有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点
单细胞凝胶电泳技术应用进展
又被称为“ 彗星电泳” ］ 细胞的生物膜在细胞裂解液的作用下被破坏， ［． ７ 使细胞内的 Ｄ Ａ 蛋白质及其 Ｎ 、 他成分进入凝胶， 继而扩散到裂解液中， 惟有核 Ｄ Ａ仍 附着在剩余的核骨架上而 留在原位 ． Ｎ 如果细胞 未受损伤， 电泳中核 Ｄ Ａ停留在核基质中， Ｎ 经荧光染色后呈现 圆形 的荧光团， 无拖尾现象 ． 若细胞受
到损伤， 在碱性电泳液（Ｈ＞１） Ｄ Ａ双链解螺旋且碱变性为单链， ｐ ３ 中， Ｎ 单链断裂的碎片离开核 Ｄ Ａ向 Ｎ 阳极迁移， 形成拖尾 ． 细胞核 Ｄ Ａ受损伤越严重， Ｎ 产生的断链或碱变性碎片就越多， 片断也越小， 电泳 表现为彗星尾越长和彗尾越亮［ ． ８ 通过荧光显微镜观察有无彗星及彗尾的长度、 】 亮度、 出尾率等， 判断
以研究活细胞 Ｄ Ａ的损伤， Ｎ 还可以研究死细胞的 Ｄ Ａ损伤， Ｎ 从而避免了只能用活细胞 （ 如染色体畸 变、 微核、 姐妹染色单体互换等） 的限制， 因而其对于建立动物模型深入探讨运动性氧应激与 Ｄ Ａ损伤 Ｎ 的分子生物学机制仍不失为一种优越的研究方法 ． 同时，Ｃ Ｅ技术也将为运动性疾病和运动性疲劳的早期诊断提供更有效 的实验方法和手段 ． ＳＧ 在 使用单细胞凝胶电泳技术在运动医学中的应用得 出结论 ：Ｃ Ｅ技术 由于需样品量少， Ｄ Ａ损伤检 ＳＧ 对 Ｎ 出的灵敏性高， 无需同位素标记， 技术简单、 费用低， 能够快速、 准确检测有害物质存在场所中各类人群 的 Ｄ Ａ损伤及筛检对 Ｄ Ａ损伤因素敏感的高危人群 ． Ｎ Ｎ
速、 低耗 等优 点 ， 因此被 广泛应 用在 Ｄ ＮＡ的损 伤与 修复 、 传 毒理 、 境监 测 以及氧 化 应 激和 细胞 凋亡 遗 环
等研 究中［１ ６．
１ 单细胞凝胶电泳技术原理
单细胞凝胶电泳检测外照射诱导DNA单链断裂和双链断裂
参 照 Ｂ ｎｔ ａａｈ等 的 方 法 ， 述 如 下 ： １ 正 常 熔 点 琼 脂 （ ． ％ ） ５ 简 （） ０ ５ ８ Ｌ均 匀 铺 在 磨 砂 载 玻 片 上 ， 取 ７ Ｌ含 约 １ 个 细 胞 的低 熔 点 琼 脂 （ ． ％ ） 匀 铺 在 正 常 熔 点 凝 胶 层 上 ， 于其 吸 ５ ０ ０７ 均 再 上铺 一 层 低 熔 点 琼 脂 凝 胶 ；２） 玻 片 浸 人 新 配 的 中性 裂 解 液 （ ｍｏ ＬＮａ Ｉ３ ｍｍｏ ＬＥ Ｔ （ 将 ２ ｌ Ｃ ，０ ／ ｌ Ｄ Ａ， ／
１ 材 料 和 方 法
１ １ 主 要 试 剂 和药 品 ．
正 常熔 点 琼 脂 糖 （ ＮＭＡ） 低 熔 点 琼 脂 糖 （ ＭＡ） ＤＭＳ Ｔ ｔｎｘ一 １ｏ及 溴 化 乙 锭 均 为 、 Ｌ 、 Ｏ、 ｒｏ ｉ ０ ＡＭＲ Ｓ Ｏ公 司 产 品 （ ＥＣ 由华 美 生物 工 程 公 司分 装 ） 。
１２ 重 要 仪 器 ．
Ｏ ＹＭＰ ＳＢ ６ Ｌ Ｕ Ｘ ０型 荧 光 显 微 镜 为 １本 株 式 会 社 产 品 ； Ｙ 一 Ⅱ型 电 泳 仪 （ 京 大 学 产 品 ）， ３ Ｄ 南 水 平 电泳 槽 （ 京 大 学 产 品 ） 南 。
１ ３ 实 验 动 物 ．
雄 性 昆 明 系 小 鼠购 于 苏 州 医 学 院 动 物 部 ， ６
细 胞 ， 射 线 照 射
中 图分 类 号 Ｒ８ １５ １ ．
Ｄ Ａ的损伤与修 复是放射生物 学 的重要研 究课 题 ， 其是 电离辐 射 所致 Ｄ Ａ单链 断裂 Ｎ 尤 Ｎ 和双链 断裂是决定受 照射细胞命 运 的关键 因素 之一 。早期 建 立 的检测 Ｄ Ａ单链 断裂 和双链 Ｎ 断 裂 方 法 灵 敏 度 较 低 ， 作 条 件 不 易 控 制 ， 获得 的结 果 反 映 了 群体 细 胞 ＤＮ 操 所 Ａ损 伤 效 应 ， 能 不 对 单 个 细胞 进 行 分 析 … 。近 年 来 由 Ｏｉ ｌ 等建 立 的 测 定 Ｄ Ａ 双链 断 裂 的 中性 微 凝 胶 电泳 技 ｌ ｅ２ ｖ Ｎ
单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方法及进展
单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方法及进展赵琳娜;陈薛钗;钟儒刚【摘要】The single cell gel electrophoresis is a common technology for the detection of DNA damage.It has the advantages of high sensitivity,economic,easy and fast.Nearly three decades,this technology is widely used in genetic toxicology,environmental monitoring,medical diagnostics and nutrition research.The single cell gel electrophoresis technique not only is capable of detecting DNA damage but also can detect DNA crosslinks,UV-induced pyrimidine dimers,oxidized bases and alkylation damage after joined fragmenting agent or specific endonuclease.Recently,single-cell gel was widely used in many fields by combining with fluorescence in situ hybridization.This article reviewed the conventional and unconventional single cell gel electrophoresis methods,and the prospects were also discussed.%单细胞凝胶电泳技术是一种常见的检测DNA损伤的技术,它具有灵敏度高、经济、简便、快速等优点.近30年来,这种技术被广泛地应用于遗传毒理、环境监测、医学诊断、营养研究上.单细胞凝胶电泳技术不单单能检测DNA断裂损伤,在加入断裂剂或者特异性内切酶后,可以检测到DNA交联和紫外线诱导的嘧啶二聚体,氧化碱基和烷基化损伤.近些年单细胞凝胶电泳与荧光原位杂交技术相结合后更是拓宽了它的应用范围,对常规和非常规的单细胞凝胶电泳技术及其操作方法进行了归纳总结,并讨论了它的发展前景.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2013(030)003【总页数】5页(P85-88,71)【关键词】单细胞凝胶电泳;DNA损伤;彗星电泳和荧光原位杂交技术联用【作者】赵琳娜;陈薛钗;钟儒刚【作者单位】北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100124【正文语种】中文【中图分类】Q503单细胞凝胶电泳技术( single cell gel electrophoresis， SCGE)又称“彗星电泳”(comet assay)，是一种常用的检测DNA损伤的技术。
