实验三超氧化物歧化酶SOD的提取及活性测定

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定

氮蓝四唑法

一、原理

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：

o 2.-+H O 2

22+O H ＋

反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。据此可计算出酶活性的大小。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

植物器官(花瓣、叶片等)

(二)仪器设备

冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux 或Lx)

(三)试剂

(1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。

(2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至100mL 。

(3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至100mL ，避光保存。

(4)100μmol/LEDTA -Na 2溶液：称取0.03721g EDTA-Na 2，用磷酸缓冲液定溶1000mL 。

超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O

2

.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等

是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（V

C ）、V

E

和还原型谷胱甘肽（GSH）

等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平

和O

2.－、H

2

O

2

、OH. 和O

2

等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。

自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

超氧自由基（O

2

.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生

SOD酶活力测定实验

摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩

等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。

一、前言：

超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。在微生物中主存于需氧菌。SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。

自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。SOD作为治因而受到医药界的关注。目前中国国内已进入临床试验阶段。

本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

SOD酶的提取及测定

邻苯三酚自氧化法原理：
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2 - （超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物（红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～ 45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在 4min的范围内，中间物在325nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2 和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计算出SOD的酶活性。
30s
60s
90s
120s
150s
180s
210s
3.2
SOD酶活力计算：
(酶活力单位定义:在一定条件下,每1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50 %时的酶量定义为一个活力单位。)
清
场
1.各组将实验台清理好，实验用具清洗干净，恢复实验开始时的状态。 2.派人清扫实验室。
邻苯三酚的自氧化曲线 (25℃ pH8.2Tris-HCL缓冲液4.5mL 45mL邻苯三酚溶液0.01mL)
四.实验操作
(一) SOD的提取
1. 取当年大豆适量,冷水浸泡24h,沥干，加冰冻的pH7.8, 5mmol/L磷酸缓冲液适量，用高速组织捣碎机捣碎。 2. 用高速冷冻离心机以8000rpm离心除去固型物（需4—5次，每次15min）,上清液即SOD 酶液。

超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定、同工酶电泳

超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳

实验⼆猪⾎中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化

及活⼒测定、同⼯酶电泳

⼀、实验原理

超氧化物岐化酶SOD⼴泛存在于⽣物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的⾦属类酶。它作为⽣物体内重要的⾃由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离⼦，在防御⽣物体氧化损伤⽅⾯起着重要作⽤。

SOD是⼀种酸性蛋⽩，对热、pH和蛋⽩酶的⽔解较⼀般酶稳定。根据⾦属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见是(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中。CuZn-S0D酶蛋⽩的分⼦量约为3.2×104，每个酶分⼦由2个亚基通过⾮共价键的疏⽔基相互作⽤缔合成⼆聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原⼦各⼀个，活性中⼼的核⼼是铜。SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之⼀，可以直接清除过量的超氧⾃由基，阻⽌机体的过氧化，对机体有较⾼的防护作⽤及保健价值。

本实验采⽤有机溶剂沉淀法以新鲜猪⾎为原料，从中提取SOD硬进⾏纯化。酶活⼒测定可⽤以下⽅法：黄嘌呤氧化酶法、细胞⾊素C法、肾上腺素⾃氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚⾃氧化法等。⽽该实验SOD酶活性采⽤邻苯三酚⾃氧化法测定。酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%时的酶量定义为⼀个活⼒单位。SOD同⼯酶奠定采⽤不连续聚丙烯酰胺

-的作⽤，因此，电泳分离SOD后，凝凝胶电泳技术分离鉴定。⽤“负”显⾊法显⽰。由于SOD能够抑制O

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定

氮蓝四唑法

一、原理

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：

o 2.-+H O 2

22+O H ＋

反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。据此可计算出酶活性的大小。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

植物器官(花瓣、叶片等)

(二)仪器设备

冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux 或Lx)

(三)试剂

(1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。

(2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至100mL 。

(3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至100mL ，避光保存。

(4)100μmol/LEDTA -Na 2溶液：称取0.03721g EDTA-Na 2，用磷酸缓冲液定溶1000mL 。

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法

超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法

一、试剂

1. 0.1mol/L HCl

2. 10mmol/L HCl

3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.

4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。

5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.

