生物样品定量分析方法验证指导原则
9012生物样品定量分析方法验证指导原则
中国药典2015年版
9012生物样品定置分析方法验证
指导原则
一、范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守
G L P原则或GC P原则。
二、生物分析方法验证
(一）分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质
在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加人到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。
9012生物样品定量分析方法验证指导原则
9012生物样品定量分析方法验证指导原则9012生物样品定量分析方法验证指导原则是为了确保生物样品定量分析方法的准确性和可靠性而制定的一系列原则和指导。生物样品定量分析方法验证是指通过实验和数据分析，验证该方法能够准确、可靠地定量分析生物样品中目标物质的含量。以下是关于9012生物样品定量分析方法验证指导原则的详细介绍。
1.验证目标：明确验证的目标，即要验证的生物样品定量分析方法和目标物质的含量范围。验证的目标应明确具体，包括检测的目标物质、所用的定量方法和样品类型等。
2.实验设计：合理设计验证实验方案。验证实验应采用相关的生物样品，并根据目标物质的特性选择合适的样品处理方法。实验设计应包括重复次数的确定、正负对照样品的设置和实验步骤的详细描述。
3.准确性：验证方法的准确性是指分析结果与真实值之间的一致性。通过对一定数量的已知浓度样品进行分析，评估方法的准确性。评估指标可包括回收率、偏差等指标。
4.精密度：验证方法的精密度是指同一样品在重复测量条件下，方法重复性的可靠性。通过测量同一样品的重复测量值，评估方法的精密度。评估指标可包括相对标准偏差(RSD)、变异系数等指标。
5.灵敏度：验证方法的灵敏度是指方法对目标物质浓度变化的敏感程度。通过测量不同浓度样品的分析信号，评估方法的灵敏度。评估指标可包括最低检测限、定量限等指标。
6.选择性：验证方法的选择性是指方法对其他干扰物质的响应能力。
通过测量其他相关物质的干扰试验，评估方法的选择性。评估指标可包括
干扰物质的峰检出率、峰分离度等指标。
生物样品定量分析方法验证指导原则
生物样品定量分析方法验证指导原则
1.设计验证计划：验证计划应明确验证的目的、范围和任务，并确定
所需资源和时间。验证计划还应包括验证参数、验证样品数量和测试条件
等详细信息。
2.确定验证参数：验证参数是指确定方法准确性、精密度、线性范围、检测限和选择性等方面的参数。根据具体的分析方法，选择适当的验证参
数进行验证。
3.准确性验证：准确性验证包括回收率、加标回收率和对照品比较等
方法。在准确性验证中，使用已知浓度的标准品或对照品进行分析，并比
较结果与标准值或真实值之间的差异。
4.精密度验证：精密度验证是通过重复测定同一样品，评估方法的精
密度。重复测定应在相同条件下进行，采用适当的统计方法计算结果的精
密度。
5.线性范围验证：线性范围验证涉及不同浓度下的响应与浓度之间的
线性关系。通过分析一系列不同浓度的标准品或对照品，并绘制浓度与响
应之间的曲线，确定方法的线性范围。
6.检测限验证：检测限是方法能够可靠检测到的最低浓度。通过分析
一系列浓度低于检测限的样品，并确定能够可靠检测到的最低浓度。
7.选择性验证：选择性验证是评估方法对目标物和干扰物的选择性。
通过分析不同的样品矩阵或添加干扰物，并验证分析结果是否受到干扰。
8.数据分析：在验证完成后，应进行数据分析和评估。使用适当的统
计方法，计算准确度、精密度和线性范围等参数，并评估分析方法的可行
性和可靠性。
9.结果报告和文件管理：验证的结果应记录并报告。应编写验证报告，包括验证计划、实验结果、数据分析和结论等。还应制定相应的文件管理
措施，以确保验证结果的追溯性。
2015药典生物样品定量分析方法验证指导原则
应该提交标准曲线参数，测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。在方法验证中，至少应该评价3条标准曲线。
校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15%以内，定量下限处应该在±20%内。至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。如果某个校正标样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线应被重新评价，包括回归分析。
应该考察药物代谢物、经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度。在适当情况下，也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。
2. 残留
应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%。如果残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证时 检验并在试验样品分析时应用这些措施，以确保不影响准确度和精密度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品。
6. 精密度
分析方法的精密度描述分析物重复测定的接近程度，定义为测量值的相对标准差（变异系数）。应使用与证明准确度 相同分析批样品的结果，获得在同一批内和不同批间定量下限以及低、中、高浓度质控样品的精密度。
中国药典 版生物样品定量分析方法验证指导原则 草案
生物样品定量分析方法验证指导原则（草案）
1
1. 范围
2
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和3