单细胞凝胶电泳技术
单细胞凝胶电泳技术的试验步骤试剂及材料：1）0.01M PBS pH7.3：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。
保存存于室温或4℃冰箱中。
2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6％低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10％DNMSO，1％Triton X-1007）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）步骤：1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6％低熔点胶（cell 与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h；4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。
5.电泳：电压20V，300mA，30min6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；或双蒸水漂洗2次，每次5～15min，7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。
或者4℃，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。
1.2.5 改良彗星试验操作步骤为节省实验时间，本研究将铺三层胶法改为铺一层胶法，同时在中和及染色等步骤进行了改良，具体操作如下:将已染毒的淋巴细胞悬液与40℃的1%低溶点琼脂糖等浓度混匀后，取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上，加盖玻片，4℃冷凝，20min后揭盖片;4℃于碱性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃电泳（25V，300mA）30min;中和5min;加碘化丙啶，暗处染色10min，加盖片;于莹光显微镜下镜检，照像。
单细胞凝胶电泳技术应用范围
单细胞凝胶电泳技术应用范围一、单细胞凝胶电泳技术简介单细胞凝胶电泳，也被称为SCGE或者彗星实验，是一种用于分析单个细胞DNA损伤的方法。
其基本原理是：当DNA在受到损伤时，其迁移率会增加，因此可以通过电泳检测其迁移距离。
这是一种灵敏的检测DNA损伤和DNA修复的生物技术。
二、应用领域1.生物学：在生物学研究中，单细胞凝胶电泳技术被广泛应用于研究DNA损伤和修复机制。
彗星实验能有效地检测细胞在受到环境压力或遗传影响下所受到的DNA损伤。
例如，研究者可以通过分析细胞受到紫外线和化学物质等诱导剂处理后的DNA损伤程度，来研究这些因素对细胞的影响。
2.生物医学：在生物医学领域，单细胞凝胶电泳技术被用于检测和诊断各种疾病，包括癌症和神经退行性疾病。
由于这些疾病的发生和发展常常伴随着DNA的损伤和突变，因此通过单细胞凝胶电泳技术可以有效地检测出这些变化。
3.基础生物学研究：基础生物学研究中，单细胞凝胶电泳技术用于揭示基因突变、DNA损伤修复、细胞凋亡等基础生物学过程。
例如，通过比较不同处理条件下细胞的DNA损伤程度，可以研究各种因素对细胞生存和死亡的影响。
三、技术优势与局限性单细胞凝胶电泳技术的优势在于其高灵敏度和特异性，可以检测单个细胞的DNA损伤。
然而，该技术也有一些局限性，例如对细胞的破坏性、实验操作复杂和结果解释主观等。
四、操作技巧与实验条件在进行单细胞凝胶电泳实验时，需要注意的关键技巧包括：选择合适的细胞、优化细胞裂解和电泳条件、准确测量和解释结果。
具体的实验条件包括细胞浓度、缓冲液成分、pH值、离子强度、温度等，这些都会影响实验结果。
对于具体的实验条件，可以参考相关文献或专业书籍进行设定。
五、数据处理与分析方法处理和分析单细胞凝胶电泳数据需要使用特定的软件和统计学方法。
通过分析DNA迁移的长度和形状，可以推断出DNA的损伤类型和程度。
同时，通过比较不同处理或不同种类的细胞之间的数据，可以深入了解各种因素对DNA 的影响。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。
同时，这种技术只需要少量细胞。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
电泳知识点总结
电泳知识点总结一、电泳的原理电泳是利用带电粒子在电场中受到电场力的作用而运动的原理进行物质分离的技术。
电泳技术最基本的核心原理是利用生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）在电场中的电荷性质和电场力的作用而运动的原理进行物质分离。
当生物分子处于电场中时，带电粒子将受到电场力的作用，移动速度与带电粒子的电荷量和电场强度成正比，与溶液的粘度成反比。
电泳的原理可以简单概括为：根据生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）在电场中受到的电场力的作用而运动的速度不同而进行分离的原理。
常见的电泳分离包括凝胶电泳、毛细管电泳、等温点电泳等。
二、电泳的分类根据所使用的分离介质的不同，电泳可以分为凝胶电泳和毛细管电泳等不同类型。
1. 凝胶电泳凝胶电泳是指在凝胶（如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中进行电泳分离的技术。
凝胶电泳通常用于对DNA、RNA、蛋白质等大分子生物分子进行分离和检测，其分辨率高、操作简便等特点。
凝胶电泳根据凝胶的性质和用途，可以分为琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖-聚丙烯酰胺双杂交凝胶电泳等多种类型。