二、仪器

1. 紫外分光光度计

2. 酸度计

3. 恒温水浴锅

三、操作方法

1.邻苯三酚自氧化速率测定

在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。

%1004

min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定

将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。

活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。

样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u

超氧化物歧化酶活性的测定

植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法

【实验目的】

1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。

2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。【实验原理】

超氧化物歧化酶（SOD ）普遍存在于动植物与微生物体内。SOD 是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。SOD 能够清除超氧阴离子自由基（O 2—），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。

超氧阴离子自由基（O 2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H 2O 2和O 2。生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O ：

2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O

超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD 活性。本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。当加入NBT 后，在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大光吸收。

当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2—，而抑制NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。

超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

胞外抗氧化酶类酶活力的测定

原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。

参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。

邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力

酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。

单位菌体SOD酶活力（U/g）=

1

-

50%

A A

V N V A

V W

∆∆

⨯⨯⨯∆

⨯⨯

邻菌

邻

A∆

邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆

菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化

时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。

SOD酶活性测定方法

SOD（超氧化物歧化酶）是一种重要的抗氧化酶，通过催化O2.-的自

动氧化为O2和H2O2来清除有害氧自由基。SOD的活性能够反映生物体内

清除氧自由基的能力，因此SOD活性的测定对于研究氧自由基相关疾病以

及抗氧化剂的评价具有重要意义。以下是目前常用的几种SOD活性的测定

方法：

1. Nitroblue tetrazolium (NBT)法：这是最早用于测定SOD活性的

方法之一、该方法基于超氧自由基能够氧化NBT成为紫色的甲胺蓝（blue formazan）。SOD能够阻止NBT的氧化过程，从而减少blue formazan的

产生。测定时，试样中的NBT和蛋白质混合后加入酶底物，通过测定产生

的blue formazan的吸光度来评估SOD的活性。

2. epinephrine autoxidation法：该方法基于SOD能够催化抑制肾

上腺素自动氧化反应，从而测定其活性。肾上腺素在氧气存在下会自动氧

化生成可见光吸收的产物，而SOD的存在能够阻止这个自动氧化过程，减

少可见光吸收的产生。通过测定反应体系中可见光吸收的变化来评估SOD

的活性。

3. Pyrogallol autoxidation法：该方法与上述方法类似，基于SOD

能够催化抑制邻二氧苯酚（pyrogallol）自动氧化反应，从而测定其活性。邻二氧苯酚在氧气存在下会自动氧化生成氧的产物，而SOD的存在能够阻

止这个自动氧化过程。通过测定反应体系中氧的产生速率或者邻二氧苯酚

消耗速率来评估SOD的活性。

4. Xanthine oxidase法：该方法基于SOD能够催化脲酶氧化邻位双

玉米超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定

- · O

2 -

· O 2 + + 2H + H 2O 2 + O 2 SOD 玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定

一、目的

1．通过对玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质和超滤浓缩的方法和原理。

2．掌握测定超氧化物歧化酶（SOD ）的活力和比活力的方法。 3．掌握分级盐析沉淀的方法和原理，以及透析的方法和原理。

二、原理

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，简称SOD ），它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：Cu,Zn-SOD ，Mn-SOD ，Fe-SOD 。SOD 催化如下反应：

在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种病症，如炎症、脑外伤、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等，对生物体有保护作用。在玉米中，SOD 主要存在于胚芽中，当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后，以中性盐沉降其蛋白质部分，SOD 就存在于沉淀中，但其中有许多杂蛋白，因此在盐析时先用40%（NH 4）2SO 4去除杂蛋白部分，再用90%（NH 4）2SO 4饱和上清液，经过一定时间后，再将盐析液离心，取其沉淀进行透析，一定时间后，则其中的SOD 成分即被浓缩分离。

超滤也是一种蛋白质浓缩方法，其工作原理是运用液压迫使溶质透过膜，并按溶质分子量、形状、大小的差异，把大溶质分子阻留在膜的一侧，而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧，使大小溶质分子得到分离。利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD 与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离，并去除水份，得到SOD 浓缩液。

