激光共聚焦显微镜的样本47页PPT
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激光共聚焦显微镜的样本
1、开机和关机需要管理员来操作 2、换样本的时候需要将物镜降下来， 或点击软件上Escape 3、能用普通荧光显微镜观察拍照的样 本就不要用共聚焦显微镜，节约激光器 寿命。
上转换共聚焦扫描显微镜
OLYMPUS FV1200 放置地点：401-1111 管理员：吴艳 普通共聚焦：400元/小时 上转换共聚焦：1000元/小时
分辨率低，速度快，噪音高
转盘式扫描共聚焦显微镜
性能介于上述两者之间
激光共聚焦扫描显微镜
OLYMPUS FV1200 研究级倒置荧光显微镜 参加过仪器使用培训，通过网上仪 器知识考试，网上提前预约，管理 员审核通过方可使用。
注意事项：
放置地点：401-1312室 管理员：吴安庆老师 收费：200元/小时
（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ）
以激光作为光源，采用光源针孔与检测针 孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以 获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统
共聚焦显微镜的类型
点（慢）扫描共聚焦显微镜
分辨率高，图像清晰，采集图像速度慢
线（狭缝）扫描共聚焦显微镜
仪器型号： OLYMPUS IX73 研究级倒置荧光显微镜
显微镜参数
1．主机功能：系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能； 2．透射光光源：外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置； 3．物镜：长工作距离万能平场半复消色差相差（荧光）物镜：4×（
课件一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能
• 荧光显微镜
光源
• 汞灯 • 卤素灯 • 其他普通光源
• 激发波长范围广
特点
• 激光共聚焦显微镜
• 激光 光源
特点
•光色纯 •方向性好 •能量可调
检测器
分光镜 物镜
光源
标本
荧光显微镜
检测针孔
光源针孔
激光共聚焦扫描显微镜
点光源
位于焦平面 的发射光
激光器
双针孔 光源针孔、检测针孔
共轭聚焦 双针孔共用物镜的焦点
优势
局限
高垂直分辨率
沿Z轴逐层扫描，经过计算机处理成为 三维图像。
高水平分辨率
• 人眼分辨率：0.20 mm • 光学显微镜分辨率：0.25 mm • 共焦显微镜分辨率：0.18 mm • 电子显微镜分辨率： 0.20 nm
共聚焦显微镜的分辨率理论极 限大约是0.15 mm，轴向分辨率 0.5 mm。
伪彩色
--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚 焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片 的荧光显微镜系统。
将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术 结合在一起的高技术设备。
激光/光学显微镜结合，高灵敏度探测器，高性能计算机/ 图像处理软件相结合的新型高精度显微成像。
1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消 除焦点模糊，得到清晰的图像，至此LSCM技术基本成熟
关于激光共聚焦显微镜拍照后图像的处理 ppt课件
关于激光共聚焦显微镜拍照后图像的处理
——————选取与微调整
2016.5.1
关于激光共聚焦显微镜拍照后图像的处理
本教程以一张共聚焦显微镜照片（20160120_crb-HA_HA-aPKC_st11-1Az_40X）为例， 讲解如何选取感兴趣区域并加以处理。
本教程仅对最基础最简单的功能进行说明。欢迎大家批评指正和完善。
关于激光共聚焦显微镜拍照后图像的处理
Zen Lite Blue Edition默认打开“.czi”格式文件。 在拍摄好图像后，保存的图象格式可选很多种，其中本实验室大部分为“.lsm”格式。
注：建议在拍摄时就直接保存为“.czi”格式以简化后续操作。
关于激光共聚焦显微镜拍照后图像的处理
需要说明的是，格式转换不是必须的，但转换后可方便之后随时对文件修改。
当旋转到 合适的角 度后，即 可圈选出 所需区域
在下方工 具栏中点 击标注-选 择感兴趣 区域ROI
通过调整下方工具栏 中的尺寸，可精确调 整所选区域大小及位 移，保证多张图片所 选区域一致。
本操作在2D模式下进 行即是对所有通道同 时进行操作，若需要 单独对某一通道进行 操作，请在拆分模式 下进行。
默认使用black edition打开.lsm 格式文件
点击左上角 as 图片格式选择第一个czi保存 保存后的图片即可用blue edition 打开
——————选取与微调整
2016.5.1
关于激光共聚焦显微镜拍照后图像的处理
本教程以一张共聚焦显微镜照片（20160120_crb-HA_HA-aPKC_st11-1Az_40X）为例， 讲解如何选取感兴趣区域并加以处理。
本教程仅对最基础最简单的功能进行说明。欢迎大家批评指正和完善。
关于激光共聚焦显微镜拍照后图像的处理
Zen Lite Blue Edition默认打开“.czi”格式文件。 在拍摄好图像后，保存的图象格式可选很多种，其中本实验室大部分为“.lsm”格式。
注：建议在拍摄时就直接保存为“.czi”格式以简化后续操作。
关于激光共聚焦显微镜拍照后图像的处理
需要说明的是，格式转换不是必须的，但转换后可方便之后随时对文件修改。
当旋转到 合适的角 度后，即 可圈选出 所需区域
在下方工 具栏中点 击标注-选 择感兴趣 区域ROI
通过调整下方工具栏 中的尺寸，可精确调 整所选区域大小及位 移，保证多张图片所 选区域一致。
本操作在2D模式下进 行即是对所有通道同 时进行操作，若需要 单独对某一通道进行 操作，请在拆分模式 下进行。
默认使用black edition打开.lsm 格式文件
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荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
10
11
12பைடு நூலகம்
Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
Pyr
12
13
黑麦草
洋葱
13
北京化工 大学
14
15
15
16
16
A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres
17
(a) Preparation process for HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres. (b,c) CLSM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm). (d,e) SEM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm; scale bar 100 nm).
