水稻单粒种子DNA提取及SSR—PCR反应体系的正交设计优化
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纯 度 鉴 定
至 另一 个 １ ｎ 的离 心 管 中。 等体 积 异丙 醇 混 匀 ， ．１ ５ｌ 加入
于一 ０ ２ ℃冰箱 冷 冻 ３ ４ ：￣ ０ ０ ｒ ｉ 心 １ｒｉ ～ ｈ ４Ｃ １０ ０／ ｎ离 ｍ ５ ｎ后 ａ 弃上 清液 。用预 冷 ７ ％乙醇洗 涤沉 淀 ２遍 ，７Ｃ ０ ３ ￣ 干燥 。 加 ５ １ 超纯 水溶 解 。２ ℃储存 。 ０１ ￣ 一０
１２１ Ｓ ．． ＤＳ法
取 １粒 水 稻 干 种 子 。 去颖 壳 。 入 剥 放
预 冷 的研钵 内 ， 碎 后将 粉末 放 人 １ ｍ 离 心管 中 ； 磨 ． ｌ ５ 加
入 ８ ０ １ 热 的 Ｓ Ｓ提 取 ｂ ｆ ｒ（０ ｏ ＬＴ ｉ ＨＣ， ０ 预 Ｄ ｕｆ ５ ｍｍ ｌ ｒ — ｌ ｅ ／ ｓ
要 ４ ６ ） 步 骤繁 琐 ． 难 适应 如 今 种 子 贸易 的快节 ￣ｄ 且 很
奏 。为 了缩短 检测 时间 。 提高工 作效 率 ， 好选 择 干种 最 子进 行 基 因组 Ｄ Ａ的提 取 。匡猛 等翻 Ｎ 以棉 种 为材 料 ，
探索 出一种适 合 棉花 品种 Ｓ Ｒ分析 的 Ｄ Ａ快速 提 取 Ｓ Ｎ 方法 ； Ｄ ｎ ｌ ［ 玉米 、 Ｍｃ ｏ ａ ｄ等 ３ １ 从 棉花 、 麦及 三 叶 草 的 干 小
好 的研 钵 内 ，加入 ８ ０ ０１ ＣＡ Ｍ Ｔ Ｂ裂 解 液 （％Ｃ Ａ ２ Ｔ Ｂ，
１０ ｏ Ｌ Ｔ ｉ— Ｃ ，Ｈ 为 ８０ ５ ｍ ｌ Ｄ Ａ，Ｈ ０ ｍｍ ｌ ｒ Ｈ １ｐ ／ ｓ ． ；０ ｍｏ Ｌ Ｅ Ｔ ｐ ／
为 ８ ； ％Ｐ Ｐ １ ｏ ＬＮ Ｃ ）迅 速 研磨 充 分并 转 入 ． ３ Ｖ 。． ｍ ｌ ａ １ ０ ４ ／
ｐ ＝ ． ２５ Ｈ ８０； ． ｍｍｏ／ ＤＴ ｐ ＝ ． ３ ０ ｌ Ｅ Ａ． Ｈ ８ ０； ０ ｍｍｏ／ Ｃ ； Ｌ ｌ Ｎａ １ Ｌ
ｌ Ｓ Ｓ，５Ｃ 浴 ｌ ；℃ １ ０ ０／ ｉ ％ Ｄ １６ ｏ水 ｈ４ ０ ０ ｒ ｎ离 心 １ ｒ ｎ 吸 ｍ ５ ｉ， ａ
记 具有 分 布广 泛 、 显 性 遗传 、 果稳 定 性 高等 优点 ， 共 结
１２ ． ＤＮ 提取 的方 法 Ａ
Baidu Nhomakorabea
严 重 减 产 的事 件 时 有 发生 ． 子 的质 量 （ 要 是 真 实 种 主
性 和纯 度 ） 制也显 得尤 为重 要 。 控 Ｓ Ｒ（ｉ ｐｅｓｑ ｅ ｃ ｐａｓ 标 记 是 指 以 ２ ６个 Ｓ ｓ ｌ ｅ ｕ ｎ ｅ ｅ ｅｔ） ｍ ｒ ～ 碱 基 为 重复 单 位 组 成 的长达 几 十个 核 苷 酸 的 串联 重 复 序列 ． 广泛 分 布于 水稻 基 因组 中 。 由于 Ｓ Ｒ分子 标 Ｓ
水 稻 干 种 子 ＤＮＡ 较 为 完整 ， 降解 量 少。 获得 理 想 的扩 增 效 果 。 可
