有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点
@单细胞凝胶电泳
将混有待测细胞的琼脂糖铺于载玻片上，凝固后浸入冷溶解液中使细胞裂解，在电泳液中解链后水平电泳，洗涤后用DNA 结合荧光染料染色，在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像，评价DNA 的损伤程度。 3.1 形状指标这是一类比较粗略的指标。根据细胞荧光图像是否象慧星一样头尾分明将其分为慧星一样细胞和非慧星样细胞，计数一定量细胞中慧星样细胞所占的比例，即慧星样细胞发生率，估计DNA 的损伤程度。这种指标可通过镜下观察直接得到，方便实用。
3.2 距离指标直接在显微镜下或在照片上测出慧星的一些长度数值，如尾长，即沿电泳方向“慧星”尾部最远端与头部中心间接的距离；总慧星长度，即“慧星”电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值等，以评价DNA损伤程度。这些指标描述电泳中DNA泳动的距离，易于测量，无需复杂的仪器设备及图像处理软件，而且在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用剂量之间有较为良好的线性关系。 3.3 强度指标Ostling等人最初用SCGE 技术检测射线对DNA损伤时用“慧星”头部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值来描述DNA 的损伤。PoI1er 等人用“慧星”尾部总荧光强度同“慧星”头部总荧光强度的比值来表示DNA 的损伤程度。新近有报道根据“ 星”尾部荧光强度将细胞分为五类，由弱到强分别计为0、1、2、3、4，将100 个细胞的分值加在一起表示DNA 的损伤程度，并证明该数值与总慧星长度有较好的相关性。这些指标都不同程度地反映了电泳中泳动DNA 的量。 3.4 “矩”类指标为反映DNA 损伤，上述距离类指标和强度类指标均不全面，有实验证明损伤因素作用剂量增大时，DNA 损伤程度明显增加而尾长基本不变。为将二者结合起来，更全面反映DNA 损伤程度，Olive 等人于1990 年首次描述了“尾矩”（tail moment ，TM ）的概念，定义为尾部DNA 占总DNA 的百分比与头、尾部中心间距的乘积。作者用实验证实该指标比上述其它指标都优越，很快就被广泛接受。具体流程如下：①镀膜法制备底胶，将洁净的载玻片在0.2％的常熔点琼脂糖中浸没1 min后，置37 ℃孵箱烘烤过夜；实验时将细胞悬液与低熔点琼脂糖(42 ℃以1∶1的比例在离心管中混匀，立即灌胶(先用盖玻片在已包被的载片上搭一个22 mm×10 mm×0.17 mm的小槽再灌胶，4 ℃静置15 min后取下盖片，制得含细胞胶层。②裂解，4 ℃，1 h。③水洗，三
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）说明书
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书
一 单细胞凝胶电泳实验介绍
单细胞凝胶电泳( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 又名彗星试验(comet assay)， 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复，具有方法灵敏、快速优点，同时既可以定性又可以定量，目前DNA 损伤检测的其他方法（Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法）是无法比拟的。彗星实验是检测DNA 微损伤和修复的新方法，得到国际遗传毒性检测程序工作会议认可。彗星实验是简单、快捷检测DNA 微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。
彗星实验具有以下优点：
1 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T 和B 淋巴细胞敏感；
2 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；
3 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；
4 安全性好，避免了同位素的使用；
5 在单细胞水平上对DNA 损伤进行可视性检测；
6 准确性好、灵敏度高；
7 属于新技术，客观实际，国际遗传毒性学术委员会认可。
二、试剂盒组成（见试剂盒内）
三、试剂使用说明（见试剂盒内）
四、操作步骤
1.各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5个/ml。
彗星实验
玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液（PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA）、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。
实验步骤：
1.制片：配制1%的琼脂糖凝胶，于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用；
