衣原体和支原体的检测(实验课)

衣原体和支原体的检测

一、衣原体抗原的检测

衣原体抗原检测试剂盒（胶体金法）

【检验原理】

衣原体按其特性分为三类：沙眼衣原体（Chlamydia Trachomatis）、鹦鹉热衣原体(Chlamydia Psittas)和肺炎衣原体（Chlamydia Pneumoniae）。沙眼衣原体有15个已知的血清型，其中12个血清型与沙眼和生殖道的感染有关；另外3个则与性病性淋巴肉芽肿（Lymphor Ganuloma Venereun, LGV）的发生有关。

沙眼衣原体抗原检测试剂盒（胶体金法）系用抗衣原体脂多糖单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别固定于固相硝酸纤维素膜，并和胶体金标记的另一抗衣原体脂多糖单克隆抗体及其他试剂和原料制成，应用胶体金免疫层析技术，采用双抗体夹心的形式建立的衣原体检测方法，用于女性宫颈和男性尿道中沙眼衣原体抗原的检测。

在实验过程中，将所得到的临床样品放入含有溶液A的样品处理管中，2分钟后，加入等量的溶液B，充分混匀后滴2-3滴在检测试剂盒的加样孔中，然后等待结果出现。在检测试剂盒的硝酸纤维薄膜的检测线上固定有抗衣原体脂多糖单克隆抗体-Ⅱ；质控线上固定有羊抗鼠IgG的抗体。处理后的样品首先与结合了抗衣原体单克隆抗体-Ⅰ的胶体金颗粒混合，并靠毛细管作用使混合液向检测线移动。如果样品中含有沙眼衣原体抗原，则沙眼衣原体抗原会与胶体金复合物及检测线上的单克隆抗体Ⅱ结合形成双抗体夹心复合物，并聚集在检测线上显现出一条可见的红线，此即为阳性结果。无此红线则表示样品中无沙眼衣原体抗原存在，即为阴性结果。

在试纸条上的质控区（C）包被有羊抗鼠IgG，以指示试剂盒反应系统工作是否正常。质控区（C）色带的出现表明：①样品加入量充足②样品在纸条上运行正常。

【主要组成成份】

沙眼衣原体抗原快速检测试剂卡：内含一条包被有抗衣原体脂多糖单克隆抗体-Ⅰ、抗衣原体脂多糖单克隆抗体-Ⅱ和羊抗鼠IgG试纸条。单人份铝箔袋包装。

溶液A 1瓶（含0.2M NaOH溶液，7.5ml）。

溶液B 1瓶（含0.2M HCl溶液，7.5ml）。

样品处理管。

其他如女性取样用消毒宫颈拭子、男性取样用男用消毒拭子及计时器未在包装中提供，请自备。

【样本要求】

取样的质量对沙眼衣原体的检测极为重要。沙眼衣原体的检测质量有赖于准确的样品收集技术，应使样品中含有大量的细胞成分而不只是体液。

宫颈样品：

使用消毒宫颈拭子，或消毒的亚麻、涤纶拭子。在取样前用另外的拭子或棉球将宫颈口外区域的黏液抹去，将取样拭子插入宫颈管内通过鳞柱状上皮交界处，直到几乎拭子头已看不到。旋转拭子15-20秒钟取出，不要碰到宫颈外及阴道壁。这样能保证得到更多的柱状上皮细胞，而沙眼衣原体主要寄生在柱状上皮细胞中。

宫颈样品也可用细胞刷（未提供）收集（注意：孕妇不可用此方法）。清洁宫颈口外后，将细胞刷插入宫颈管，通过鳞柱状上皮细胞交界处，停留2-3秒钟，旋转细胞刷两圈后取出，注意不要碰到阴道壁。

如果检测可以即刻进行，将取样后的拭子放入样品处理管中。

男性尿道样品：

尿道用拭子或细胞刷（未提供）可用于尿道取样。病人在取样前至少1小时内不要小便。将拭子或细胞刷插入尿道2-4厘米，旋转3-5秒钟后取出。如果检测可以即刻进行，将取样后的拭子放入样品处理管中。

每个同学取无菌棉签在无菌生理盐水中湿润后取眼角分泌物后进行衣原体的筛

查。

【检验方法】

A.处理样品和对照：

宫颈拭子、尿道拭子的处理：

将样品处理管放在工作台上，加入6滴溶液A。

②将采样拭子放入含有溶液A的样品处理管中，室温放臵，在处理过程中不断旋转并在管壁挤压拭子，使液体不断被挤出，重复多次，处理2分钟。

③然后加入6滴溶液B，旋转并挤压拭子，尽量使液体流出，然后按感染物品的处理方法将拭子丢弃。

④处理后的样品如在60分钟内使用，并不影响试剂盒的检测结果。

注意：用A、B液处理样本拭子滴加的溶液量应相等。

B.检测步骤：

请在操作前仔细阅读检测试剂盒说明书。

将检测试剂盒从密封袋中取出，放臵在洁净、干燥和水平的工作台上，标明样品编号或名称。如果检测试剂盒保存于低于室温处，须将检测试剂盒及试剂提前取出，放至室温后方可使用。将样品处理管中已处理的样品滴加2～3滴至检测试剂盒的加样孔中。

等待结果的出现。加样10分钟时可判读结果。红线显示的时间根据拭子所采集沙眼衣原体含量的不同而变化，有些阳性样品可在60秒钟后出现结果。为了确保阴性结果，请勿在15分钟后判断结果。