制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动4
学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和5
记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
6
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实7
际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。8
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。9
应该在相应的生物样品分析中遵守GLP原则或GCP原则。
10
2.生物分析方法验证
11
2.1 分析方法的完整验证
12
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析13
物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每14
个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质15
替代，但要说明理由。
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一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范17
围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液18
中储存和处理全过程中的稳定性。
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有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一20
个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和21
分析的原则适用于所有涉及的分析物。
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对照标准物质
23
在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质24
中国药典2024年版生物样品定量分析方法验证指导原则
一、验证目标和范围
生物样品定量分析方法的验证目标是评估方法的适用性、准确性、精密度、灵敏度、线性范围、选择性、稳定性和测定限等指标。验证的范围应包括常规样品、稳定样品和特殊样品等方面。
二、验证计划和报告
验证计划应包括验证的目的、范围、方法、样品、检测设备和仪器的选择、验证标准和指标的确定、样品的制备与处理、实验设计和统计分析等内容。验证报告应包括验证计划的执行情况，具体的验证结果和分析，以及结论和建议等内容。
三、适用性
验证方法要考虑分析方法的适用性，包括样品的特性和要求、方法的灵敏度和特异性、样品制备和处理的方法、测定限和线性范围等因素。四、准确性和精密度
准确性和精密度是衡量定量分析方法的重要指标。准确性的评估包括系统误差的测定和修正，常用方法有标准样品、对比法和加标回收法等。精密度的评估要考虑到实验操作的稳定性和方法的重复性等因素。
五、选择性和特异性
选择性和特异性是评估定量分析方法对目标物质的识别和测定能力的指标。选择性的评估要考虑方法的干扰物质的影响和实际样品的复杂性。特异性的评估要考虑到方法对其他物质的干扰以及交叉反应的影响。六、线性范围和灵敏度
线性范围是评估定量分析方法测定结果与目标物质浓度之间的关系的指标。灵敏度是评估定量分析方法对目标物质低浓度范围内变化的敏感性的指标。线性范围的评估要包括线性相关系数、回归方程和相关系数的确定。灵敏度的评估要考虑到检测限和测定限等因素。
七、稳定性
稳定性是评估定量分析方法在时间、温度、湿度、光照等条件下的稳定性和耐受性的指标。稳定性的评估要包括样品的稳定性、试剂的稳定性和仪器的稳定性等方面。
分析方法验证指导原则
分析方法验证指导原则
验证的分析项目有：鉴别试验、杂质测定（限度或定量分析）、含量测定（包括特性参数和含量/效价测定，其中特性参数如：药物溶出度、释放度等）。
验证的指标有：专属性、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。在分析方法验证中，须用标准物质进行试验。由于分析方法具有各自的特点，并随分析对象而变化，因此需要视具体情况拟订验证的指标。表1中列出的分析项目和相应的验证指标可供参考。
①已冇重现性验证，不需验证中间精密度。
②如一种方法不够专属.可用其他分析方法予以补充。
③视具体情况予以验证。
方法验证内容如下。
专属性
专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在
下，釆用的分析方法能正确测定出被测物的能力。鉴别及应、杂质检查和含量测定方法，均应考察其专属性。如方法专属性不强，应采用一种或多种不同原理的方法予以补充。
二、准确度
准确度系指用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度，一般用回收率（％）表示。准确度应在规定的线性范围內试验。准确度也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。
在规定范围内，取同一浓度（相当于100%浓度水平）的供试品，用至少6份样品的测定结果进行评价；或设计至少3种不同浓度，每种浓度分别制备至少3份供试品溶液进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价，且浓度的设定应考虑样品的浓度范围。两种方法的选定应考虑分析的目的和样品的浓度范囲。