2. 毛细管电泳毛细管电泳是指利用毛细管进行电泳分离的技术。
毛细管电泳通常用于对小分子药物、多肽、核酸等进行分离和检测，具有分辨率高、分析速度快、用样品量少等优点。
毛细管电泳根据毛细管的类型和使用的分析方法，可以分为毛细管凝胶电泳、毛细管等温点电泳、毛细管毛细管电泳、毛细管毛细管电泳等多种类型。
三、电泳的应用电泳技术广泛应用于生物学、生物化学、医学、食品安全等领域，是实验室中常用的分离和检测技术。
电泳技术的主要应用包括：1. 生物分子分离和检测电泳技术被广泛应用于对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的分离和检测。
在分子生物学和生物化学实验室中，凝胶电泳被用于对DNA片段、PCR产物、蛋白质等的分离和检测，毛细管电泳被用于对小分子药物、多肽、核酸等的分离和检测。
2. 波谱分析电泳技术被用于质谱、荧光、放射性同位素等多种检测方法的联用，用于对生物分子的分离和检测。
单细胞凝胶电泳试验
单细胞凝胶电泳试验（一）原理单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis，SCGE）是近年来经过不断完善逐步发展起来的一种快速检测单细胞水平DNA损伤的新技术。
有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，SCGE 分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。
如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。
若细胞受损，在中性电泳液（pH=8.0）中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。
只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。
如果在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾。
细胞DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量也就越多，迁移的距离越长，表现为尾长的增加和尾部荧光强度的增强。
因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞的DNA 损伤程度。
（二）仪器1．全磨砂载玻片2．1号盖玻片3．微量吸管和吸头4．冰盒5．电泳仪6．荧光显微镜（三）试剂1．正常熔点及低熔点琼脂糖。
2．细胞裂解液：2.5mol/L NaCl，100mmol/L NaEDTA，10mmol/L Tris-HCl，1％2肌氨酸钠，用NaOH调 pH值到10。
用前加1％Triton X-100和10％DMSO。
EDTA，300mmol/L NaOH 调pH到13。
单细胞凝胶电泳
五 思考题
• 试分析三层胶浓度不同的原因 • 试分析影响单细胞凝胶电泳实验结
果的因素。
单细胞凝实验胶十电七泳技术
单细胞凝胶电泳技术
——丁书茂 ——丁书茂
ห้องสมุดไป่ตู้
• 单细胞凝胶电泳技术single cell gel electrophoresis, SCGE ;也称彗星试验(et assay) ，是Ostling O和Johanson KJ首次 提出，后经Singh等进一步完善的一种在单 个细胞水平上检测DNA损伤 交联和修复的方 法 因其简单、灵敏、低耗、快速等优点而 广泛应用于生物检测、遗传毒理、流行病学 调查等诸多方面。
• 第三层胶：移开盖片;滴加100μL质量 分数为0 5%的LMA于第二层胶上，加盖 片， 4℃凝固10min
4 裂解
• 将制好的凝胶放入冷的裂解液中;4℃ 下裂解2小时；
• 裂解液使用时新配铺完第二层胶后即可配制
90ml lysis solution 10ml DMSO 1ml TritonX100
3 制片
• 第一层胶：在完全磨毛的载玻片上 铺180μL质量分数为 1%的正常熔点 琼脂糖NMA;室温固化10min；
• 可将玻片用吹风机稍微加热，以延 缓琼脂糖凝固
• 第二层胶：取50μL 质量分数为0 8%的 低熔点琼脂糖LMA和30μL的细胞悬液; 混匀后滴加于第一层胶上，加该盖片使 其均匀铺开，4℃凝固10min；
5 解旋
• 从裂解液中将载玻片取出;在蒸馏 水中洗去过多盐，晾干
• 将新配制的电泳缓冲液倒入电泳 槽中，约覆过载玻片0 25cm，盖 上 盖 子 ， 在 高 pH 电 泳 缓 冲 液 中 放 置20 min以便DNA解螺旋。
DNA损伤检测方法及DNA修复机制概述
DNA损伤检测方法及DNA修复机制概述DNA是生物体内重要的遗传物质，它携带了生物体遗传信息的编码。
然而，由于各种外界和内源性因素的影响，DNA分子可能会受到损伤，这可能导致细胞功能异常甚至引发严重的疾病，如癌症。
因此，准确检测DNA损伤并了解DNA修复机制对于维持细胞的稳态至关重要。
DNA损伤检测方法是一种评估DNA损伤程度和类型的基因学工具。
下面将介绍常见的DNA损伤检测方法和DNA修复机制的概述。
一、DNA损伤检测方法1. 单细胞凝胶电泳（SCGE）：SCGE是一种常用的DNA损伤检测方法。
它通过将细胞固定在凝胶上，通过电场作用将损伤的DNA片段移动到凝胶上。
损伤的DNA片段在凝胶上呈现出“尾巴”状，以此来评估DNA损伤的程度。
2. 酶联免疫吸附分析（ELISA）：ELISA是一种免疫学方法，可以用于检测DNA损伤的体内和体外标志物。
通过特异性抗体与已修复的DNA损伤标志物结合，ELISA可以定量评估DNA损伤的程度。
3. 荧光染料：通过与DNA结合的荧光染料，可以直接观察和评估DNA损伤。
常见的荧光染料有乙酰丙酮、DAPI、SYBR Green等。
这些染料与损伤DNA结合后会发出荧光信号，通过荧光显微镜观察和图像分析，可以评估DNA损伤的程度和位置。
二、DNA修复机制概述DNA修复是细胞对于DNA损伤的主要生理响应机制，细胞通过多种方式修复DNA损伤，以维持基因组的完整性。
1. 直接修复：直接修复是最简单的DNA修复机制之一，通过修复DNA中的化学修饰来恢复DNA的完整性。
常见的直接修复机制包括光反应修复、DNA甲基化修复和脱氨酶修复等。
2. 错配修复：错配修复主要用于修复DNA中的碱基配对错误。
细胞通过识别和修复DNA链上的错配配对，保证了DNA双链的稳定性和准确性。
错配修复机制包括互补链修复（MMR）和核酸切除修复（NER）等。
3. 核苷酸切除修复：核苷酸切除修复是修复DNA中严重损伤的一种重要机制。
单细胞凝胶电泳(SCGE)技术