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
2
目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
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12பைடு நூலகம்
Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
Pyr
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黑麦草
洋葱
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北京化工 大学
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A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres
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(a) Preparation process for HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres. (b,c) CLSM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm). (d,e) SEM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm; scale bar 100 nm).
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
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目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
激光扫描共聚焦显微镜图文讲解
激光扫描共聚焦显微镜
吴旭
2008.10.14
高级显微镜原理
正置、倒置显微镜
细胞遗传工作站
活细胞工作站
激光显微分离系统激光共聚焦显微镜
概述
激光扫描共聚焦显微镜
（Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用
通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究
高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……
Conventional fluorescence microscope Confocal microscope
历史
1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。
Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987
Zeiss 、Leica 、Meridian 、Olympus
Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
利用激光扫描共聚焦显微镜，可以观察特 定疾病在细胞层面的表现，有助于疾病模 型的建立和药效评估。
医学诊断
01
病理学诊断
激光扫描共聚焦显微镜能够提 供高清晰度的病理组织图像， 有助于医生对肿瘤、炎症等疾
病的诊断。
02
疾病进程研究
通过观察不同疾病进程中组织 的变化，有助于研究疾病的发
病机制和治疗方法。
生态系统的健康状况。
行业前景
市场需求持续增长
随着生命科学、医学、环境科学等领域的发展，对激光扫描共聚焦 显微镜的需求将不断增加。
技术创新推动发展
未来，随着超分辨率技术、多色荧光成像技术、高速数据采集技术 的不断进步，激光扫描共聚焦显微镜的性能将得到进一步提升。
应用领域不断拓展
随着技术的进步和应用的拓展，激光扫描共聚焦显微镜将在更多领域 发挥重要作用，如临床诊断、药物研发、环境监测等。
05
激光扫描共聚焦显微镜的 未来发展趋势
技术创新
更高的分辨率
利用超分辨率技术，如STED （受激发射损耗）显微镜和 PALM（光激活定位显微镜） ，可以实现比传统光学显微镜
更高的分辨率。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
更多的颜色通道
增加荧光标记的多样性和改进 光谱分离技术，以实现多色荧 光成像，更清晰地揭示样本的
复杂结构。
更快的数据采集速度
《激光共聚焦技术》课件
04
激光共聚焦技术的优缺点
优点
高分辨率
高灵敏度
激光共聚焦技术能够提供高分辨率的图像 ，使得研究者能够观察到细胞或组织的细 微结构。
该技术具有高灵敏度，能够检测到低浓度 的荧光标记，有利于对目标分子的定量分 析。
无损观察
实时动态观察
激光共聚焦技术是非侵入性的，可以在不 损伤细胞的情况下进行观察，从而获得更 真实的细胞状态信息。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度、能 够观察活细胞等。
工作原理
01
激光共聚焦技术利用激光的相 干性，通过显微镜的物镜将激 光束聚焦到样品上，形成光斑 。
02
通过扫描样品，逐点获取光斑 处的反射或荧光信号，再通过 计算机进行图像重建，得到高 分辨率的显微图像。
03
在图像采集过程中，采用针孔 限制视野深度，消除背景干扰 ，提高图像的对比度和清晰度 。
《激光共聚焦技术 》ppt课件
目 录
• 激光共聚焦技术概述 • 激光共聚焦显微镜 • 激光共聚焦技术的应用 • 激光共聚焦技术的优缺点 • 实验操作与注意事项
01
激光共聚焦技术概述
定义与特点
定义
激光共聚焦技术是一种光学显微技术 ，利用激光作为光源，通过共聚焦显 微镜获取细胞或组织的显微结构和高 分辨率图像。
应用领域
01
百度文库
激光共聚焦技术PPT课件
样品预处理 给药、切片或细胞标本的制备 荧光探针标记样品
.
