花卉组织培养技术

花卉组织培养技术

植物的组织培养，即植物无菌培养技术，是利用植物体离体器官、组织或细胞具有的再生能力，在无菌适宜的人工培养基及光、温度等条件下进行人工培养，使其增殖、生长、发育而形成完整的植株，是植物细胞具有全能性的表现。它是现代最先进的植物繁殖技术，现在我国的花卉工作者，已利用这种方法繁殖出木本、草本、蕨类、仙人掌及多肉植物等许多花卉的优良品种。

组织培养工作应在室内无菌条件下进行，培养的离体材料称为外植体。组织培养根据外植体的不同，可分为胚胎培养、器官培养、组织培养（含愈伤组织）、细胞培养、原生质体培养和细胞杂交等。根据培养的操作方式不同，又可分为固体培养和液体培养。液体培养又有振荡培养、旋转培养和静止培养等。

1、花卉组织培养的应用价值

花卉组织培养，就是分离花卉植物体的一部分，如茎类、茎段、叶、花、幼胚等，在无菌试管，并配合一定的营养、激素、温度、光照等条件，使其产生完整植株。由于其条件可以严格控制，生长迅速，1-2个月即为一个周期，因此在花卉植物的生产上有重要应用价值。

快速大量繁殖方面：对一些难繁殖的名贵品种花卉及一些短期内大量急需生产的花卉，应用很广。兰花、菊花、唐菖蒲等花卉利用腋芽增生，短期得到大量植株。非洲紫罗兰可通过叶片，水仙可通地鳞片，诱导产生不定芽，来达到大量繁殖的目的。

花卉育种方面：百合、鸢尾等许多花卉可以进行远缘杂交，由于生理代谢等方面的原因，常使杂种胚早期败育，因而得不到杂种植物。而在试管中进行胚培养，可使其顺利生长，得到远缘杂种。此外还可采用愈伤组织诱变、花粉培养等多种方法，来进行花卉育种。

培育无病毒苗方面：菊花、唐菖蒲、水仙、郁金香、大丽花等一大批花卉靠无性繁殖法繁殖，病毒逐代传递积累，危害日趋严重。而分离花卉植物0.1-0.5毫米大小的生长点，培养得到的基本上是无病毒苗。因此这一技术已在花卉无病毒苗的培育中广泛应用。

2、花卉组织培养对实验室及设备的要求

花卉组织培养是在人工控制的条件下培养花卉，是一种花卉现代工厂化生产新技术，所以其对实验室及设备有一定的要求。

（1）化学试验室

用于存放各类化学药品，配制培养基等。需要的物品有：

⒈药品柜　存放化学药品。

⒉玻璃器皿柜　存放各类玻璃器皿。

⒊试验台　分别用来安放天平和配制培养基。

⒋冰箱　存放配好的母液和一些需低温保存的药品及植物材料等。

⒌其它　天平、水浴锅、酸度计、水池等。

（2）洗涤消毒室

用作器皿的洗刷、消毒、干燥等，配有高压灭菌锅、烘箱、铁架、水池等，也可与化学实验室合并。

（3）无菌操作室

用于植物材料的消毒、接种、转移、原生质体制备等。要求室内封闭，保持无菌。并具备以下物品：

⒈超净工作台　用于消毒、接种、转移培养材料。

⒉紫外灯　用于空气消毒。

⒊解剖镜　用于胚胎培养、茎尖培养时剥取外植体。

⒋低速离心机　用于原生质体制备。

（4）培养室

是供培养物生长的场所，主要有培养架、控温、控光设备等。培养架可分4－5层，上面安装30－40Ｗ日光灯照明，每天照明10－16小时左右，用自动定时器控制。温度最好保持在15－25℃左右。此外还可根据需要安置液体培养所需的摇床、转床等。

（5）常用药品

组织培养所需药品主要用于培养基的配制，也有部分用于消毒，主要有以下几类：

1、消毒药品　

主要有次氯酸钠、次氯酸钙、双氧水、漂白精片、溴水、硝酸银等。2、无机盐类　

包括大量元素和微量元素两类，主要的盐类有KNO3、

MgSO4·7H2O、NH4NO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、Fe2（SO4）3、

Na2HPO4、CuSO4、NaNO3、Na2SO4、ZnSO4、MnSO4·4H2O、

MnCl2·2H20、KI、H3BO3等，无机盐是供外植体吸收的基本营养成分，各有不同作用，如N、P影响蛋白质的合成，Ca、K、S、Mg影响酶活性等。

3、有机化合物　

主要有蔗糖、维生素类、氨基酸等。其中蔗糖是不可缺少的碳源，也是渗透压调节物质。维生素的主要作用是促进细胞分裂和诱导器官分化。氨基酸是蛋白质组成成分，也是有机氮源。