2.细胞处理：将细胞消化收集，离心后吸弃上清，用预冷的1*PBS清洗细胞一次，以1*10^5细胞/ml悬浮细胞；
彗星实验
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。
实验原理：它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。
单细胞凝胶电泳技术应用范围
单细胞凝胶电泳技术应用范围
一、单细胞凝胶电泳技术简介
单细胞凝胶电泳，也被称为SCGE或者彗星实验，是一种用于分析单个细胞DNA损伤的方法。其基本原理是：当DNA在受到损伤时，其迁移率会增加，因此可以通过电泳检测其迁移距离。这是一种灵敏的检测DNA损伤和DNA修复的生物技术。
二、应用领域
1.生物学：在生物学研究中，单细胞凝胶电泳技术被广泛应用于研究DNA损
伤和修复机制。彗星实验能有效地检测细胞在受到环境压力或遗传影响下所受到的DNA损伤。例如，研究者可以通过分析细胞受到紫外线和化学物质等诱导剂处理后的DNA损伤程度，来研究这些因素对细胞的影响。
2.生物医学：在生物医学领域，单细胞凝胶电泳技术被用于检测和诊断各种
疾病，包括癌症和神经退行性疾病。由于这些疾病的发生和发展常常伴随着DNA的损伤和突变，因此通过单细胞凝胶电泳技术可以有效地检测出这些变化。
3.基础生物学研究：基础生物学研究中，单细胞凝胶电泳技术用于揭示基因
突变、DNA损伤修复、细胞凋亡等基础生物学过程。例如，通过比较不同处理条件下细胞的DNA损伤程度，可以研究各种因素对细胞生存和死亡的影响。
三、技术优势与局限性
单细胞凝胶电泳技术的优势在于其高灵敏度和特异性，可以检测单个细胞的DNA损伤。然而，该技术也有一些局限性，例如对细胞的破坏性、实验操作复杂和结果解释主观等。
四、操作技巧与实验条件
在进行单细胞凝胶电泳实验时，需要注意的关键技巧包括：选择合适的细胞、优化细胞裂解和电泳条件、准确测量和解释结果。具体的实验条件包括细胞浓度、缓冲液成分、pH值、离子强度、温度等，这些都会影响实验结果。对于具体的实验条件，可以参考相关文献或专业书籍进行设定。
单细胞凝胶电泳试剂盒说明书
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书
一、原理
DNA在自由基（如·OH）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破坏，磷酸二脂键的断裂，碱基的破坏或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使DNA分子解旋。将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA 分子向阳极移动。如果DNA损伤严重，碎片多，则电泳速度快。未受损伤的DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。用EB染色，可观察到DNA受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。
二、试剂盒组成
三、操作步骤
1．细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬使其密度为1×106个/ml。2．铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制，
第1层凝胶的制备：加热熔解的正常熔点琼脂糖，冷至45-60℃，取100μL铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，置4℃下10min使琼脂糖凝固。
第2层凝胶的制备：将10μL细胞（约 104个）和75μL的0.7%低溶点琼脂糖（在37℃水浴加热30min使之完全溶化）混合均匀。然后，迅速将含细胞的低溶点琼脂糖滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃下10min使第2层琼脂糖凝固。
3．细胞裂解：移去盖玻片，将载玻片置于平皿中,倒入预冷的裂解液（使用前每9 ml加入1 ml的DMSO），4℃裂解1～2h，取出载玻片用PBS漂洗。要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落。
4．DNA解旋：将载玻片再次置于平皿中，倒入解旋液，室温放置20～60min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。
单细胞凝胶电泳技术概述
2010.No16８２
装入。特别是薄壁轴承内孔易发生变形，安装后要用内径百分表在内孔２至３处相互垂直方向测量检查。如果内孔有缩小、锥度、椭圆等现象，要用铰削、刮研、滚压方法进行修复，以保证工作接触面和运动间隙。（２）滚动轴承的安装，要掌握轴承内外圈与轴和孔的配合松紧度，安装前要做好清洗和涂油工作，将轴承有牌号的一端面装在可视部位。选择正确的安装方法、不可用榔头直接击打轴承，应用铜棒或专用工具，防止轴承的损伤。若轴承的轴孔同时装入时，应在轴承的内外圈上同时加力，以保证轴承的滚动体不受力防止滚动体受操作，影响运转精度和降低使用寿命。轴承安装后应转动灵活、无噪声、无斜摆、无阻滞现象。
５．６ 齿轮传动件安装应注意的问题：