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。
它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。
【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。
因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。
1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。
从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。
SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。
在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。
为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。
最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。
不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。
但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。
1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。
单细胞凝胶电泳技术在环境生物监测中的应用
臭氧 与碳氢化 台 物超 标 ， 管上 皮 细 胞 Ｄ Ａ 泪 Ｎ
受 到损伤 ， 且北部 居 民（ 空气 中的臭氧浓 度偏
高 ） 于南 部 居 民 （ 要 污染 物 为 碳 氢化 合 高 主
１ 一 般 环 境 监 测
除 了人 群 监 测 以外 ， 可 用 Ｓ Ｇ 也 Ｃ Ｅ对 动 物及植 物进行 监测 分析 。早 在 １９ 年 Ｓ Ｇ ９１ ＣＥ
随着工业 生 产 、 源 、 通 的发 展 ， 能 交 各种
废气 排放量 明显增 加 ， 大气 中的 各种 有 害物 质 的浓度 急剧增 高 。各 种环境 污染 物对人 体 的危 害 ， ９ 致 癌 致 突变 性危 害成 为 研 究 特 是 的热 点 ， Ｄ Ａ的损 伤被认 为是致 癌 的先 导 而 Ｎ
成分分析 才能 够较好地评 价 空气质 量和颗粒
物 的遗传 毒 性 。Ｐｌ等 发现 Ｓ Ｇ ｏ ｌ Ｃ Ｅ可 灵 敏
成 的影 像形 似 夜 空 中 的彗 星 ， 又 叫彗 星实 故
验 （ｏ ｅ ａ ａ ） ｃｍ ｔ ｓ ｙ 。环 境 中 的遗 传 毒 物 浓 度 一 ｓ 般 很低 ， 用经典 的细胞 学方 法 ， 如染 色体 畸变
维普资讯
国外 医学卫 生 学分 册
２０ ０ ２年
第２ ９卷 、 １ 第 期
０ ６ 单 细胞 凝胶 电泳 技术 在 环境 生物 监测 中的应用 ０
邱志群
（ 三 军 医 天 学环 境 卫 生 学教 研 室 ． 第 重庆 ４ ０３ ） ００８
摘要 ： 单ｌ 胞凝胶电洙技术是一种快 速 、 町 灵敏 的检 测细胞 Ｄ Ａ损伤与 修复 的方法 。本 文简述其原 理 与发 Ｎ 展， 并总结其 在环境生物监涮 中的应用现状。 关键词 ： 单细胞凝胶 电泳 ；Ｄ Ａ损伤 ； Ｎ 环境监测
单细胞凝胶电泳试验
（一）原理单细胞凝胶电泳试验（，）是近年来经过不断完善逐步发展起来地一种快速检测单细胞水平损伤地新技术.文档来自于网络搜索有核细胞地分子量很大，超螺旋结构附着在核基质中，分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液地作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内地、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核仍保持缠绕地环区附着在剩余地核骨架上，并留在原位.如果细胞未受损伤，电泳时，核因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形地荧光团，无拖尾现象.若细胞受损，在中性电泳液（）中，核仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响双螺旋大分子地连续性.只有当双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星.如果在碱性电泳液（>）中，先是双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂地碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核向阳性迁移，形成拖尾.细胞受损愈重，产生地断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移地量也就越多，迁移地距离越长，表现为尾长地增加和尾部荧光强度地增强.因此，通过测定迁移部分地光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞地损伤程度.文档来自于网络搜索（二）仪器．全磨砂载玻片．号盖玻片．微量吸管和吸头．冰盒．电泳仪．荧光显微镜（三）试剂．正常熔点及低熔点琼脂糖.．细胞裂解液：，，，％肌氨酸钠，用调值到.用前加％和％.文档来自于网络搜索．碱性电泳液：，调到.．缓冲液（）.．荧光染料：µ地溴乙锭，也可用µ地吖啶橙或µ地碘丙锭等.（四）方法.制备细胞悬液单细胞来自人、动物(小鼠、大鼠、狗、鱼、鸡等)和植物地组织或培养地细胞系，或从活体组织分离出地原代细胞等.动物体内测试可以根据靶器官适当选择有针对性地原代细胞进行测试.选择合适地培养基和缓冲液，分离纯化制成单细胞悬液，用台盼蓝法测定细胞存活率>，细胞密度为(～)×备用.文档来自于网络搜索. 凝胶制片为了加强凝胶对玻片地附着力，在载玻片上先铺一基底层：在磨砂面上滴加℃水浴后地％～％正常熔点琼脂糖µ.然后再铺胶层.第层：取密度为×地细胞悬液，以体积比为：地比例与预热到℃地％低熔点琼脂糖混匀，取µ加到第层胶上，铺匀凝固；第层：以％低熔点琼脂糖覆盖中层细胞，这样制成细胞“三明治”. 文档来自于网络搜索.细胞裂解将细胞“三明治”载玻片浸入新配制地预冷℃地裂解液中，保持℃ .解旋细胞裂解后，将载玻片置于水平电泳槽内，用新配制地碱性电泳液盖过胶面约～，加盖避光，置于℃～.使充分解旋.碱性条件下（>）可使展开、解旋为单链，碱性易变性区段() 变为单链断片( ) .