为保证检测结果的正确性，在检验前可使用生产厂家提供的阳性、阴性质控对照品检测。【检验结果的解释】

阴性结果：仅质控线（C）有一条红线，检测线（T）无红线出现。

阳性结果：除质控线外，另有一条红线出现在检测线（T）。

无效结果：质控线不出现红线，则结果无效。应更换新的检测试剂盒重复实验。可用剩余的已处理的样品或重新取样。

注意：当检测线很强时，质控线可能相对减弱，此属正常现象

思考题

1、衣原体的培养方法有那些种，举例怎样才能确诊衣原体感染？

二、支原体的筛查（培养法）

几种主要支原体的生化特性

[检测原理]

本试剂盒适用于解脲原体和人型支原原体的分离培养及药物敏感性试验。试剂盒主要由支原体培养基和检测卡组成，培养基中含有支原体基础肉汤、马血清、酵母提取液、酚红指示剂、混合抗生素、生长因子、尿素和精氨酸等物质，当Uu和Mh生长时，尿素和精氨酸分解生成的碱性物质引起pH上值上升，培养基由黄色变成红色。培养基内加有抑菌剂，可抑制生殖道中的细菌和真菌的生长。

[主要组成成份]

1、支原体培养基本功20瓶

2、检测卡20条

3、无菌矿物油12ml*4瓶

4、使用说明书1份

[标本的采集]

必需在用药前采集标本，支原体对细胞表面有很强的亲和力，应尽可能多收集细胞，标本采集后应尽快接种，不可在室温或普通冰箱久存，以免拭子干燥而使支原体活力降低甚至死亡。

男性：用男性无菌拭子由前尿道1~2cm处取尿液分泌物，根据病情需要，也可取前列腺按摩液、精液。

女性：采集宫颈分泌物，村本采集时应先擦去宫颈口多余粘液，再用另一支拭子在宫颈管内1~2cm处取宫颈分泌物。取材时要在宫颈内旋转并至少停留20秒，以便获得较多的细胞。

如果必须用尿液做支原体培养，可留取清晨中段尿10~20ml，高速离心后，取沉淀物接种，但尿液支原体培养的阳率明显低于尿道（或宫颈）分泌物。

[检测方法]

本试验应注意无菌操作，避免污染。

1、用无菌吸头吸取培养基100μl加入检测卡C-空白孔。

2、将采集的标本拭子插入培养瓶，在靠近液面上方的瓶壁挤压旋转拭子数次，使拭子中样本渗入；若为精液、前列腺液标本，取200μl加入培养基中；若为中段尿，经2000转/分离心10分钟，取沉渣100μl加入培养基中。

3、充分混匀接种标本中的培养基，取100μl加入检测卡的各孔中（除C-孔）。

4、各孔滴加1-2滴无菌矿物油，盖上检测卡盖，臵35℃~37℃孵箱培养，在24h和48h分别观察结果。

[检验结果解释]

1、阴阳性结果判定标准：黄色或橙黄色→阴性（-）；清晰透明红色→阳性（+）；混浊红色→污染。

2、 C-孔（空白孔）应为阴性，若为阳性表示有污染，本次试验无效。

3、 C+孔（对照孔）阴性（48h），可报告无Uu和Mh生长。

4、 C+孔（对照孔）阳性，应观察和记录其余各孔的结果，按下判读：

[注意事项]

1、请注意有效期，在有效期内使用，不同批号的试剂不要混用。

2、月经期、先兆流产妇女禁用，阴道用药或灌洗后禁用。

3、使用前应仔细阅读说明书，使用前发现培养浑浊、沉淀等不应使用。

4、应正确采集标本，及时接种培养基和操作程序规范是提高阳性检出率和准确性的关键。

5、培养基复溶后，在接种检测卡前必须充分摇匀，如果标本的浓度很低检测卡微孔可能不改变颜色或颜色改变不均匀。

6、标本做药物敏感性实验，其中并没有考虑标本中支原体的浓度，实验中可能观察到接种浓度差异引起的菌株实际敏感性和检测卡测得的结果不同的情况。

7、支原体生长培养基应保持透明清亮，遇杂菌污染引起浑浊变红不应报告支原体阳性（但部分含分泌物较多的样本，接种到培养基中可能引起培养基澄清度降低，请注意区别）。

8、因为大部分标本是不均一的分泌物，或者标本中支原体浓度较低，可能导致检测卡微孔接种量不均一，药物敏感性试验结果不合理（高浓度孔有支原体生长，低浓度孔没有支原体生长）。这样的实验结果没有意义，请重做药物敏感性实验或弃用此药物。

9、本产品仅用于体外诊断，供一次性使用，检测卡外包装如有破损，请勿使用。

10、操作过程必须有必要的防护措施以防止操作人员感染，废弃物应作为传染源处理。

[检验方法的局限性]

1、检测结果很大程度上依赖于标本的采集，所以一次的阴性结果并不能确定没有感染。

2、阳性结果指示泌尿生殖道支原体的存在，但并不能作为充分的临床诊断依据，临床的诊断需与临床症状相结合。

3、Uu的判读必须在24小时，而Mh的判读必须在48小时进行判读。

思考题

1、临床引起泌尿生殖道的支原体有那些，各引起那些疾病，怎样去诊断？