齿轮和轴的配合要适当，不能有偏心或偏斜现象。两齿啮合应有适当的啮合间隙，间隙过小齿轮转动不灵活，使齿面的磨损加剧；间隙过大换向时产生冲击力；间隙过大过小都可以导致齿轮的使用寿命降低。两齿啮合时齿轮的接触部位要正确；啮合面积要符合要求；齿轮的错位量不得超过规定值；齿轮的啮合面积小或部位不正确，会使齿面磨损加快，响声大和齿轮早期损坏。
５．７ 油封安装时应注意的问题：
骨架唇口油封的安装，施加在油封端面的压力必须均匀，防止安装时因施加压力不均匀而使油封变形，降低密封性能。油封安装好后应在唇口上涂一层很少量的润滑脂，防止工作初期干摩擦损伤油封的密封线部分。装入轴和连接盘时，应平稳旋转推入，防止偏斜和用力过猛推出损伤油封。封润滑脂的油封安装时唇口向外，新润滑脂注入时旧润滑脂可以顺利排除。封润滑油的油封安装时唇口向内，以提高油封的密封性能。○形圈安装时，要按规定的规格尺寸安装，用过大或过小的○形圈都会降低○形圈的密封性能。安装前要清理和清洗干净○形圈的安装部位和接合面，这些部位不清洁都会影响○形圈的压缩率。○形圈的压缩率过大会使橡胶的“压缩应力松弛”而产生永久的变形，降低密封性能；压缩率过小○形圈的弹性接触力达不到要求，也降低了○形圈的密封性能。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。
单细胞琼脂糖凝胶电泳(comet assay)修订版
单细胞琼脂糖凝胶电泳（comet assay）
Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)
步骤：
一、细胞悬液的制备：
1.吸弃旧培养基，D-Hanks冲洗2遍
2.0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，
使成细胞悬液，加入离心管，1000rpm，离心10min，弃上清，以1mlD-Hanks悬浮细胞，以上应在暗室及较低温度下进行。各组收集细胞2~3×106个，必须分散成单个。悬浮于1mlPh7.4PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。
二、玻片制备：
1. 玻片磨砂。
2. 制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。用pH7.4 PBS 配制。称0.1g溶于20mlPBS，如NMA与玻片附着不紧，可升高其浓度至0.65%。
铺第一层胶：0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温>5min使其固化，即为第一层胶；
第二层胶：37℃0.5%LMPA 100μl+30-50μl（1-2x106）细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱>5min，使其固化。
* 余下的细胞1000g×10min离心，于0.1-0.2ml悬浮缓冲液中混匀，做Western-blot。
三、细胞溶解：
1. 玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，4℃>1小时或过夜。玻片在细胞消化液中可至少存放4周。
细胞溶解液配制
NaCl 146.1 g
单细胞凝胶电泳技术
单细胞凝胶电泳技术的试验步骤
试剂及材料：
1）0.01M PBS pH7.3：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。保存存于室温或4℃冰箱中。
2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）
3）0.6％低熔点凝胶（PBS配制）
4）毛玻璃片5）盖玻片
6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10％DNMSO，1％Triton X-100
7）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）
8）EB（2ug/ml）
步骤：
1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；
2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6％低熔点胶（cell 与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；
3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液
内（临用前加10％DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h；
4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。
5.电泳：电压20V，300mA，30min
6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH
7.5漂洗3次，每次3min；或双蒸水漂洗2次，每次5～15min，
单细胞凝胶电泳(SCGE)技术
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术
单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。