超氧化物歧化酶SOD活性测定

完全液培养苗缺素液培养苗完全液培养苗缺素液培养苗七操作步骤将玉米叶片剪细混合均匀称02g用保鲜膜包好放低温冰箱预冻用保鲜膜包好放低温冰箱预冻研磨成匀浆再加入3ml缓冲液研磨均匀后将匀浆液倒入聚乙烯离心管中低温再加入3ml缓冲液研磨均匀后将匀浆液倒入聚乙烯离心管中低温04下4800rpm离心10min上清液即为酶液将上清液倒入小青霉瓶低温下贮存供sod活性测定
玉米苗叶片SOD活性的差异。
三、原理：
三、原理：
依据SOD能抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2.-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
超氧化物歧化酶
(SOD) 活性测定
(NBT法)
一、测定意义二、目的要求三、原理四、仪器设备五、试剂配制六、植物材料七、操作步骤八、结果计算九、注意事项十、思考题
一、意义：
植物正常情况下
细胞内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，自由基水平很低，不会伤害细胞。
植物逆境胁迫下
植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破
九、注意事项:
1.所用试管的玻璃质量要一样。包括厚度、直径、质量等。 2.照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。 3.要多做对照消除日光灯管的光质差异。

超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O

2

.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等

是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（V

C ）、V

E

和还原型谷胱甘肽（GSH）

等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平

和O

2.－、H

2

O

2

、OH. 和O

2

等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。

自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

超氧自由基（O

2

.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生

超氧化物歧化酶SOD提取

1．实验材料：玉米籽粒。

2．试剂：注意配好每一试剂时，应立即转入试剂瓶当中，不要将试剂放在容量瓶当中存放，一定要及时将试剂瓶贴好相应的标签，标明溶液的浓度、pH值、体积、试剂名称、配制时间、配制人。配制时一定要标清，使用时注意不要将其弄掉，这一点将给您带来无比的快捷和方便。在未经老师允许的情况下，不要随意倒掉实验室内的任何药品或试剂。

（1）1％次氯酸钠：用移液管准确吸取4mL次氯酸钠，置于500mL大烧杯中，再用量筒准确量取400mL自来水稀释该次氯酸钠。

（2）提取缓冲液：0.05mol/L磷酸氢二钾—磷酸二氢钾缓冲液，pH7.8。

具体配制方法如下：首先是1mol/L pH7.8的磷酸钾缓冲液母液的配制。

a. 1mol/L KH2PO4溶液：称取13.6g KH2PO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

b. 1mol/L K2HPO4溶液：称取22.8g K2HPO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，可稍加热，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

c. 取5mL a 液与55mL b液混合后，调节pH为7.8，该液即为1mol/L的磷酸钾缓冲液母液。

d. 0.05mol/LpH7.8磷酸钾缓冲液的配制（内含1mmol/L EDTA及0.1% β-巯基乙醇）：称取EDTA·2Na·2H2O 0.372g置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中，用移液管吸取1mL β-巯基乙醇置入该1 000mL 容量瓶中，用50mL量筒量取50mL c液至该1 000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

sod实验报告

SOD实验报告

实验目的：通过测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性，探究不同条件对SOD活性的影响。

实验材料：

1. 超氧化物歧化酶（SOD）提取液

2. 超氧化物歧化酶（SOD）标准品

3. 丙酮

4. 磷酸盐缓冲液

5. 磷酸盐缓冲液-EDTA

6. 碳酸氢钠

7. 氯化铝

8. 硝酸银

9. 氢氧化钠

10. 乙酸钠

11. 乙醇

12. 硫酸

13. 硫酸铵

14. 硫酸钾

15. 氮气

实验步骤：

1. 提取SOD：将植物组织磨碎后加入磷酸盐缓冲液，离心后取上清液，再将上

清液加入磷酸盐缓冲液-EDTA中，再次离心后取上清液即为SOD提取液。

2. 测定SOD活性：将SOD提取液与标准品、丙酮、碳酸氢钠等混合后，通过测定吸光度来测定SOD的活性。

3. 影响因素的实验：分别在不同温度、pH值、金属离子浓度等条件下进行SOD活性的测定。

实验结果：

通过实验发现，SOD的活性受到温度、pH值、金属离子浓度等因素的影响。在适宜的条件下，SOD的活性较高，而在不适宜的条件下，SOD的活性会受到抑制。

实验结论：

SOD在生物体内起着重要的抗氧化作用，其活性受到环境条件的影响。通过对SOD活性的测定，可以更好地了解其在生物体内的作用机制，为进一步研究提供重要的参考依据。

结语：

本实验通过测定SOD的活性，探究了不同条件对SOD活性的影响，为进一步研究SOD的作用机制提供了重要的实验数据。希望本实验能够为相关领域的研究工作提供有益的参考。

动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定

动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理

超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。