三、精密度
精密度系指在规定的测定条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。
生物测定分析方法如何进行验证
定量限如何验证
应该不需要再重复一次了,你们 可以告诉我答案
参考资料
FDA-生物分析方法验证指南 WHO-GMP指南第2卷-验证 中国-生物技术测定方法验证指导原则
讨论时间 （暂定20分钟）
培训效果评估
Байду номын сангаас
30分钟时间完成 看试卷生物测定方法验证培训考核试 题.doc
生物制品检测方法
生物制品质控中采用的方法包括理化分析 方法和生物学测定方法。 生物制品的理化分析方法验证原则与化学 药品相同. 本课件仅对生物测定方法验证进行讨论
生物测定方法
生物学测定系指采用生物学方法，以反映 被测物的生物学特性为目的的测定方法。 常见的生物学测定方法:
酶反应试验 结合试验 细胞测定试验 动物试验
检测限如何验证
对于生物测定，LOD就是能产生比空白对照液 强的反馈的最低试样浓度。通常认为反馈是空 白对照标准偏差的2-3倍时为较为满意的测定 限度。下述以免疫测定OD值为例：
检测限如何验证-例子
目的：确定比空白对照高3个标准偏差的值 步骤：配制适宜浓度的标准样品 配制空白对照液 按照SOP进行至少3次测定，并至少做两个平 行 测定样品和空白的OD值 计算空白对照间的标准偏差 LOD=3*空白的标准偏差/（样品的OD值/样 品浓度）
专属性如何验证
SDS-PAGE电泳纯度
第四节生物样品分析方法的基本要求在测定生物样品中药物
二
生物样品分析其前处理技术 主要应考虑生物样品的种类，被测 定药物的性质和测定方法三个方面的问 题。 样品的分离、纯化技术应该依据生 物样品的类型。例如，血浆或血清需除 蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾 液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白； 尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀 合物中释出。
根据被测定药物的结构、理化性
1.取样： 供测定的血样应能代表整个血药 浓度，因而应待药物在血液中分布 均匀后取样。 动物实验时，可直接从动脉或 心脏取血。 对于病人，通常采取静脉血， 有时根据血药浓度和分析方法灵敏
度。也可用毛细管采血。
2.制备： 血浆的制备 将采取的血液置 含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等） 的试管中，混合后，离心，分离血 细胞，上清液即为血浆。
2.加入中性盐
使溶液的离子
强度发生变化。中性盐能将与蛋白
质水合的水置换出来，从而使蛋白
质脱水而沉淀。
常用的中性盐：饱和硫酸胺等。
盐析的方法与有机溶剂提取法常并
用，药物的回收率高。
3.加入强酸 当pH低于蛋白质 的等电点时，蛋白质以阳离子形式 存在，加入强酸，可与蛋白质阳离 子形成不溶性盐而沉淀。常用的强 酸有：10%三氯醋酸等。含药物血 清与强酸的比例为1:0.6混合，高 速离心,就可除去蛋白质，取上清 液作为样品。在酸性下分解的药物 不宜用本法除蛋白。
2. HPLC中化学衍生化法 衍生化的目的是为了提高药 物检测灵敏度。 化学衍生化包括柱前衍生化 和柱后衍生化两种方法。
药典生物样品定量分析方法验证指导原则
在同时测定几个分析物的情况下，对每个分析物都要有 一条标准曲线。如果一个分析批对于一个分析物可以接受， 而对于另一个分析物不能接受，则接受的分析物数据可以被使用，但应该重新提取和分析样品，测定被拒绝的分析物。
6. 精密度
分析方法的精密度描述分析物重复测定的接近程度，定义为测量值的相对标准差（变异系数）。应使用与证明准确度 相同分析批样品的结果，获得在同一批内和不同批间定量下限以及低、中、高浓度质控样品的精密度。
对于验证批内精密度，至少需要一个分析批的4个浓度，即定量下限以及低、中、高浓度，每个浓度至少5个样品。对于质控样品，批内变异系数一般不得超过15%，定量下限的变异系数不得超过20%。
应用不同方法从一项或多项试验获得数据，或者应用同一方法从不同试验地点获得数据时，需要互相比较这些数据时，需要进行分析方法的交叉验证。如果可能，应在试验样品被分析之前进行交叉验证，同一系列质控样品或试验样品应被两种分析方法测定。对于质控样品，不同方法获得的平均准确度应在±15%范围内，如果放宽，应该说明理由。对于试验样品，至少67%样品测得的两组数值差异应在两者均值的±20%范围内。
对照标准物质
在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。
生物样品分析方法验证M10
ICH 协调指导原则
生物样品分析方法验证 M10
草案 2019 年 2 月 26 日授权
公开征求意见中
在 ICH 进程第 2 阶段，ICH 大会将相应 ICH 专家工作组已达成共识的文本或指导原则草案递交给 ICH 区域监管机构，用以按照相应国家或地区的程序，征求内部和外部意见。
7.6.1 干基质方法 .....................................................44 8.文档 ......................................................................45
1
编码 M10
M10 指导原则进程
进程 ICH 大会成员第二阶段授权 发布征求意见稿（2019 年 1
月 15 日版）
日期 2019 年 2 月 26 日
法律声明：本指导原则受版权保护，在 ICH 版权已得到认可的情况下，除 ICH 标识外，可在公共 许可的前提下使用、复制、引用、改编、调整、翻译或传播，在任何情形下需在文件中承认 ICH 版 权。如需要修改或翻译，必须进行合理的处理，明确注明或以其他方式标注对原文或基于原文进行的 更改。任何暗示 ICH 授权或支持对原 版文件的改写、调整或翻译行为必须避免。