本研 究 对 影 响 Ｓ Ｒ扩增 结 果 的模 板 Ｄ Ａ、 浓 度 、 Ｓ Ｎ Ｍ 引物浓 度 、 Ｎ Ｐ 和酶 的浓度 及水 稻单 粒 种子 Ｄ Ａ提 ｄ ｓ ｒ Ｎ 取 方 法等 因素进 行 了探 讨 ． 旨在建 立 一套 成 熟稳 定 的
研 论 究 文
寸 种 闺
水 稻单 粒 种 子 Ｄ Ａ提 取 及 Ｓ — Ｃ Ｎ Ｓ Ｐ Ｒ Ｒ反 应体 系的正交设计优化
李炫丽 王世 才 许 双全
（ 北 省 种子 集 团有 限 公 司禾 盛 生 物 育 种 研 究 院 ， 汉 ４０ ７ ） 湖 武 ３ ０ ０ 摘要： 以水 稻 单 粒 干 种 子 为 材料 ． 行 了 Ｄ Ａ 提 取 方 法 和 进 Ｎ Ｓ Ｒ Ｐ Ｒ 反 应 体 系的优 化 研 究 。 结 果表 明 ： Ｃ ＡＢ法 提 取 的 Ｓ －Ｃ 用 Ｔ
上 清 液 ． 等 体 积 的平 衡 酚和 氯 仿 ： 加 异戊 醇（４１＿ － ２ ： ｋＦ ）
颠倒 混 匀 ：￣ ０ ０ ｒ ｉ 心 １ ｍ ｎ ４Ｃ １０ ０／ ｎ离 ａ ｒ ５ ｉ，将 上 清液 吸 出
在 指纹 图谱 构 建 、 遗传 多 样性 分析 等 方 面有着 广 泛 的
应 用 【 在 生产 指 导 中常 用 于杂 交水 稻 品种 真 实 性 和 ｌ 】 ．
在杂 交水 稻纯 度鉴 定 和真实 性鉴 定 过程 中．大 多
工 作 人 员常 选 取 幼 小 植 株 或幼 嫩 叶 片为 材 料 进 行植
物 基 因组 提 取 ． 种 方 法 不仅 费 时 （ 子 发 芽 一 般需 这 种
１． Ｃ Ａ 法 ．２ Ｔ Ｂ ２
取 １ 水 稻 干 种子 ． 粒 放入 预 先冷 冻
在 试验 设 计 范 圈 内 ， 定 的 最佳 反 应 体 系为 ２ １１其 中含模 板 确 ０１ ． ．
ＤＮＡ ５ ｇ，Ｎ ｒ ｓ浓 度 为 ０１ ｍｍｏ／ ３ｎ ｄ Ｐ ．５ １ Ｌ， 引 物 浓 度 ０４ １ ．Ｐ ｍｏ／ Ｌ，
Ｓ Ｒ分子 标记 技 术 反应 体 系 ． Ｓ Ｒ标 记技 术更 好 的 Ｓ 使 Ｓ 为杂 交 水稻 纯 度 、 种质 资 源鉴 定 及分 子标 记 育 种等 工
作 服务
Ｍ 浓度 为 １ ｍ ｌ Ｔ ｑ酶 为 １ Ｕ。 ． ｍｏ Ｌ，ａ ５ ／ ． ６ 关键词 ： 水稻 ； 种子 ； Ｔ Ｂ 法 ；ＤＳ法 ；Ｓ －Ｃ 体 系优 化 Ｃ Ａ Ｓ Ｓ ＲＰ Ｒ
ｌ 材 料 与 方 法
我 国是 世 界 上 第 一个 在 生 产 上 利 用 水 稻 杂 种 优 势 的国家 ． 交水 稻 的推 广 对大 幅度 提 高粮 食 生产 起 杂 了 巨大 的推进 作 用 ． 由于 种子 质量 问题 给农 户造 成 但 １ 材 料 以杂交 水 稻 品种 两 优 ２ ７ 扬 两优 ６号 干 ． １ ８、 种 子为 试验材 料
２ ｌ 心管 中 。５ ｍ离 ６℃水 浴 １ ， ｈ 室温 下加 入等 体积 的 ２ ： ４１
氯 仿／ 戊 醇 ，２ ０ ｒ ｉ 心 １ｒｉ； 上 清 液 ， 入 异 １ ０ ０／ ｎ离 ｍ ５ ｎ取 ａ 加 等体 积 的 １ Ｔ Ｂ沉 淀缓 冲液 ： ％Ｃ Ａ 轻轻 摇晃 至形 成 絮状 沉 淀 ．０ ０／ ｉ 离 心 ８ ｎ 沉 淀 Ｄ Ａ； 加 入 ２ ｌ ５０ｒ ｎ ｍ ｍｉ Ｎ ｍ