1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）
DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。
单细胞凝胶电泳研究进展
单细胞凝胶电泳研究进展
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)又称彗星试验(comet assay)，是由Ostling建立经Singh等改进的一种检测有核细胞DNA损伤的技术。其原理是：包埋在琼脂糖凝胶中的细胞经裂解和解螺旋，使断裂的DNA碎片进入凝胶，在电场作用下，带负电荷的DNA断片向阳极迁移，形成彗星影像。由于该方法具有敏感、简便、快速、低耗等优点，广泛应用于遗传毒理、环境监测、临床、饮食以及氧化应激和细胞凋亡的研究。
随着SCGE技术的发展，其检测损伤的精确性在不断提高。用单纯的SCGE技术所看到的彗星图像，只能辨别其DNA损伤程度，但无法确定DNA断片是从哪条染色体上断裂下来的，于是，SCGE 与荧光原位杂交相结合，解决了这一问题。为了进一步了解DNA碱基氧化损伤的情况，在SCGE过程中加入纯化的修复酶来识别损伤的嘧啶和嘌呤，扩大了SCGE的检测范围。本文就彗星试验结合荧光原位杂交、检测DNA碱基氧化损伤、以及在染色、玻片储存和彗星图像分析方面的进展综述如下。
1 原理及发展
在Rydberg等[1]首次定量DNA链断裂后，Ostling等[2]提出了微量电泳技术即单细胞凝胶电泳试验(SCGE)或称彗星试验。该技术是
在中性电泳条件下检测DNA双链断裂。随后Singh等[3]将实验条件改为碱性(pH>13)，使之不仅能检测DNA单、双链断裂，而且能检测碱性易变性位点(一些只在碱性条件下才转变成单链断裂的DNA损伤)。在碱性条件下，DNA双链解螺旋且碱变性为单链，DNA断链和碱易变性断片从严密的超螺旋结构中释放出来。由于单链断裂的碎片分子量小，电泳时带负电的断链或碎片离开核DNA向阳极迁移形成“彗星”影像。细胞DNA受损愈严重，产生的断链和碱性易变性断片就愈多，断链或断片愈小，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度，可定量测定单个细胞DNA的损伤程度。
单细胞凝胶电泳(SCGE)技术
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术
单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。
1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）
DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。
单细胞凝胶电泳技术操作方法介绍
单细胞凝胶电泳技术操作方法介绍
单细胞凝胶电泳技术是一种用于分析和检测细胞的分子遗传学方法。
它的原理是使用电场将细胞内的核酸以其电荷特性分离，并基于分子量将
其分成不同的组分，以此达到检测细胞内特定核酸分子的目的。具体操作
步骤如下：
1.将拆解的细胞悬浮液加入凝胶腔中，然后添加凝胶固定液进行凝固；
2.将凝固的凝胶加入电泳槽中，并将底部加人电源，然后上部加入溶
解液进行溶解；
3.调节电压，使核酸片段沿电场梯度向某一方向移动；
4.当片段移动到一定位置时，进行靶标分析，以此实现细胞内特定核
酸片段的检测。
彗星分析实验：单细胞凝胶电泳
实验步骤
2. 制片：有3种类型：
（1）“三明治”凝胶：在磨毛玻璃上铺第一层正常熔点琼 脂糖，第二层为细胞悬液与低熔点琼脂糖混合液，第三层 为低熔点琼脂糖；
（2）双层凝胶：不铺上述第三层凝胶；（今天选用） （3）单层凝胶：为改善琼脂糖凝胶易与玻片分离的缺点，
在玻片上制一凹槽进行单层灌胶。
实验步骤
2. 制片：第1 层凝胶的制备 • 用胶布将载玻片封边 • 将适量（300～350μl）0.5%的NMA浇注到
基本原理
• 有核细胞核纤层为DNA提供锚定位点
基本原理
• 用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细 胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜及其它生 物膜遭到破坏，细胞内的RNA、蛋白质及其 它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，但 核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨 架上，并留在原位。
基本原理
• 如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其 分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈 现圆形的荧光团，无脱尾现象。
实验步骤
6. 中和、染色
– 将载玻片置于大平皿中，用中和液中和2～3次， 4℃，每次 15min
– 用滤纸将缓冲液吸干 – 每凝胶滴加100 μl AO, 染色20min （避光） ； – 将玻片在蒸馏水中漂洗（避光）。
实验步骤
7. 观察、拍照和分析：
– 置荧光显微镜下，拍照 – 用专用的软件进行分析。
单细胞凝胶电泳试验
（一）原理
单细胞凝胶电泳试验（，）是近年来经过不断完善逐步发展起来地一种快速检测单细胞水平损伤地新技术.文档来自于网络搜索