文档来自于网络搜索.电泳解旋结束后，通电电泳.电泳条件为和，电泳～.或按～确定电压.最适条件实验者可自行选择.最好能使阴性对照有部分细胞出现短拖尾，以保证试验有足够地敏感性并减少实验室间差异.文档来自于网络搜索.中和与染色电泳后取出载玻片，在缓冲液（）中浸没或漂洗次，每次.每张胶板上滴加～µ荧光染色剂，后用蒸馏水洗涤.以上各步骤应在黄或红光下操作.中和后地凝胶片应在内染色，以免过多扩散.否则应将之浸入无水乙醇或无水甲醇中脱水左右，或在室温中晾干.对于干燥地凝胶片，使用中性缓冲地甲醛处理数分钟，将有利于长期保存.文档来自于网络搜索.结果观察结果观察有肉眼观察测量和图像分析两种方式.在荧光显微镜下，观察单细胞电泳图像(放大～倍)，每片记数～个细胞，每个剂量组检查个细胞.无损伤地细胞表现为一圆形荧光细胞核.受损地细胞所产生地断片游动移出细胞核之外，向阳极伸延而形成“慧头”带“慧尾”地慧星现象.文档来自于网络搜索镜下观察时，首先应记录出现拖尾地细胞数，计算拖尾细胞率.同时用目镜测量拖尾细胞地尾长，统计各试验（剂量）组地平均尾长.尾长是指断片从其主核向电泳正极迁移地距离，而不同地实验室尾长测定方法有所不同.但并不妨碍将各剂量组平均尾长与阴性对照组进行比较.文档来自于网络搜索图象分析需有相应地设备和专门地分析软件.使用电脑逐个对细胞进行图像分析.应用图像分析系统可得到更多地分析参数.目前主要观察指标有尾长（）、慧尾地百分含量、尾距（）、尾块( )和尾惯量（）等.尾长( )即迁移地长度，在低损伤剂量范围内与损伤呈线性关系；尾矩是尾长与慧尾百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾块( )即彗星尾部分散地大小不一地断片组成，与损伤程度有关；尾惯量是与每个尾块地面积、平均荧光强度、在轴上与彗核中心距离有关地综合性指标.目前通常选用迁移细胞率、尾长、尾矩作为检测指标.文档来自于网络搜索目前，国外彗星电脑分析软件主要有英国公司地、美国公司地()、德国公司地分析系统、捷克公司地彗星图像分析系统等，这些软件能定量测定尾部长度、尾部面积、尾部力矩、尾部力矩臂、尾部力矩惯性、细胞密集程度、尾部地百分比、碎片等.但这些软件均需与其相应地仪器设备配套使用，价格十分昂贵.国内也正在开发一些分析系统.文档来自于网络搜索除了昂贵地商业软件外，也有一些免费地彗星分析软件.如等所设计地分析软件( ) 能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部含量、尾矩等多项参数. 等在地基础上研制了另一软件()，该软件可在多种硬件及软件平台上运行，所测量地彗星参数中增加了尾矩，而且用户界面更友好.这个免费软件地一个特点是，它们地源代码是公开地，人们可以看到每一个彗星参数地运算方法和编写程序.因此，软件使用者可以根据实验目地地不同来改变这些参数地运算方法和计算程序，从而建立一个新地测量遗传损伤地参数.这些源代码文件很简单，可以自行改写，以便使之适用于分析要求，如计算试验菌落数以及电泳凝胶地分析等.年建立了免费下载系统，其网址为：和.近年来使用较多地国外免费分析软件见以下网址：；文档来自于网络搜索.随着彗星试验地发展，在资源共享地网络空间里，会有更完善更方便地彗星分析软件出现.文档来自于网络搜索（五）注意事项虽然具有简便、快速等特点，但在整个实验过程中可能会受到诸多因素地影响而难以得到理想地实验结果.下面是几点注意事项..单细胞悬浮液地制备：最好将细胞数目调至约×个.如果细胞数目过高，位于凝胶不同层面地细胞可能会发生相互重叠，难以对其结果进行分析；如果细胞数目过低，则很难对实验结果进行统计学分析.文档来自于网络搜索.制片：目前制片地方法主要有三种:“三明治”凝胶、双层凝胶和单层凝胶.制片总地原则是: 获得牢固稳定凝胶地同时，避免额外地损伤与修复.文档来自于网络搜索.电泳条件：一般选用低电压和短时间.电压过高、电泳时间过长虽然能够提高检测地灵敏度，但也会使正常地细胞形成拖尾而出现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短，受损细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果.文档来自于网络搜索.实验条件：整个实验过程需在低温(约℃) 和暗光下进行，避免额外地损伤和修复，防止假阳性和假阴性结果地产生.文档来自于网络搜索.与凋亡细胞断片地区分：由于试验剂量过大或细胞保存不当及某些不适地试验条件地影响，会出现细胞坏死和凋亡，坏死和凋亡细胞会产生大量断片，也会在电泳以后出现拖尾.由于它们与常见断裂剂诱导地损伤在形成机制、生物学和毒理学上地意义迥然不同，应对它们进行区分，排除对实验结果地干扰.在碱性彗星试验中，凋亡细胞与普通链断裂损伤细胞地差异主要是：①在彗星形态上，凋亡细胞地断片彗星头很小，头长不超过µ，仅由核内不能裂解地与蛋白质框架相连地片段组成，亮度高，慧尾近似椭圆形，纵径与横径地比值小，彗星头与慧尾之间往往有一分离带.而普通链断裂，彗星头直径一般都大于µ，尾纵径明显大于横径，同时彗星头与慧尾之间没有明显界限，因为一部分慧尾是由单个链断端地延伸形成，它地另一端仍与主核相连.②无论在低剂量组还是在高剂量组，凋亡细胞地断片形态基本一致，尾长也基本相同，其剂量反应关系表现为凋亡指数增加，而不是尾长增加.而链断裂损伤地剂量反应关系表现为彗星尾长地增加.文档来自于网络搜索（沈孝兵，浦跃朴）。
彗星分析实验：单细胞凝胶电泳
实验步骤
6. 中和、染色
– 将载玻片置于大平皿中，用中和液中和2～3次， 4℃，每次 15min
– 用滤纸将缓冲液吸干 – 每凝胶滴加100 μl AO, 染色20min （避光） ； – 将玻片在蒸馏水中漂洗（避光）。
实验步骤
7. 观察、拍照和分析：
– 置荧光显微镜下，拍照 – 用专用的软件进行分析。
彗星的测量
• 尾长，彗星头部中心到尾部最远端的距离。
– 尾长只在相对低的损伤水平增加，随后损伤剂 量增加时，尾部光密度增加，而尾长不变
彗星的测量
• 头尾光密度比，通常以尾部DNA量占全部 DNA量的百分比表示。
– 与损伤频率成线性关系，受阈值设定的影响较 小，并在最大范围内分辨损伤（理论上，尾部 DNA从0%-100%）
基本原理
• 若细胞受损，在碱性电泳液（pH>13）中， DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断 裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时 断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成 拖尾。
基本原理