至 另一 个 １ ｎ 的离 心 管 中。 等体 积 异丙 醇 混 匀 ， ．１ ５ｌ 加入
于一 ０ ２ ℃冰箱 冷 冻 ３ ４ ：￣ ０ ０ ｒ ｉ 心 １ｒｉ ～ ｈ ４Ｃ １０ ０／ ｎ离 ｍ ５ ｎ后 ａ 弃上 清液 。用预 冷 ７ ％乙醇洗 涤沉 淀 ２遍 ，７Ｃ ０ ３ ￣ 干燥 。 加 ５ １ 超纯 水溶 解 。２ ℃储存 。 ０１ ￣ 一０
１２１ Ｓ ．． ＤＳ法
取 １粒 水 稻 干 种 子 。 去颖 壳 。 入 剥 放
预 冷 的研钵 内 ， 碎 后将 粉末 放 人 １ ｍ 离 心管 中 ； 磨 ． ｌ ５ 加
入 ８ ０ １ 热 的 Ｓ Ｓ提 取 ｂ ｆ ｒ（０ ｏ ＬＴ ｉ ＨＣ， ０ 预 Ｄ ｕｆ ５ ｍｍ ｌ ｒ — ｌ ｅ ／ ｓ
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探索 出一种适 合 棉花 品种 Ｓ Ｒ分析 的 Ｄ Ａ快速 提 取 Ｓ Ｎ 方法 ； Ｄ ｎ ｌ ［ 玉米 、 Ｍｃ ｏ ａ ｄ等 ３ １ 从 棉花 、 麦及 三 叶 草 的 干 小
好 的研 钵 内 ，加入 ８ ０ ０１ ＣＡ Ｍ Ｔ Ｂ裂 解 液 （％Ｃ Ａ ２ Ｔ Ｂ，
１０ ｏ Ｌ Ｔ ｉ— Ｃ ，Ｈ 为 ８０ ５ ｍ ｌ Ｄ Ａ，Ｈ ０ ｍｍ ｌ ｒ Ｈ １ｐ ／ ｓ ． ；０ ｍｏ Ｌ Ｅ Ｔ ｐ ／
为 ８ ； ％Ｐ Ｐ １ ｏ ＬＮ Ｃ ）迅 速 研磨 充 分并 转 入 ． ３ Ｖ 。． ｍ ｌ ａ １ ０ ４ ／
ｐ ＝ ． ２５ Ｈ ８０； ． ｍｍｏ／ ＤＴ ｐ ＝ ． ３ ０ ｌ Ｅ Ａ． Ｈ ８ ０； ０ ｍｍｏ／ Ｃ ； Ｌ ｌ Ｎａ １ Ｌ
ｌ Ｓ Ｓ，５Ｃ 浴 ｌ ；℃ １ ０ ０／ ｉ ％ Ｄ １６ ｏ水 ｈ４ ０ ０ ｒ ｎ离 心 １ ｒ ｎ 吸 ｍ ５ ｉ， ａ
记 具有 分 布广 泛 、 显 性 遗传 、 果稳 定 性 高等 优点 ， 共 结
１２ ． ＤＮ 提取 的方 法 Ａ
Baidu Nhomakorabea
严 重 减 产 的事 件 时 有 发生 ． 子 的质 量 （ 要 是 真 实 种 主
性 和纯 度 ） 制也显 得尤 为重 要 。 控 Ｓ Ｒ（ｉ ｐｅｓｑ ｅ ｃ ｐａｓ 标 记 是 指 以 ２ ６个 Ｓ ｓ ｌ ｅ ｕ ｎ ｅ ｅ ｅｔ） ｍ ｒ ～ 碱 基 为 重复 单 位 组 成 的长达 几 十个 核 苷 酸 的 串联 重 复 序列 ． 广泛 分 布于 水稻 基 因组 中 。 由于 Ｓ Ｒ分子 标 Ｓ
水 稻 干 种 子 ＤＮＡ 较 为 完整 ， 降解 量 少。 获得 理 想 的扩 增 效 果 。 可
本研 究 对 影 响 Ｓ Ｒ扩增 结 果 的模 板 Ｄ Ａ、 浓 度 、 Ｓ Ｎ Ｍ 引物浓 度 、 Ｎ Ｐ 和酶 的浓度 及水 稻单 粒 种子 Ｄ Ａ提 ｄ ｓ ｒ Ｎ 取 方 法等 因素进 行 了探 讨 ． 旨在建 立 一套 成 熟稳 定 的