有核细胞地分子量很大，超螺旋结构附着在核基质中，分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液地作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内地、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核仍保持缠绕地环区附着在剩余地核骨架上，并留在原位.如果细胞未受损伤，电泳时，核因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形地荧光团，无拖尾现象.若细胞受损，在中性电泳液（）中，核仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响双螺旋大分子地连续性.只有当双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星.如果在碱性电泳液（>）中，先是双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂地碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核向阳性迁移，形成拖尾.细胞受损愈重，产生地断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移地量也就越多，迁移地距离越长，表现为尾长地增加和尾部荧光强度地增强.因此，通过测定迁移部分地光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞地损伤程度.文档来自于网络搜索
（二）仪器
．全磨砂载玻片
．号盖玻片
．微量吸管和吸头
．冰盒
．电泳仪
．荧光显微镜
（三）试剂
．正常熔点及低熔点琼脂糖.
．细胞裂解液：，，，％肌氨酸钠，用调值到.用前加％和％.文档来自于网络搜索．碱性电泳液：，调到.
．缓冲液（）.
．荧光染料：µ地溴乙锭，也可用µ地吖啶橙或µ地碘丙锭等.
单细胞凝胶电泳的原理及特点
单细胞凝胶电泳的原理及特点
单细胞凝胶电泳分析（single cell gel eletrophoresis，SCGE）是由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，能够灵敏地检测DNA断裂，在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用价值。因其细胞电泳形态颇似彗星，又称彗星实验（comet assay）。有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载波片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无脱尾现象。若细胞受损，在中性电泳液（pH=8）中，核DNA 仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾。细胞DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强，因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞DNA损伤的程度。SCGE检测单细胞水平DNA损伤，无须放射性示踪，适用于各种有核细胞，样品用量少，试验周期短，故而灵敏、快速、高效。
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1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件；
旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。
低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。
凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。
注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。
2、中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例）
1) 淋巴细胞的提取
①取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。
②取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。
③重复洗涤细胞两次。
2) 琼脂糖玻片的制备
①制好微型电泳槽。
②使用两层凝胶法,第一层为100μl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶, 第二层为75μl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。
3) 细胞裂解、电泳
①好的玻片浸入新配的预冷的(4ºC)中性裂解液中裂解1.5h。
②取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。
③将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。