• 细胞核DNA 受损伤越严重，产生的断链就越多， 片段也越小，电泳表现为尾长增加和尾部荧光 增强。
• 因此，通过测定DNA 迁移部分的光密度或迁移 长度就可定量测定单个细胞损伤的程度。
玻片上使胶均匀展开，室温固化10min
实验步骤
2. 制片：第2 层凝胶的制备 • 将细胞与0.7%LMA 混合均匀（体积比1/9） • 迅速将适量（100～200μl）含细胞的LMA
滴到第1 层琼脂糖上，室温固化10min
实验步骤
3. 细胞裂解： • 将玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜
配置的细胞裂解液。4℃下避光裂解2-3h； • 取出载玻片用PBS漂洗2次（要求动作轻柔，
单细胞凝胶电泳实验流程和条件优化
套适合 海洋鱼类 的单 细胞 凝胶 电泳 实验提供 了借鉴 。
关 键 词 ：镉 ；大弹涂 鱼；外周 血细胞 ；单细胞凝胶 电泳；优化
中 图分类号 ：￥ １ ；Ｇ ２ ． １ ９ ７ ４ ４ ３
文献标志码 ：Ｂ
文章 编号 ：１７ ４５ （０ ０ ０ ６ ２— ５ ０ ２ １ ）３—０ ３ ０ ０ ４— ３
ｎｒｓｒｓｉｄ ｃｄ ｂ ａ ｍｉｍ ｈｏ ｄ ．Ｒ ｓｌ ｈ ｗ ｄ ｉ Ｗｉ ｅ ｅ ｉ ｎ ｅ＇ ｂ ｆ ｒ ａ ｄ ｉｈ— ｔｐ ｈ ｐ ｇ ｌ ｔｏ ｓ ｄｕ ｉｏｔ ｎ ｕ ｅ ｙｃｄ ｕ ｃ ｌｒ ｅ ｅ ｕｔ ｓ ｏ ｅ ｔ ｌ ｂ ￣ ｒｗ ｔ Ｒ ｇ ｒ ｕ ｅ ，ｓｎ ｗ ｃ ｉ ｉ ｓ ｌ ｓ ｈｉ ｓ ｙ ｓｏ ｅｍｅｈ ｄ， ｏ ｉ ｅ ｍ
陈 寅儿 ，徐 镇
３５１） １２ １ （ 宁波大学生命科学 与生物工程学 院，浙 江 宁波
摘要 ：应 用实验 室综合条件 ，对镉 致大弹涂鱼外周血 细胞 Ｄ Ａ损伤的单 细胞 凝胶 电泳技术 电泳 实验条件进行优化 。结果表 Ｎ 明 ，选 用 Ｒｎｅ＇液缓 冲液、“ ｉｇｒ ｓ 三明治 ” 式铺胶 法 、肌氨酸钠裂 解液 、４ ｉ ０ ｍ ｎ解旋 时 间，实验 效果较好 。 实验 结果 对建 立一
１ 引 言
单细 胞 凝 胶 电泳 （ｉｇ ｅ ｅ Ｅｅｔｐ ｏｅ Ｓｎｌ Ｃｌ Ｇ ｌ ｌｅｏｈｒ— ｅ ｌ ｒ
沿 海 ，采 集后 置 于实 验室水 族 箱 内 ，清 洁海 水 暂养
一
周 后进 行染 毒实 验 。
２ ２ 主要 试剂 与仪 器 ．
ｓ ，Ｓ Ｇ ） ｉ Ｃ Ｅ ，又称彗星实验 （ ｏ ｅ Ａ ｓ ） ｓ Ｃ ｍ ｔ ｓ ｙ 或彗星分 ａ 析 ，起 源于 １７ ９８年 Ｒ ｄ—ｂｒ ｙ ｅｇ等报 道 的无 电泳单 细 胞凝胶分析技术…。该技术能够灵敏地检测单个细 胞水平 的 Ｄ Ａ链 断裂 ，具有所 需细 胞量 少 、应用 面 Ｎ 广 、敏感性强 等 优 点 ｊ 国 内外 不 少 学 者将 其 应 。 用于环境理化因素的遗传毒性 、Ｄ Ａ的损伤与修复 Ｎ 机理 以及生物 监测 等 领域 。镉是 一 种 广泛 存在 的有
单细胞凝胶电泳检测单细胞DNA损伤
胞 ） １：３的 比例 与 ０ ５ 低 熔 点 凝 胶 混 合 。待 第 一 层 胶 按 ．％
凝 固 （ 整 ， 光 泽 ） 揭 去 盖 片 ， 加 ７ ， ． 低 熔 点 平 有 后 滴 ５／ ０ ５ Ｌ 凝 胶 与 细 胞 悬 液 混 合 液 ， 盖 盖 玻 片 ， 加 ４ Ｃ固 化 １ ｎ 第 ０ｍｉ； 三 层 胶 的 制 备 ： 去 盖 玻 片 再 滴 加 ｌ０ ／ 不 含 细 胞 的 揭 １ ＊ Ｌ
杨 建 一 彭 芸 李 莉
遗 传 毒 理 学 家 主 要 关 注 的 三 大 遗 传 学 损 伤 ， 基 因 突 即 变 、 色 体 畸 变 及 染 色 体 数 目改 变 。这 些 损 伤 多 因 Ｄ 染 ＮＡ 受 损 所 致 ， 本 质 是 相 同 的 ， 别 在 于 其 损 伤 的 程 度 ＿ 。 由 此 其 区 １ ］ Ｄ ＮＡ 损 伤 与 修 复 就 成 为 生 物 医 学 领 域 特 别 是 遗 传 毒 理 学 及 肿 瘤学 等 领 域 的核 心 内容 之 一 。 传 统 的 毒 理 学 检 测 终 点 是 组 织 病 理 学 改 变 ， 程 繁 琐 且 不 理 想 。 迄 今 为 止 检 测 过 Ｄ ＮＡ 损 伤 与 修 复 最 敏 感 的 终 点 是 测 量 Ｄ ＮＡ 单 链 断 裂 。 本 文 所 论 述 的 单 细 胞 凝 胶 电 泳 （ ｉｇｅ ｅ ｇ ｌ ｓ ｌ ｎ ｃｌ ｅ ｌ ｅ ｃｒ ｐ ｏ ｅｉ ａｓｙＳ ＧＥ） 又 称 彗 星 实 验 （ｏ ｔａｓｙ ｌ ｔｏ ｈ ｒｓｓ ｓａ ， Ｃ ｅ ， ｃｍｅ ｓａ ） 或 微 凝 胶 电 泳 （ ｃｏ ｅ ｅ ｃｒｐ ｏｅｉ， Ｇ ， 是 一 种 ｍｉ ｇ ｌ ｌ ｔｏ ｈ ｒｓ Ｍ Ｅ） 正 ｒ ｅ ｓ 在 单 细 胞 水 平 上 检 测 有 核 细 胞 ＤＮＡ 断 裂 的 一 项 新 技 术 。 自 Ｏ ｔｎ ｓｌ ｇ等 成 功 应 用 以 来 经 不 断 改 进 ， ｉ 已成 为 一 种 快 速 、 敏 、 便 的 检 测 ＤＮＡ 损 伤 的方 法 。 灵 简
单细胞凝胶电泳试验操作步骤
一、实验准备工作，要在实验前一天完成。
1.镀膜：将载片竖直放入盛有1%常熔点琼脂糖的立式染缸中，静置1 min后缓慢取出，并置于立式染缸中，在37 ℃烘箱中烤膜12 h（防尘）。
2.配制细胞裂解储备液：分别按称量146.25 g氯化钠，37.224g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），1.2114 g三羟甲基氨基甲烷，肌氨酸钠（10.124 g），上述质量的四种药品于烧杯中依次溶解，溶解时由于肌氨酸钠容易起泡，故最后加入，由于Na2EDTA难溶可适当加热进行溶解，同时可用磁力搅拌器进行搅拌，溶解后用容量瓶定容至1000 mL，将配好的溶液放入冰箱4 ℃保存。
）3.配置磷酸缓冲液（PBS、pH=6.8）：KH2PO44.5 g、Na2HPO4·12H2O 11.81 g、H2O 1000 mL，混合后置4 ℃备用。
二、实验工作，要细心操作。
1.构槽：用市售的透明胶带（两层）在镀上正常熔点琼脂糖膜的载玻片中央构建一个长方形小槽，或者在一张载玻片上搭两个槽。
构建好后放回载玻片架并用一次性手套套住（防尘）。
2.取细胞裂解储备液、二甲亚砜、TritonX-100按体积比89：10：1量于锥形瓶中混匀（TritonX-100粘性大，用枪头吸取时手要慢慢放开，将液体打入锥形瓶中，然后要反复吹打，尽量把枪头壁上的液体打入锥形瓶中），然后用NaOH调pH=10！！！4 ℃静置,放入冰箱，进行温度平衡。
3.电泳缓冲液：称取0.3722 gNa2EDTA，12.0000 gNaOH定容至1L，pH=13，室温保存。
4.将水浴锅打开，把温度调到65 ℃。
