实验十一 紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

Ⅰ. 紫外诱变技术

一实验目的

以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。了解紫外线对细菌细胞的作用。

二实验材料和用具

菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）

培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基

生理盐水等

器皿：10ml及1ml的移液管，无菌试管，无菌培养皿，无菌三角瓶（内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管，离心机，紫外诱变箱等。

三实验原理

以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。

四实验内容

1、对出发菌株进行处理，制备单细胞悬液；

2、紫外线进行处理；

3、用平板菌落计数法测定致死率；

五 操作步骤

（一）出发菌株菌悬液的制备

1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h ；

2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm 振荡培养过夜（约16h ），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h ；

3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中，10000rpm 离心3~5min ，弃去上清液，加4ml 无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液；

4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡20~30min ，以打散细胞；

5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml 菌液，37℃倒置培养24~36h ，进行平板菌落计数。

（二）UV 诱变

1. 将紫外灯打开，预热30min ；

2. 取直径6cm 的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml ，控制细胞密度为107~108个/ml ；

3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，分别处理5s 、10s 、15s 、30s 、45s ，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；

4. 取0.5ml 处理后的菌液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板进行计数（避光培养）。

六 实验结果

对平板菌落进行计数，并计算死亡率。

%100///⨯-=ml

ml ml 照射前活菌数照射后活菌数照射前活菌数死亡率

附录：实验流程图

出发菌株

↓

斜面活化

↓37℃，16~24hr

振荡培养

↓37℃，110rpm过夜

翻接

↓37℃，110rpm 2~4hr 取4ml离心收集菌体

↓10000rpm, 5min

弃上清液

↓

悬浮沉淀于4ml 无菌生理盐水

离心

↓10000rpm, 5min

弃上清液

↓

悬浮沉淀于4ml 无菌生理盐水

↓

离心

↓10000rpm, 5min

弃上清液

↓

悬浮沉淀于4ml 无菌生理盐水

↓

玻璃珠振荡

↓20~30min

单细胞菌悬液→平板菌落计数

↓UV诱变

平板菌落计数

Ⅱ. 链霉素抗性突变株的筛选

一实验目的

以紫外线诱变获得大肠杆菌的链霉素抗性突变株为例，学习微生物诱变育种的基本技术。

二实验材料和用具

菌种：大肠杆菌E.coli

培养基：营养肉汤、营养琼脂、营养琼脂+Str、生理盐水等

链霉素溶液：母液2mg/ml；终浓度8μg/ml

仪器：紫外诱变箱、超净工作台、红灯、铁筒、离心机、混合仪等

三实验原理

链霉素属氮基糖昔类抗生素。细菌对氨基糖昔类抗生素产生耐药性的作用机理主要有以下几种:其一，细菌产生相应的钝化酶对进人胞内的活性分子进行修饰，令其失去生物活性；其二，氨基糖昔类抗生素的作用靶位核搪体或是与核糖体结合的核蛋白的氨基酸发生突变而使进人胞内的该类抗生素不能与之结合或结合力下降；其它机理，包括细胞膜的通透性下降等。细菌对链霉素产生抗药性的作用机理属于第二种。链霉素抗性是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其它基因发生突变导致核糖体或核糖体蛋自发生改变而产生。

四操作步骤

1. 出发菌株转接营养肉汤斜面活化；

2. 菌株的培养、细胞的收集和离心、紫外诱变处理同实验二；

3. 将诱变前、后的菌悬液各取0.5ml，进行适当的稀释分离，然后用倾注法进行平板菌落

计数；并选择诱变处理前合适浓度的菌悬液涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8μg/ml），培养后记录抗性菌落数，计算该菌的自发突变率；

4. 另取1ml诱变处理好的菌悬液接入液体营养肉汤液体培养基进行后培养，37℃120rpm

摇瓶培养；

5. 对后培养以后的菌悬液进行平板菌落计数和抗性菌落数计数，观察紫外诱变的效果。

五 实验内容

1. 用紫外线对细菌细胞进行诱变处理；

2. 利用药物平板筛选抗性突变株；

六 实验结果

1. 观察紫外诱变的结果；

2. 计算大肠杆菌链霉素抗性的突变率；

%100Str ⨯=诱变前活菌数

抗性菌数诱变前样品中自发突变率 %100Str ⨯=菌数

后培养以后样品中的活抗性菌数后培养以后样品中突变率

七 思考题

1. 为什么在诱变前要把菌悬液打散？

2. 试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。

3. 简述后培养的目的及注意事项。