激光共聚焦显微镜的样本47页PPT

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共聚焦激光扫描PPT课件

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4
共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊增加有效分辨率提高信噪比厚标本的清楚细查 Z轴扫描可以实现数字放大倍率的调节
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5
Wide-field microscopy
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6
Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
12
基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器激光束
小孔
聚焦透镜分光器
光学扫描物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
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13
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14
色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真皮乳头呈圆形或椭圆形分布，细胞形态规则，大小及明亮度均一。细胞间有间隔。
B
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15
对皮肤疾病的治疗与疗效评估需要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
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原理示意图
光源（激光）二色镜。物镜样品针孔检测仪共焦显微镜的最大优点是可以只从一个平面收集光。针孔同焦平面成对（即共焦），使得来自焦平面以外的光远离检测仪。激光扫描显微镜按顺序一点一点地、一行一行地扫描样品，将象素资料合成一个图象。通过移动焦平面，单个图象（光限幅）可以放在一起，形成可以以后进行数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
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7
Confocal microscopy
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8
Confocal Principle

激光共聚焦技术优秀课件

荧光样品的制备要求
荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确保持样品应有的结构形态完整性荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性荧光强度适宜荧光稳定性好样品的荧光分布均匀两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉
可以消除图象背景干净、干扰杂质少
荧光探针的种类及应用
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物
目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水培养16小时。
激光共聚焦显微镜基本操作
获取共焦图像的步骤
在 VIS 模式中观察样品装入 LSM 配置扫描图像保存图像
不同厚度光切图像
Z轴扫描
Z轴扫描、时间系列扫描
时间系列扫描
Z轴扫描＋时间系列扫描
组织和细胞样品中荧光的来源
自发荧光荧光染色免疫荧光－荧光抗体法产生荧光外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光酶致荧光
成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域中新的有力研究工具。

《激光共聚焦简化》课件

显微镜设置与校准
激光器选择
根据所使用的荧光染料选择适当的激光器波长。
滤色片配置
选择合适的滤色片以减少背景噪声并提高信噪比。
校准与调整
确保显微镜的焦距、放大倍数和视野等参数设置正确，以便获得清晰的图像。
图像采集与处理
采集模式选择
图像处理
根据观察需求选择单帧采集、多帧平均或实时扫描模式。
技术培训
参加相关技术培训，提高操作和维护显微镜的能力。
05 案例展示与解析
细胞生物学研究案例
细胞骨架结构观察
利用激光共聚焦显微镜技术观察细胞骨架的动态变化，解析细胞生长、分裂和迁移过程中的骨架重构过程。
细胞器定位与功能研究
通过共聚焦显微镜对细胞内特定细胞器进行高分辨率成像，分析其在细胞代谢、信号转导等方面的功能。
《激光共聚焦显微镜技术简化操作与解析》
contents
目录
• 激光共聚焦显微镜简介 • 激光共聚焦显微镜操作流程 • 激光共聚焦显微镜解析技术 • 激光共聚焦显微镜的维护与保养 • 案例展示与解析
01 激光共聚焦显微镜简介
定义与工作原理
定义
激光共聚焦显微镜是一种光学显微镜技术，利用激光作为光源，通过共聚焦方式获取样品的高分辨率、高对比度图像。
优点
色彩复原技术能够提供高对比度和高分辨率的图像，同时能够选择性地标记和染色细胞或组织的特定结构，有助于研究者更深入地了解细胞或组织的生理和病理变化。
缺点
由于荧光染料可能会对细胞或组织产生一定的毒性作用，因此需要严格控制染料的浓度和作用时间。
定量分析技术
01 02
定量分析技术
利用激光共聚焦显微镜的定量分析软件，对获取的图像进行定量分析和数据提取。这种技术能够提供更准确和可靠的实验数据，有助于研究者更深入地了解细胞或组织的生理和病理变化。

激光共聚焦显微镜的样本PPT学习教案

仪器特点
1、光源用激光做光源，从理论上消除了色差
。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。
2、采用了共扼聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个小孔，
将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。
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仪器特点
3、点与面扫描技术共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。
第23页共42页石蜡切片冰冻切片涂片印片铺片培养的粘附细胞悬浮细胞各种染色非染色荧光标记的组织包括活组织第24页共42页高清晰成像高清晰成像半定量荧光强度分析半定量荧光强度分析荧光探针表达量测定荧光探针表达量测定分层扫描分层扫描多种荧光标记同时检测多种荧光标记同时检测第25页共42页激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制减少了成像的干扰以及使用光色较纯的激光所以制减少了成像的干扰以及使用光色较纯的激光所以成像分辨率可达普通光学显微镜的成像分辨率可达普通光学显微镜的1414倍
仪器型号： OLYMPUS IX73 研究级倒置荧光显微镜
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显微镜参数
1．主机功能：系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能； 2．透射光光源：外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置； 3．物镜：长工作距离万能平场半复消色差相差（荧光）物镜：4×
（数值孔径N.A.≥0.13）、10×（N.A.≥0.3），20×（N.A.≥0.7）、 40×（N.A.≥0.6），60X×（N.A.≥0.7） 4．物镜转盘：6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜信息，随物镜转换能够自动校准标尺； 5．载物台：精确定位功能手动载物台；具备XY锁定和复位功能, 可重现标本位置，游标尺的精度≤100μm； 6．聚光镜：超长工作距离万能聚光镜，孔位数≥5；