5.骨髓细胞悬液制备：分离股骨，PBS液清洗，打开骨髓腔，取4 ℃PBS液4 mL反复冲洗骨髓，吸取1.5~2 mL所得混合液，4 ℃、3000 r/min离心1 min弃上清；加4 ℃PBS 液1 mL，轻柔混匀，1500 r/min离心5 min弃上清；加入4 ℃PBS液500 µL轻柔混匀，置4 ℃待用，若离心后发现骨髓细胞较少可以适当延长3000 r/min离心时间。
单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及应用
六、未来展望
预计在未来，DNA凝胶电泳分析系统将会与更多前沿的生物技术相结合，如纳 米技术、微流体技术等，实现更高效的分离和检测。同时，随着精准医疗和基 因组学的发展，凝胶电泳将在疾病诊断和治疗、个性化医疗等方面发挥重要作 用。此外，随着环境科学和生态学的发展，凝胶电泳也将被广泛应用于环境 DNA样品的分析和研究。
五、结论
单细胞凝胶电泳技术是一种灵敏且实用的工具，可用于检测单个细胞的DNA损 伤。它已经广泛应用于环境科学、放射医学和遗传学等领域，为研究DNA损伤 和修复提供了重要的手段。尽管存在一些挑战和问题，但随着技术的不断发展 和完善，相信单细胞凝胶电泳技术在未来的研究中将发挥更大的作用。
参考内容二
方法
单细胞凝胶电泳的主要步骤包括收集单个细胞、细胞裂解、凝胶电泳和染色。 该技术的原理是基于DNA在凝胶中的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关。 当DNA分子受到损伤时，其迁移速率会受到影响，从而可以通过电泳图像进行 观察和定量分析。
1、收集单个细胞：采用显微操作、流式细胞术或其他细胞分离技术收集单个 细胞。
单细胞凝胶电泳检测DNA损 伤的方法及应用
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）是一种用于 检测单个细胞内DNA损伤的方法。该技术通过将单个细胞裂解后在凝胶上进行 电泳，可以检测到DNA的片段化程度和总DNA量的变化，从而评估细胞内DNA的 损伤程度。本次演示将介绍单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及其在各个领 域的应用，并通过具体案例进行分析和说明。
2、实验过程：收集单个白细胞或睾丸细胞，裂解后将DNA样本在凝胶上进行电 泳。通过观察电泳图像，发现经过辐射处理的样品中出现了明显的DNA片段化 现象，而对照样品则没有。同时，通过定量分析软件对电泳图像进行半定量分 析，比较不同样本中DNA片段化和总DNA量的变化情况。
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1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件；旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。
低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。
凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。
我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。
注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。
2、中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例）1) 淋巴细胞的提取①取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。
②取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。
③重复洗涤细胞两次。
2) 琼脂糖玻片的制备①制好微型电泳槽。
②使用两层凝胶法,第一层为100μl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶, 第二层为75μl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。
3) 细胞裂解、电泳①好的玻片浸入新配的预冷的(4ºC)中性裂解液中裂解1.5h。
②取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。
③将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。
4) 染色用溴化乙啶(2μg/ml)染色。
用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。
5)读片和分析①用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。
②用CASP软件分析系统分析慧星图像。
3、biomed96 ：lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。
铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul 0.5％低熔点胶。
裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解1小时解旋液：EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。
电泳40分钟。
染色：PI 50ug/ml染色15分钟。
结果是什么都看不到，好像一点都没染色。
lq6688：首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解液ph10，所以检测结果应是单链断裂。
其次，您用的是三层三明治铺胶法，目前多数彗星试验已经少用此法，而是双层法甚至单层灌胶，有人担心双层或单层铺胶的脱胶问题，只要在凝胶的承载载体上做点文章，就解决了！我用的是双层铺胶法，我不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干，是为了防治脱胶吗？我建议您采用双层法（卖瓜人不说自己的瓜苦，呵呵），这样在实验操作上可以节省时间，不必担心脱胶问题，我做了一年多了，自认为很成熟了，从来没有出现脱胶问题，（我不知道您用的凝胶承载体是什么？）。
第三，解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。