3.色谱法 ....................................................................10 3.1 对照标准品 ...........................................................10 3.2 验证 ................................................................11 3.2.1 选择性 .........................................................11 3.2.2 特异性 .........................................................12 3.2.3 基质效应 .......................................................12 3.2.4 校准曲线和范围 .................................................13 3.2.5 准确度和精密度 .................................................14 3.2.6 残留 ...........................................................15 3.2.7 稀释完整性 .....................................................16 3.2.8 稳定性 .........................................................16 3.2.9 重进样重现性 ...................................................19 3.3 试验样品分析 ........................................................19 3.3.1 分析批 .........................................................20
最新生物样本分析法指导原则
为了适应医药工业全球化的进展，生物样本的分析方法也需要全球化的指导原则。本文就SFDA，FDA及EMA有关生物样本分析的指导原则进行综述分析，了解其中的差异，为研究者进行生物样本分析提供参考。
美国食品药品管理局（FDA）在2001年颁发的关于生物分析方法验证（BMV）的指导原则。2005年SFDA颁发了三个与生物分析法相关的准则：一是关于非临床研究的，其他两个是关于临床研究的。
最近，欧洲药品管理局（EMA）发布了自己的关于BMV的草案准则[8]。这些指导原则颁布后，引起了包括EBF（欧洲生物论坛），美国药学科学家协会（AAPS）以及SBD G（上海生物分析讨论组）和BBDG（北京生物分析讨论组）在内的组织的关注。这些组织都希望建立适用于全球的统一指导原则。
目前这些指导原则存在如下方面的不同：
1. 法规遵从
与美国FDA的指导原则一样，中国SFDA的指导原则没有明确BMV是否必须遵循GLP 规范。2003年9月以后，SFDA要求，非临床毒代动力学（TK）研究和临床BA/BE研究应分别遵守GLP和GCP规范，而对于人样本的生物分析没有规定是否仍遵循GLP规范。EMA草案明确指出，非临床试验生物样本分析无论是方法学验证还是样本测定均要遵循GLP规范，而人类生物分析研究应遵循GCP原则而不是GLP。
2. 方法验证的范围
分析方法学的全部方法学验证的范围，SFDA、FDA和EMA的要求基本一致。对于在不同种属间进行TK研究的生物样本分析， SFDA和FDA指导原则要求在更换种属时，仅要求部分方法学验证，而EMA要求全部验证。
生物样品分析方法验证M10
人用药品注册技术要求国际协调会
ICH协调指导原则
生物样品分析方法验证
M10
草案
2019年2月26日授权
公开征求意见中
在ICH进程第2阶段，ICH大会将相应ICH专家工作组已达成共识的文本或指导原则草案递交给ICH区域监管机构，用以按照相应国家或地区的程序，征求内部和外部意见。
M10
指导原则进程
法律声明：本指导原则受版权保护，在ICH版权已得到认可的情况下，除ICH标识外，可在公共许可的前提下使用、复制、引用、改编、调整、翻译或传播，在任何情形下需在文件中承认ICH版权。如需要修改或翻译，必须进行合理的处理，明确注明或以其他方式标注对原文或基于原文进行的更改。任何暗示 ICH授权或支持对原版文件的改写、调整或翻译行为必须避免。
本文件按现有状态提供，不做任何形式的保证。任何情况下，ICH或原版文件作者不会对任何由使用本文件造成的索赔、伤害或其他责任负责。
上述许可不适用于第三方提供的内容。因此，对版权归属第三方的文件，必须从该版权持有者处获得复制许可。
ICH协调指导原则
生物样品分析方法验证
M10
ICH 共识指导原则
目录
1.引言 (6)
1.1 目的 (6)
1.2 背景 (6)
1.3 范围 (6)
2.一般原则 (7)
2.1 方法开发 (7)
2.2 方法验证 (8)
2.2.1 完整验证 (8)
2.2.2 部分验证 (9)
2.2.3 交叉验证 (9)
3.色谱法 (10)
3.1对照标准品 (10)
3.2 验证 (11)
3.2.1 选择性 (11)
3.2.2 特异性 (12)
3.2.3 基质效应 (12)
生物样品中药物定量分析的指导原则与实验实施
定浓度+初始浓度）/2]*100%
至少67%的复测样品的结果在+/-20%之内。 以下情况需要再分析：
◦ 毒代动力学，每个物种1次
能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有 可接受的准确度和精密度。