4) 染色
用溴化乙啶(2μg/ml)染色。
用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。
5)读片和分析
①用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓
取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。
②用CASP软件分析系统分析慧星图像。
3、biomed96 ：lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。
铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul 0.5％低熔点胶。
裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解1小时
解旋液：EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。电泳40分钟。
染色：PI 50ug/ml染色15分钟。
结果是什么都看不到，好像一点都没染色。
lq6688：首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解
液ph10，所以检测结果应是单链断裂。
其次，您用的是三层三明治铺胶法，目前多数彗星试验已经少用此法，而是双层法甚至单层灌胶，有人担心双层或单层铺胶的脱胶问题，只要在凝胶的承载载体上做点文章，就解决了！我用的是双层铺胶法，我不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干，是为了防治脱胶吗？我建议您采用双层法（卖瓜人不说自己的瓜苦，呵呵），这样在实验操作上可以节省时间，不必担心脱胶问题，我做了一年多了，自认为很成熟了，从来没有出现脱胶问题，（我不知道您用的凝胶承载体是什么？）。
第三，解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。
第四，因为我用的EB染色，2ug/ml，效果很好，您用PI染色，我可能没有发言权，因为我不知道PI 的荧光激发光波长是多少，是否您的荧光条件不对？可以查查文献，这一点您对PI应该比我更了解吧。
第五，您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时。
第六，我不知道您用的什么细胞，50000个细胞加入100ul0.5％低熔点胶，是不是细胞太多了，含细胞层的凝胶如果细胞密度过大，即使做出结果，彗星图像过于密集，头尾连接互相影响，无法分析。一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了。
还有一点，差点忘了，我刚刚做的时候，不会用荧光显微镜，大开了自然光源，其实荧光激发根本不用开自然光源，画蛇添足。只要荧光光路通畅了，物镜会出现特殊的荧光，只要波片上有荧光染色的细胞，它肯定跑不了！
biomed96：非常感谢lq6688 老师，您的建议很有用。
1.我用的是HepG2细胞，我是看了一篇文献，上面说最大可以达到50000个细胞，因为第一次做的时候一个细胞都没见到，我以为是细胞数过少，所以我就加大细胞：（根据您的指导，应该肯定可以排除这个可能性了。
2.关于电泳时间，我也是参考文献的，同时该篇文献上建议的电泳条件为15V 400mA,但我们实验室的电泳仪电流上不去，只能到100mA，不过参照您的成功经验，这样的条件已经是可以了的吧？
3.我烤胶也是按照同一篇文献的：（主要也是为了防止脱胶的问题。因为我开始也试过不烤胶，裂解后捞起来时确实出现了脱胶的问题，所以还得向您请教一下，每层胶铺上以后时怎么处理的？另外，我用的载体是普通的显微镜观察用的载玻片，不知道行不行？
4.关于染色的问题，由于我们实验室这个实验做的不多，所以不敢用EB，怕污染了荧光显微镜，根据文献建议的几种燃料，我选择了PI，不过我现在想可能是浓度小了，昨天我上流式用PI单染时，用到了1mg/ml 出来结果很漂亮，下面我也会考虑加到PI浓度试一下。不过也可能正如您的提示，我的裂解时间过短，我会首先拉长裂解时间看看的。另外，我配的各种溶液成分是对的吧？
5.关于单链，双链断裂的问题，因为我正是想通过这个实验看看我的样品对DNA的损伤情况，或者是说究竟有无损伤？（不知道我这要设计合不合理？敬请指正）如果这样可以的话，是不是我要分别做中性和碱性的实验，再进行判断？
6.我观察细胞的时候是把自然光关掉的，所以应该不是这个问题。关于数据分析的问题，是不是我用数码相机拍下了照片就可用CASP了？如果是就太好了，因为我正想去外边联系成像系统和分析软件呢。所以还麻烦您提供下载的链接。
再次感谢lq6688 老师，希望您能继续指导我的实验。
lq6688：SCGE的实验条件尚缺乏标准化，去年曾在美国召开专门会议讨论SCGE的标准化，这都是有文献可查的。
您的列解液应该不是问题，只要能够把细胞膜和核膜列解就可以了，1%TritonX-100 应该是临用时加的吧，另外我还加了DMSO，也是临用时加的。
我觉得您完全可以作中性和碱性两种，这样您的结果就更完美了。
三层铺胶法在铺胶后都要加盖片的，目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶，我是将普通波片稍加改