13
百合花粉管钙离子浓度梯度检测
液体培养基中培养百合花粉
观察花粉管生长情况，长度大概为花粉粒直径 的2－5倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观 察。
.
14
荧光探针
Fluo-3（/AM）
属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。
科学、药理学和遗传学等领域中新的
有力研究工具。
.
3
激光共聚焦显微镜在生物学中的应用
原位鉴定细胞或组织内生 活体细胞或组织功能的实
物大分子、观察细胞及亚 时动态监测
细胞形态结构
实时定量测定细胞内Ca2+变
检测核酸
化
检测蛋白质细胞定位
测定细胞内pH变化
检测细胞凋亡
检测膜电位变化
细胞器的观察及测定 检测细胞融合 观察细胞骨架 检测细胞间缝隙连接通讯 检测细胞内脂肪
分子生物学课件
激光共聚焦显微镜应用技术 －－蛋白的细胞器定位
Confocal Laser Scanning Microscopy
.
1
激光共聚焦显微镜的基本结构
Zeiss LSM 510 META
激光光源 冷却系统 扫描器 光学装置 荧光显微镜系统 图象存储与处理及控制系统
针孔光栏 分光镜 发射荧光单色器 检测器.
.
13
百合花粉管钙离子浓度梯度检测
液体培养基中培养百合花粉
观察花粉管生长情况，长度大概为花粉粒直径 的2－5倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观 察。
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14
荧光探针
Fluo-3（/AM）
属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。
科学、药理学和遗传学等领域中新的
有力研究工具。
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3
激光共聚焦显微镜在生物学中的应用
原位鉴定细胞或组织内生 活体细胞或组织功能的实
物大分子、观察细胞及亚 时动态监测
细胞形态结构
实时定量测定细胞内Ca2+变
检测核酸
化
检测蛋白质细胞定位
测定细胞内pH变化
检测细胞凋亡
检测膜电位变化
细胞器的观察及测定 检测细胞融合 观察细胞骨架 检测细胞间缝隙连接通讯 检测细胞内脂肪
分子生物学课件
激光共聚焦显微镜应用技术 －－蛋白的细胞器定位
Confocal Laser Scanning Microscopy
.
1
激光共聚焦显微镜的基本结构
Zeiss LSM 510 META
激光光源 冷却系统 扫描器 光学装置 荧光显微镜系统 图象存储与处理及控制系统
针孔光栏 分光镜 发射荧光单色器 检测器.
激光扫描共聚焦显微镜
• 利用专用图象处理软件，还可以实现其他 许多数据分析。
分层扫描（切片扫描）
GFP与PE双色标记3D扫描
细胞“CT”片
3D模拟
Z轴分析
植物切片三维重建
细胞测量
周长
面积
长度
常用荧光探针介绍
细胞活性探针 细胞器探针 细胞骨架探针 核酸探针 细胞内离子探针
细胞活性探针
• 活细胞探针：吖叮橙（AO）
高清晰成像
培养的293细胞 绿色荧光蛋白
高清晰成像
培养的人肝癌细胞哑叮橙染色
高清晰成像
成纤维细胞微丝微管
荧光强度分析
荧光信号通过光电倍增管转 化为电信号，经过电脑分析 可对荧光信号进行相对定量 测定。
荧光强度分析
随机圈取细胞 可得到所圈细胞的相对荧光强度值
荧光强度分析
荧光标记绝对值测量
分层扫描（切片扫描）
较厚层面
较薄层面
人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。
分层扫描（切片扫描）
较厚层面 （平滑肌损伤可见）
较薄层面
兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞 。
分层扫描（切片扫描）
• 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果， 对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据 重组，可观测空间结构，空间定位，三维 重组。
是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞 溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性 细胞器中浓集。
分层扫描（切片扫描）
GFP与PE双色标记3D扫描
细胞“CT”片
3D模拟
Z轴分析
植物切片三维重建
细胞测量
周长
面积
长度
常用荧光探针介绍
细胞活性探针 细胞器探针 细胞骨架探针 核酸探针 细胞内离子探针
细胞活性探针
• 活细胞探针：吖叮橙（AO）
高清晰成像
培养的293细胞 绿色荧光蛋白
高清晰成像
培养的人肝癌细胞哑叮橙染色
高清晰成像
成纤维细胞微丝微管
荧光强度分析
荧光信号通过光电倍增管转 化为电信号，经过电脑分析 可对荧光信号进行相对定量 测定。
荧光强度分析
随机圈取细胞 可得到所圈细胞的相对荧光强度值
荧光强度分析
荧光标记绝对值测量