4、用于组织培养的主要有生长素、细胞分裂素及赤霉素三大类：

⒈生长素类　主要有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4－D 和吲哚丁酸（IBA）。2，4－D有利愈伤组织生长，NAA、IAA、IBA有利于器官分化。

⒉细胞分裂素类　主要有激动素（KT）、6－苄基腺嘌呤（BA）、玉米素（ZT）等。其作用是促进细胞分裂与分化，其中KT能明显促进芽的分化而抑制根的形成。

⒊赤霉素　以GA3运用最广泛，有促进不定芽和幼株伸长的作用。

5、有机附加物　

包括人工合成和天然的有机物，常用的有酵母提取物、椰乳、果汁等及相应的植物组织浸出液。对细胞和组织的增殖和分化有一定促进作用。此外琼脂在组培中作为凝固剂，是外植体的支持体，常用浓度为0.5－1％。

6、水　

培养基用水原则上使用蒸馏水，去离子水等，尤其在对化学成分要求较精确的试验中。但在组培苗的批量生产中，可选用自来水配制，以降低成本。

3、花卉组织培养对培养基的要求

培养基是花卉植物组织培养中十分重要的基质，目前应用的有好多种，但其主要成分大体相同，主要成分是水，其他还有大量元素、微量元素、维生素、生长调节物质、蔗糖和琼脂等。

目前花卉组织培养中应用最多的为MS培养基。其组成是在配制1升（1000毫升）培养基时，加硝酸铵1.65克、硝酸钾1.9克、氯化钙0.44克、硫酸镁0.37克、磷酸二氢钾0.17克、碘化钾0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸镁22.3毫克、硫酸锌3.6毫克、钼酸钠0.25毫克、硫酸铜0.025毫克、氯化钴0.025毫克、硫酸铁27.8毫克、蔗糖30克和琼脂7克。其他生长调节物质要根据花卉的种类和培养目的而确定。MS培养基中大量元素浓度过高，为此常采用1/2、1/4大量元素浓度作培养用，这样生长效果列好。

配制培养基前要准备好三角瓶、试管、烧杯、量筒、吸和等玻璃器皿，预先称好药品。配制时先将琼脂溶化，再加入在水中深解的各种营养元素和蔗糖，然后用氢氧化钠或盐酸调整培养基的pH，一般掌握在5.7左右。以后可分注到养瓶中，盖好瓶盖。培养基配好要经高压灭菌。冷却后放到培养室预培养3天，如没有杂菌污染，才可进行花卉材料的接种。

4、培养基的配制和消毒　

【培养基的配置】

根据培养基配方，算好母液吸取量，并按顺序吸取，然后加入蔗糖溶液，并加入蒸馏水定容，并用0.1－1mol/l的HCl或NaOH调整pH值，加入琼脂加热熔化，配制好的培养基要趁热分注，倒入三角瓶等培养器皿中，封口准备消毒。

【培养基的消毒】　

由于培养基内有丰富的营养物质，极利细菌和真菌繁殖，造成污染，影响组培的成功，一般有高温高压消毒和过滤消毒两种方法。

⒈高温高压消毒　一般用消毒锅消毒，注意消毒锅不能装的过满，锅内保持1.1Kg/cm2的压力,温度120℃左右，大约15－20分钟即可。

⒉过滤消毒　一些易受高温破坏的培养基成分如IAA、IBA、ZT等，不宜用高温高压法消毒，可用过滤消毒，可过滤消毒后再加入已高温高压消毒的培养基中，过滤消毒应在无菌室或超净工件台上进行，以避免污染培养基。

5、组织培养的方法和步骤

（1）、培养材料的采集

组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。

对于木本花卉来说，阔叶树可在一、二年生的枝条上采集，针叶树种多采种子内的子叶或胚轴，草本植物多采集茎尖。

在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。

（2）、培养材料的消毒

（一）先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。

（二）在无菌坏境中将材料放入70％洒精中浸泡30－60秒。

（三）再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01％升汞水中消毒10分钟。（四）取出后用无菌水冲洗三、四次。

（3）、制备外植体

将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。（4）、接种和培养

（一）接种　

在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种4－

10个。

（二）封口　

接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。（三）温度　

培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。

（四）增殖　

外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。

（五）根的诱导　

继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得键壮根系。

（5）、组培苗的练苗移栽

试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。