研 论 究 文
寸 种 闺
水 稻单 粒 种 子 Ｄ Ａ提 取 及 Ｓ — Ｃ Ｎ Ｓ Ｐ Ｒ Ｒ反 应体 系的正交设计优化
李炫丽 王世 才 许 双全
（ 北 省 种子 集 团有 限 公 司禾 盛 生 物 育 种 研 究 院 ， 汉 ４０ ７ ） 湖 武 ３ ０ ０ 摘要： 以水 稻 单 粒 干 种 子 为 材料 ． 行 了 Ｄ Ａ 提 取 方 法 和 进 Ｎ Ｓ Ｒ Ｐ Ｒ 反 应 体 系的优 化 研 究 。 结 果表 明 ： Ｃ ＡＢ法 提 取 的 Ｓ －Ｃ 用 Ｔ
上 清 液 ． 等 体 积 的平 衡 酚和 氯 仿 ： 加 异戊 醇（４１＿ － ２ ： ｋＦ ）
颠倒 混 匀 ：￣ ０ ０ ｒ ｉ 心 １ ｍ ｎ ４Ｃ １０ ０／ ｎ离 ａ ｒ ５ ｉ，将 上 清液 吸 出
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应 用 【 在 生产 指 导 中常 用 于杂 交水 稻 品种 真 实 性 和 ｌ 】 ．
在杂 交水 稻纯 度鉴 定 和真实 性鉴 定 过程 中．大 多
工 作 人 员常 选 取 幼 小 植 株 或幼 嫩 叶 片为 材 料 进 行植
物 基 因组 提 取 ． 种 方 法 不仅 费 时 （ 子 发 芽 一 般需 这 种
１． Ｃ Ａ 法 ．２ Ｔ Ｂ ２
取 １ 水 稻 干 种子 ． 粒 放入 预 先冷 冻
在 试验 设 计 范 圈 内 ， 定 的 最佳 反 应 体 系为 ２ １１其 中含模 板 确 ０１ ． ．
ＤＮＡ ５ ｇ，Ｎ ｒ ｓ浓 度 为 ０１ ｍｍｏ／ ３ｎ ｄ Ｐ ．５ １ Ｌ， 引 物 浓 度 ０４ １ ．Ｐ ｍｏ／ Ｌ，
Ｓ Ｒ分子 标记 技 术 反应 体 系 ． Ｓ Ｒ标 记技 术更 好 的 Ｓ 使 Ｓ 为杂 交 水稻 纯 度 、 种质 资 源鉴 定 及分 子标 记 育 种等 工
作 服务
Ｍ 浓度 为 １ ｍ ｌ Ｔ ｑ酶 为 １ Ｕ。 ． ｍｏ Ｌ，ａ ５ ／ ． ６ 关键词 ： 水稻 ； 种子 ； Ｔ Ｂ 法 ；ＤＳ法 ；Ｓ －Ｃ 体 系优 化 Ｃ Ａ Ｓ Ｓ ＲＰ Ｒ
ｌ 材 料 与 方 法
我 国是 世 界 上 第 一个 在 生 产 上 利 用 水 稻 杂 种 优 势 的国家 ． 交水 稻 的推 广 对大 幅度 提 高粮 食 生产 起 杂 了 巨大 的推进 作 用 ． 由于 种子 质量 问题 给农 户造 成 但 １ 材 料 以杂交 水 稻 品种 两 优 ２ ７ 扬 两优 ６号 干 ． １ ８、 种 子为 试验材 料
２ ｌ 心管 中 。５ ｍ离 ６℃水 浴 １ ， ｈ 室温 下加 入等 体积 的 ２ ： ４１
氯 仿／ 戊 醇 ，２ ０ ｒ ｉ 心 １ｒｉ； 上 清 液 ， 入 异 １ ０ ０／ ｎ离 ｍ ５ ｎ取 ａ 加 等体 积 的 １ Ｔ Ｂ沉 淀缓 冲液 ： ％Ｃ Ａ 轻轻 摇晃 至形 成 絮状 沉 淀 ．０ ０／ ｉ 离 心 ８ ｎ 沉 淀 Ｄ Ａ； 加 入 ２ ｌ ５０ｒ ｎ ｍ ｍｉ Ｎ ｍ