０ｍｉｎ，离心（条件同前文，下同），再加入５ｍＬ无菌水漂洗５ｍｉｎ，

离心，重复进行一次，最后用１ ５ｍＬ无菌水悬浮菌体三得到干净的菌悬液三

如果是固体平板划线培养的细菌材料，则向平板中加入５ｍＬ无菌水，并用无菌棉签将菌苔轻轻刮下，之后用移液器将菌液移入离心管，其它步骤同菌液材料的处理三

（３）加压粘附：将经过二重漂洗的菌悬液移入１ ５ｍＬ或２ｍＬ无菌离心管，同时将５ ７ｍｍ２磨砂玻璃小块放入离心管（注意磨砂面朝上），离心，弃上清三

（４）固定：向离心管中加入１ ５ｍＬ２ ５％戊二醛溶液，轻柔吹吸悬浮菌体（以磨砂玻璃小块不翻动为宜），放入冰箱４?固定６ｈ，离心，弃上清三

（５）脱水：依次用３０％二５０％二７０％二８５％二９５％二

１００％叔丁醇进行梯度脱水，每个梯度２０ ２５ｍｉｎ，其中１００％叔丁醇进行２次三