激光扫描共聚焦显微镜教学课件

扫描速度与分辨率设置
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和数字位数等参数，以确保图像质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置多个采集区域，并确保各区域间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像，确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度、无损检测、能够观察活细胞等。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照射到样品上，形成光斑；
02
光斑通过扫描器在样品表面进行扫描，同时收集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚焦系统汇聚到光电倍增管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成图像，显示在计算机屏幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光时间、增益等，以获取高质量的图像。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫描共聚焦显微镜下观察标记物的动态变化，通过分析荧光强度和分布的变化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于临床诊断，通过观察活体组织样本，为疾病诊断和治疗提供更准

激光扫描共聚焦显微镜教学课件

缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射率等参数敏感，因此需要精心制备样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本也相对较高，需要定期检查和保养。
04
激光扫描共聚焦显微镜的优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行扫描，可以实现比传统显微镜更高的分辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具，包括图像预处理、特征提取、

激光共聚焦显微拉曼光谱仪PPT课件

激光共聚焦显微拉曼光谱仪
分析测试中心
光学平台
不是凸起，是专用的光学平台，哪些看起来颗粒一样的是螺丝孔，M6的内螺纹，可以将光学元件固定在上面。平台一般很重，不锈钢质地，总体质量500公斤左右。因为光学需要稳定，所以一般都得用这个才能保证光路稳定
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
谢谢大家
荣幸这一路，与你同行
It'S An Honor To Walk With You All The Way
演讲人：XXXXXX 时间：XX年XX月XX日
激光共聚焦显微拉曼光谱仪
仪器组成
激光器共焦显微镜
样品室单色器检测记录系统
计算机
激光器
1、配置532nm半导体高功率激光器，激光输出功率要求不小于 50mW。
2、使用两片长寿命Edge瑞利滤光片和一片用于去除等离子线的干涉滤光片，仪器阻挡激光瑞利散射水平高。
3、相应波长的激光等离子滤光片（干涉滤光片），在全扫描范围（100-4000波数）内，无等离子线。
3、显微镜厂家原装透射、反射照明。附送备用照明灯2个。
4、自动XYZ平台，最小步长不大于0.1 um，可进行分散的多点、线、面扫描和共焦深度的扫描
5、采用真共焦光路设计，空间分辨率方面，100X物镜下，xy 分辨率 <= 1 um ，z轴方向分辨率<= 2微米，共焦深度连续可调。
4、为适应不同样品测量要求以及防止激光功率过高烧坏样品，要求激光输出功率可调。同时，激光光斑尺寸可调。

激光共聚焦显微镜基本原理和实际操作49页PPT

41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育；而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
激光共聚焦显微镜基ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ原理和实际操
作
21、没有人陪你走一辈子，所以你要适应孤独，没有人会帮你一辈子，所以你要奋斗一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该是坚强。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之首，因为这种德性保证了所有其余的德性。--温斯顿．丘吉尔。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的，它只是让人们的脚放上一段时间，以便让别一只脚能够再往上登。
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联

激光角膜共焦显微镜PPT课件

缘可见有细小圆形阿米巴包囊结构，包囊中心可见白色高反光
区。
31
阿米巴性角膜炎的微囊
离体组织学检查 (光学显微镜)
活体检查 (HRT 3)
32
单纯疱疹病毒性角膜炎
33
树枝状角膜炎
• 可为单发或多发，组织学上的上皮损害表现为沿树枝状走行曲的细胞丧失。
• 单个损害可扩大，或邻近的损害融合成大的病灶，形态不规则，呈“地图状”损害，组织学上“地图状”损害可累及基底层上皮细胞。
平面上的反射光及其周围的散射光。 • 共焦平面可以通过焦平面调解环进行手动调解,因
此可获得角膜各个层面的图像,一系列不同共焦平面的图像组成了三维图像。
5
共焦激光技术
影像探测器
针孔样结构 670 nm 激光发生器
分光镜
聚光镜
Courtesy of J. Flanagan PhD, MCOpt
焦平面
42
43
44
角膜浅基质层基质紊乱，可见大量菌丝分布，基质层结构破坏，散在分布炎性细胞。
45
予全身及局部抗真菌治疗一周后复查共焦显微镜，可见菌丝有明显减少。
46
患者，XXX，因“左眼眼痛、畏光、视物不见两月”，
外院诊断“真菌性角膜炎”，予抗真菌治疗后症状好转，但
视力无明显提高。入院行角膜共焦显微镜检查可见基质有高
独有的纵向断层扫描
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角膜内皮细胞计数功能
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临床应用
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药物毒性眼表病变
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• 42岁男性 • 左眼“霰粒肿”手术
后长期频点各种抗生素滴眼液3月余 • 左眼红痛、流泪2月
20
21
治疗1月余
22
棘阿米巴性角膜炎

荧光共聚焦激光扫描共聚焦ppt课件

7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
2
目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
17
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Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.