是标准曲线的最低点。 应该满足预期的浓度与实验目的。 准确度应在标示值的+/-20%范围内。 变异系数不得超过20%。
指定浓度范围内评价仪器对分析物的响应程度。
制备各个浓度的校正标样——基质相同。
每个分析批都应该有一条标准曲线。
此需要自行判断并说明理由。
EMEA：部分验证可以少到测定批间
精密度和准确度，也可以至几乎全部 验证内容。
应用不同的方法从一项或多项试验获得数据，或者 应用同一方法从不同试验地点获得数据时，需要互 相比较数据，应该进行分析方法的交叉验证。
同一份质控或者试验样品被两种分析方法测定，评 价均值的差异。
度应在+/-15%之内。
质谱方法应该考察基质效应。 采用至少6批来自不同供体的基质，不可以合并基
质。 选择高、低两个质控浓度进行。 求算不同浓度的基质因子。 计算内标归一化基质因子=分析物基质因子/内标基
欧盟生物分析方法确证指导原则草案
生物分析方法确证指南
Guideline on Validation of Bioanalytical Methods
Draft 2009
European Medicines Agency
1.前言（背景）
2.范围
3.法律基础
4.方法确证
分析方法的完整确证
选择性
残留
定量下限
校正曲线
准确度
精密度
稀释可靠性
基质效应
稳定性
部分确证
交叉确证
配体结合分析
5.试验样品分析
分析批
分析批的接受标准
校正范围
试验样品再分析
整合
6.已测样品再分析
7.试验报告
定义
概要
本指南定义了生物样品分析方法的关键因素并提供了建议。指南集中于药动学样品分析所用分析方法的确证。此外，也为实际分析试验样品提供了指导。
1.前言（背景）
对于含有新活性物质的药品，以及用于生产线延伸和仿制药开发，测定生物基质中的药物浓度都是重要的。可能需要这些数据支持新的申请以及已批准药品的变更。毒动学、药动学和生物等效性试验被用于做出关键性决定，以支持药用物质或药品的安全性和有效性。因此，很好地表征、完整地确证和记录应用的生物分析方法到一个满意标准是极为重要的。
在特殊情况下，例如分析复杂基质（如固体组织），当不能满足通常的接受标准时，可能需要使用比本指南定义得更宽接受标准。这应当说明理由并预先定义。
2.范围
本指南提供生物分析方法确证的要求。
此外，也涉及生物分析方法本身的特定方面，如毒动学试验和临床试验样品的实际分析。
本指南还进一步指出，何时可能使用部分确证或交叉确证，替代一个生物分析方法的完整确证。
此处不包括某些特殊技术，例如使用14C标记药物的放射性标记方法。但即使在这些情况下，也应该努力应用本指南的原则。
生物样品定量分析方法验证指导原则
中国药典2015年版
9012生物样品定置分析方法验证
指导原则
一、范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守
G L P原则或GC P原则。
二、生物分析方法验证
(一）分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质
在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加人到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。
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9012 生物样品定量分析方法验证指导原则
1. 范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和 制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动 学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和 记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实 际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。 应该在相应的生物样品分析中遵守 GLP 原则或 GCP 原则。
2. 生物分析方法验证
2.1 分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析 物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每 个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质 替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范 围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液 中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一 个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和 分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质 中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用 性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。 对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质 不产生干扰。 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内 标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结 果的偏差。