分层扫描（切片扫描）
较厚层面
较薄层面
人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。
分层扫描（切片扫描）
较厚层面 （平滑肌损伤可见）
较薄层面
兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞 。
分层扫描（切片扫描）
• 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果， 对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据 重组，可观测空间结构，空间定位，三维 重组。
是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞 溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性 细胞器中浓集。
激光共聚焦显微拉曼光谱仪PPT课件
操作步骤
1、打开电脑。 2、开机：插上电源插头，将Laser至On，长按power打开仪器，power蓝色灯亮。 3、打开OMNIC软件，点击实验设置，在光学台下打开激光，激光预热，预热完毕后，出现对话框，点击 休息两次，此时激光灯亮，点击实验设置中ok，实验设置完毕。 4、准直聚焦：如果仪器换激光器，如532nm换成780nm或仪器移动需做准直，方法选择10倍物镜，然后 22目观察，在x轴和y轴方向上移动光学台，旋动至黄色小光斑在十字交叉处。 5、校准仪器（检查光斑是否在中心）：如果光斑不在中心，可以通过移动光学台，使光斑在中心。 6、采集样品，采集完成后，点击文件另存为，在图谱文件CVS下保存，采样完成。 7、关机：点击实验设置，在光学台下关闭激光，将Laser至off，长按power关闭仪器，power熄灭，拔 下电源插头，关闭OMNIC软件，关闭电脑。
3、显微镜厂家原装透射、反射照明。附送备用照明灯2个。
4、自动XYZ平台，最小步长不大于0.1 um，可进行分散的多点、 线、面扫描和共焦深度的扫描。系统软件能帮助自动聚焦。系 统无反向间隙，能保证位置原始点的良好重复性。
5、采用真共焦光路设计，空间分辨率方面，100X物镜下，xy 分辨率 <= 1 um ，z轴方向分辨率<= 2微米，共焦深度连续可 调。
激光共聚焦显微拉曼光谱仪
分析测试中心
光学平台
激光共聚焦显微镜技术——免疫学荧光实验课件PPT
LSCM的基本原理
普通光学显微镜使用的卤素灯光源为混合光，光谱范围宽， 成象时样品上每个照光点均会受到色差影响以及由照射光 引起的散射和衍射的干扰，影响成象质量；
LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色差，成象聚焦 后焦深小，纵向分辨率高，可对样品作不同深度的层扫描 和荧光强度测量，不同焦平面的光学切片经三维重建后能 得到样品的三维立体结构，这种功能被形象的称为“显微 CT”。
LSCM的结构特点
扫描装置 LSCM使用的扫描装置有两类，台扫描系统和镜扫描系统。现在
也有两者结合使用的仪器。台扫描通过步进马达驱动载物台，位移精 度可达0.lμm，能够有效地消除成象点横向象差，使样品信号强度不受 探测位置的影响，可准确定位定量地扫描检测视野中每一物点的光强 度，缺点是载物台机械移动、图象采集速度较慢。镜扫描有双镜扫描 和单镜扫描两种，通转镜完成对样品的扫描。由于转镜只需偏转很小 角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画 面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定，但因光路 略有偏转会对通光效率和象差有所影响。扫描系统的工作程序由计算 机自动控制。
LSCM的结构特点
激光光源
LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。氪氩离子激光器是可见光范围 内使用的多光谱激光，发射波长488nm、568nm和647nm分别为蓝光、绿光和红 光，大功率氩离子激光器是紫外和可见光混合激光器，发射波长为351－364nm、 488nm和514nm分别为紫外光、蓝光和绿光，单个激光优点是安装方便，光路简 单，但价格较贵并存在不同激光之间的光谱竞争和色差校正问题。多激光器系统 在可见光范围使用氩离子激光器，发射波长为 488nm和514nm的蓝绿光，氦氖激 光器发射波长为633nm的红光，紫外光选用氩离子激光器，波长为351－364nm。 其优点是各谱线激光单独发射，不存在谱线竞争的干扰，调节方便。
相关主题
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1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不Leabharlann Baidu要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
激光共聚焦显微镜的样本
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。