共聚焦激光扫描显微术ppt课件-PPT精选文档

思考题： 1. 结合1-2个例子，简述激光共聚焦扫描显微
镜技术在生物医学中的应用。
名词解释：
1. 荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP)
2. 光笼锁（caged）化合物技术
Thanks for your attention!
红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacific
sea anemone relative Discoma Striiata 中分离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名为DsRed。
五、在神经生物学的应用
1.神经细胞参数测定及三维重建 • 细胞外形 • 浦肯野氏细胞及其突起的投射 • 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 • 神经骨架重组的研究
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上反射光或荧光经目镜汇聚于探测器探检测器前有一小孔(Pinhole)汇聚光束
2.成像保存以电信号形式储存，可以进行图象分析（参数、伪彩、值等）。
3.共轭(confocal) 是指光源孔和检测针孔对物镜焦平面是共轭的。
宽场照明显微镜和共聚焦图象比较
笼锁神经递质、调质及抗体
例：光照解笼锁 NPE-氨甲酰胆碱→血管平滑肌收缩（氨
甲酰释放） Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电
极导入法，膜片钳全细胞方式导入法
CLSM的优点
1.激光是单色光、LM观察、荧光观察 2.推进器步距达0.1um（“显微CT”） 3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰
转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内有少量GFP阳性细胞。 (荧光+普通光相差显微镜×100倍)

激光共聚焦显微拉曼光谱仪PPT课件

操作步骤
1、打开电脑。 2、开机：插上电源插头，将Laser至On，长按power打开仪器，power蓝色灯亮。 3、打开OMNIC软件，点击实验设置，在光学台下打开激光，激光预热，预热完毕后，出现对话框，点击休息两次，此时激光灯亮，点击实验设置中ok，实验设置完毕。 4、准直聚焦：如果仪器换激光器，如532nm换成780nm或仪器移动需做准直，方法选择10倍物镜，然后 22目观察，在x轴和y轴方向上移动光学台，旋动至黄色小光斑在十字交叉处。 5、校准仪器（检查光斑是否在中心）：如果光斑不在中心，可以通过移动光学台，使光斑在中心。 6、采集样品，采集完成后，点击文件另存为，在图谱文件CVS下保存，采样完成。 7、关机：点击实验设置，在光学台下关闭激光，将Laser至off，长按power关闭仪器，power熄灭，拔下电源插头，关闭OMNIC软件，关闭电脑。
3、显微镜厂家原装透射、反射照明。附送备用照明灯2个。
4、自动XYZ平台，最小步长不大于0.1 um，可进行分散的多点、线、面扫描和共焦深度的扫描。系统软件能帮助自动聚焦。系统无反向间隙，能保证位置原始点的良好重复性。
5、采用真共焦光路设计，空间分辨率方面，100X物镜下，xy 分辨率 <= 1 um ，z轴方向分辨率<= 2微米，共焦深度连续可调。
4、为适应不同样品测量要求以及防止激光功率过高烧坏样品，要求激光输出功率可调。同时，激光光斑尺寸可调。
共焦显微镜
1、专业的高端科研型显微镜，10X原装目镜，20X、50X、100X、长焦50X物镜，包括可同时安装5个镜头的镜头架。其中长焦 50X的焦距都要求大于或接近10mm。
2、彩色摄像机。
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More

激光共聚焦显微镜技术——免疫学荧光实验课件PPT

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
LSCM的结构特点
扫描装置 LSCM使用的扫描装置有两类，台扫描系统和镜扫描系统。现在
也有两者结合使用的仪器。台扫描通过步进马达驱动载物台，位移精度可达0.lμm，能够有效地消除成象点横向象差，使样品信号强度不受探测位置的影响，可准确定位定量地扫描检测视野中每一物点的光强度，缺点是载物台机械移动、图象采集速度较慢。镜扫描有双镜扫描和单镜扫描两种，通转镜完成对样品的扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定，但因光路略有偏转会对通光效率和象差有所影响。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。
检测系统
LSCM为多通道荧光采集系统，光路上要求至少有三个荧光通道和一个透射光通道，如有第四荧光通道更好，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT。
LSCM的生物医学应用
荧光检测
制作和分析有荧光标记的样品是既费时又费力的工作。采用多荧光，您可以使用多个标记同时研究细胞结构。此外，多荧光试验是直接研究分子和其他细胞成分之间关系的唯一工具。
LSCM的基本原理
普通光学显微镜使用的卤素灯光源为混合光，光谱范围宽，成象时样品上每个照光点均会受到色差影响以及由照射光引起的散射和衍射的干扰，影响成象质量；
LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色差，成象聚焦后焦深小，纵向分辨率高，可对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量，不同焦平面的光学切片经三维重建后能得到样品的三维立体结构，这种功能被形象的称为“显微 CT”。
CD83 CD80 CD86 B7H4
GL-50 PD-L1 PD-L2 Light