第四，因为我用的EB染色，2ug/ml，效果很好，您用PI染色，我可能没有发言权，因为我不知道PI 的荧光激发光波长是多少，是否您的荧光条件不对？可以查查文献，这一点您对PI应该比我更了解吧。
第五，您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时。
第六，我不知道您用的什么细胞，50000个细胞加入100ul0.5％低熔点胶，是不是细胞太多了，含细胞层的凝胶如果细胞密度过大，即使做出结果，彗星图像过于密集，头尾连接互相影响，无法分析。
一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了。
还有一点，差点忘了，我刚刚做的时候，不会用荧光显微镜，大开了自然光源，其实荧光激发根本不用开自然光源，画蛇添足。
只要荧光光路通畅了，物镜会出现特殊的荧光，只要波片上有荧光染色的细胞，它肯定跑不了！biomed96：非常感谢lq6688 老师，您的建议很有用。
1.我用的是HepG2细胞，我是看了一篇文献，上面说最大可以达到50000个细胞，因为第一次做的时候一个细胞都没见到，我以为是细胞数过少，所以我就加大细胞：（根据您的指导，应该肯定可以排除这个可能性了。
2.关于电泳时间，我也是参考文献的，同时该篇文献上建议的电泳条件为15V 400mA,但我们实验室的电泳仪电流上不去，只能到100mA，不过参照您的成功经验，这样的条件已经是可以了的吧？3.我烤胶也是按照同一篇文献的：（主要也是为了防止脱胶的问题。
因为我开始也试过不烤胶，裂解后捞起来时确实出现了脱胶的问题，所以还得向您请教一下，每层胶铺上以后时怎么处理的？另外，我用的载体是普通的显微镜观察用的载玻片，不知道行不行？4.关于染色的问题，由于我们实验室这个实验做的不多，所以不敢用EB，怕污染了荧光显微镜，根据文献建议的几种燃料，我选择了PI，不过我现在想可能是浓度小了，昨天我上流式用PI单染时，用到了1mg/ml 出来结果很漂亮，下面我也会考虑加到PI浓度试一下。
不过也可能正如您的提示，我的裂解时间过短，我会首先拉长裂解时间看看的。
另外，我配的各种溶液成分是对的吧？5.关于单链，双链断裂的问题，因为我正是想通过这个实验看看我的样品对DNA的损伤情况，或者是说究竟有无损伤？（不知道我这要设计合不合理？敬请指正）如果这样可以的话，是不是我要分别做中性和碱性的实验，再进行判断？6.我观察细胞的时候是把自然光关掉的，所以应该不是这个问题。
关于数据分析的问题，是不是我用数码相机拍下了照片就可用CASP了？如果是就太好了，因为我正想去外边联系成像系统和分析软件呢。
所以还麻烦您提供下载的链接。
再次感谢lq6688 老师，希望您能继续指导我的实验。
lq6688：SCGE的实验条件尚缺乏标准化，去年曾在美国召开专门会议讨论SCGE的标准化，这都是有文献可查的。
您的列解液应该不是问题，只要能够把细胞膜和核膜列解就可以了，1%TritonX-100 应该是临用时加的吧，另外我还加了DMSO，也是临用时加的。
我觉得您完全可以作中性和碱性两种，这样您的结果就更完美了。
三层铺胶法在铺胶后都要加盖片的，目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶，我是将普通波片稍加改良，在波片上人为作出两个小电泳槽，是用很窄的玻璃条封上的，这就看你的功夫了，不过这可是一劳永逸的事，不会脱胶。
作出的彗星图像用数码相机拍摄后转入计算机，然后就可以用CASP了，我想你的数码相机已经准备好了吧，我用的是NIKON 4500，可以和荧光显微镜配套的。
注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单。
目前国外有很多SCGE的自动成像分析系统，不过，价格也不菲，还是自己用相机拍的好。
另外，我还是为你担心一个问题，100ul胶含50000个细胞，出来的彗星图像可能密度太大，每个图像都互相影响，将来无法用CASP分析，除非您的胶铺的很薄，不过，就我的经验，不会很薄吧。
下面就是CASP的链接，可以免费下载，使用也很简单，看看说明就可以了，祝你成功！4、qyt：我现在想问的是1.彗星试验的重复性好吗？2.不太明白彗星和流式的组合可以检测到什么？3.我做的是碱性，是不是一定加肌氨酸钠，因为不是很好溶解？4.裂解液，电泳液，中和液有没有必要新鲜配置，因为我的裂解液在冰箱中放置3天后会有结晶，但是加热后会溶解5.我也是按照三层胶铺的，不过每次总是会有脱胶的现象，搞得挺难受的。
6.验证试验的阳性对照应该选什么啊？7.不同的细胞的裂解时间应该不同吧，想问的是假如想评价药物，（兽药）应该选什么细胞比较合适啊？我现在做的是vero，不过是看了别人的文献决定的，想听听大家的意见很多问题，3Qlq6688：qyt战友，就我的经验，SCGE的重复性还是不错的，但要做到所有的试剂要同批配制，存放时间不要过长，如我的试验，宁愿累几天，也不要把战线拉的太长，前期准备工作可以按部就班，如（肿瘤接种、给药等），一旦用SCGE的时候，一定在较短时间完成，记得我最累的一天从8点上班，到晚上11点半才回家，中间利用一点时间吃饭。
因为裂解液时间长了会结晶，（浓度太高了），正如您所说的。
加热磁力搅拌器搅拌后，还可以溶解，但是，还是不宜久存的。
电泳液和PBS相对好一点。
呵呵，SCGE是一个比较年轻的方法，潜力还没有完全发掘出来，与其它技术结合是必然趋势，就拿血液病来说吧，CD分子已经发现了很多了吧，给药后，用某种药物处理，然后用流式把细胞提取出来，再做SCGE，结果可以看到哪种细胞对该药物敏感，有助于发现该药对哪类白血病敏感裂解液药新鲜配制，SCGE中最难配的是裂解液，每次做的时候都要最先配制，而且用加热磁力搅拌器不停搅拌，同时就可以干别的，完全溶解后再放入冰箱预冷。
您的脱胶问题和biomed96 战友一样，可以该一下凝胶载体，磨砂玻璃或自制微电泳槽，我用的自制微电泳槽，其实很简单，从不脱胶，另外SCGE 最好在避光条件下操作，避免额外DNA损伤。
阴性对照不必说了，阳性对照可以旋已知的对所研究药物（或同类药物）极度敏感的细胞，如国外文献报道，用共济失调－毛细血管扩张症患者的淋巴细胞做阳性对照观察辐射或UV对正常人淋巴细胞DNA的损伤作用。
不同细胞到底裂解多长时间我还没有看见相关文献，但有文献报道，一般裂解1.5～2小时即可。
您用的vero我不知道是什么药物？所以我不便发表意见，不过我觉得先用淋巴细胞比较合适。
当然还要看药物的靶细胞是什么。
qyt：谢谢回答，你那是不是有comet－FISH的资料啊，你能大概给我解释一下不？比如说方向，检测的目标，还有啊我做的是一个兽药的毒性评价，不象你们做的是人医的，不象你们那么复杂，呵呵不过对我的水平也就比较麻烦了。