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2.1.1 选择性
该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中 其他组分。应该使用至少 6 个来源的适宜的空白基质来证明选择性，它们被分别 分析并评价干扰。当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的 20%，并低于内 标响应的 5%时，通常即可以接受。
应该考察药物代谢物经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引 起干扰的程度。应该考虑通常用于受试者群体试验的同服药物。在适当情况下， 也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。
2.1.2 残留
应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度。 应通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品 之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的 20%，并且不超过内标的 5%。应 考虑特殊措施，在方法验证时检验并在试验样品分析时应用这些措施，以确保不 影响准确度和精密度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一 个试验样品。
2.1.3 定量下限
定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确 度和精密度。定量下限是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的。
2.1.4 标准曲线
应该在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应，获得标准曲线。通过加 入已知浓度的分析物（和内标）到空白基质中，制备各浓度的校正标样，其基质 应该与目标试验样品基质相同。方法验证中研究的每种分析物和每一分析批，都 应该有一条标准曲线。
在进行分析方法验证之前，最好应该了解预期的浓度范围。标准曲线范围应 该尽量覆盖预期浓度范围，由定量下限和定量上限（校正标样的最高浓度）来决 定。该范围应该足够描述分析物的药动学。
应该使用至少 6 个校正浓度水平，不包括空白样品（不含分析物和内标的处 理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质）。每个校正标样可以 被重复分析。
应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式。空白和零浓度样 品结果不应参与计算标准曲线参数。
应该提交标准曲线参数，测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。在方 法验证中，至少应该评价 3 条标准曲线。
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校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15%以内，定量下限处应该在 ±20%内。至少 75%校正标样，含最少 6 个有效浓度，应满足上述标准。如果某 个校正标样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线 应被重新评价，包括回归分析。
最好使用新鲜配制的样品建立标准曲线，但如果有稳定性数据支持，也可以 使用预先配制并储存的校正标样。
2.1.5 准确度
分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度，表示 为：（测得值/真实值）× 100%。应采用加入已知量分析物的样品来评估准确度， 即质控样品。质控样品的配制应该与校正标样分开进行，使用另行配制的储备液。
应该根据标准曲线分析质控样品，将获得的浓度与标示浓度对比。准确度应 报告为标示值的百分比。应通过单一分析批（批内准确度）和不同分析批（批间 准确度）获得质控样品值来评价准确度。
为评价一个分析批中不同时间的任何趋势，推荐以质控样品分析批来证明准 确度，其样品数不少于一个分析批预期的样品数。
批内准确度 为了验证批内准确度，应取一个分析批的定量下限及低、中、高浓度质控样 品，每个浓度至少用 5 个样品。浓度水平覆盖标准曲线范围：定量下限，在不高 于定量下限浓度 3 倍的低浓度质控样品，标准曲线范围中部附近的中浓度质控样 品，以及标准曲线范围上限约 75%处的高浓度质控样品。准确度均值一般应在质 控样品标示值的±15%之内，定量下限准确度应在标示值的±20%范围内。 批间准确度 通过至少 3 个分析批，且至少两天进行，每批用定量下限以及低、中、高浓 度质控样品，每个浓度至少 5 个测定值来评价。准确度均值一般应在质控样品标 示值的±15%范围内，对于定量下限，应在标示值的±20%范围内。 报告的准确度和精密度的验证数据应该包括所有获得的测定结果，但是已经 记录明显失误的情况除外。
2.1.6 精密度
分析方法的精密度描述分析物重复测定的接近程度，定义为测量值的相对标 准差（变异系数）。应使用与证明准确度相同分析批样品的结果，获得在同一批 内和不同批间定量下限以及低、中、高浓度质控样品的精密度。
对于验证批内精密度，至少需要一个分析批的 4 个浓度，即定量下限以及低、 中、高浓度，每个浓度至少 5 个样品。对于质控样品，批内变异系数一般不得超 过 15%，定量下限的变异系数不得超过 20%。
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