第七章外源基因的表达
外源基因的导入和表达研究
外源基因的导入和表达研究随着生物技术的不断进步，人类利用基因工程技术已经可以人为地导入外源基因（即来自不同物种的基因）到特定的生物体中，并在其内部进行表达。
外源基因的导入和表达研究不仅在医学领域有重要的应用价值，而且可以用于植物和动物的育种、菌类的生产等多个领域，具有非常广泛的意义。
一、外源基因的导入方式外源基因的导入通常有三种方式：基因转染、基因克隆和基因突变。
其中基因转染是最常见的一种方法，其通过化学手段或物理手段将外源质粒导入到细胞内，使细胞内的染色体带有外源DNA序列，让生物体在遗传上发生变化。
基因克隆指的是利用重组DNA技术将外源基因插入到载体中，形成重组质粒，再将其导入到宿主细胞。
而基因突变指的是利用基因工程技术将目标基因的部分序列或全部序列进行基因剪切或点突变，从而在细胞内引入特定的改变。
二、外源基因的表达方式一旦外源基因成功地导入到宿主细胞后，就需要利用相应的机制使其被正确表达。
一般而言，外源基因的表达方式主要有两种：转录和翻译。
转录是指将某个基因的DNA序列转换成相应的mRNA序列，为后续的翻译打下基础。
而翻译则是将翻译RNA （tRNA）和核糖体结合，将mRNA的密码子转化成氨基酸序列，最终形成蛋白质。
在这个过程中，外源基因所编码的蛋白质需要能够正确地折叠和组装。
三、外源基因的应用外源基因的应用非常广泛。
在医学领域，外源基因的导入和表达技术已经成为了基因治疗的基础。
通过将正常的基因序列导入到受损或异常的细胞中，可以纠正基因缺陷，并且达到治疗某些遗传病的目的。
同时，外源基因导入技术也可以用于生产重组蛋白，如人类重组胰岛素、重组干扰素、重组免疫球蛋白等，这些蛋白对于多种疾病的治疗都有重要的作用。
在植物和动物育种领域，利用外源基因导入和表达技术也可以获得一些长期以来难以获得的农作物，如对抗虫害、抗病性更强的水稻、高营养价值的谷物等。
此外，外源基因导入技术还可以用于菌类的生产和制药领域。
外源基因表达的基本流程
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外源基因的导入和表达机制
外源基因的导入和表达机制随着生物技术的飞速发展，外源基因的导入和表达成为了基因工程领域中的重要课题。
其涉及到基因治疗、转基因作物、药物生产等许多领域。
在导入和表达外源基因的过程中，要考虑到基因的适应性、表达的稳定性、特异性以及对宿主生物的影响等多个方面。
本文将探讨外源基因的导入和表达机制，包括基本原理、工具和技术以及存在的问题和挑战。
基本原理导入和表达外源基因的基本原理是将外源DNA序列引入到宿主细胞中，使其被转录和翻译成蛋白质。
具体而言，一般有两种方式：直接转染和向宿主基因组中嵌入外源基因，后者也称为基因整合。
直接转染是将外源DNA序列直接引入到细胞外，在细胞膜相关的受体介导下，外源DNA序列被进入到细胞质中。
直接转染的DNA所携带的信息将指导它在宿主细胞内的表达。
基因整合是将外源DNA序列整合到宿主细胞染色体上，使其成为宿主细胞的一部分。
基本原理是将外源DNA构建为一个适合于整合的载体，然后具体通过发生基因重组或嵌入基因导入宿主细胞的染色体中。
被整合的外源脱氧核糖核酸(DNA)序列将被遵循宿主细胞一样转录并翻译成蛋白质。
工具和技术导入和表达外源基因要解决的核心问题就是如何将外源DNA 送入宿主细胞。
为此，研究者现有许多的工具和技术可供选择。
电穿孔是将宿主细胞暴露在高电场的冲击下，使细胞膜通透性增强，外源DNA得以进入的技术。
这种技术既可以使用简单的电刺激来进行，也可以通过利用特殊设备专门进行。
这种技术在大多数细胞类型中都是有效的。
群粒化法是利用氟化物和离子溶液百炼生化学反应，在其中产生群粒化团块，通过进一步化学反应打开细胞膜，使外源DNA进入细胞内部。
这种技术适用于一些难以被电穿孔的细胞类型。
病毒载体是将外源DNA序列植入病毒中，通过感染宿主细胞扩增表达，使表达的目标基因在细胞内获得较高的表达水平。
存在的问题和挑战虽然外源基因的导入和表达在许多方面得到了极大的改进，但仍然存在着一些问题和挑战。
外源基因的原核表达
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常见的大肠杆菌表达系统
• PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启 动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和 PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或 溶原循环。 λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产
物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在
细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之 间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞
与起始密码ATG之间的距离及碱基 的种类；防止核糖体结合位点附近 序列转录后形成发卡结构。
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表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标
基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之 间的距离和碱基组成处于一个适当的范围 内。
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核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻
1、原核生物：选择一个RNase缺失 的工程菌株。
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
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外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表
达体系时应考虑以下问题：
1、AUG为首选起始密码子 2、SD序列为与核糖体结合位点
3、SD序列与起始密码子之间的距离为 3～9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子
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尽量提高核糖体结合位点本身和附近 的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5’ 端形成的 “茎环” 结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意 的事项。
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录
外源基因的表达
RNA聚合酶： 核心酶(α2ββ′)＋σ亚基＝全酶( α2ββ′ σ)
s factor:
7.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活 性的DNA顺式作用序列，又称强化子。
7.2.3 终止子(terminator )
本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特 殊的RNA结构区内实现终止作用。 依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅 助因子。
7.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序 列为CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱 基（A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成 对启动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动 子功能的重要因素。
基因表达在原核生物与真核生物中的差别 在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行 的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构 基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时， mRNA立 即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完 毕时转译也完成。 在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行 的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连 接，并修饰5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能 在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过 加工、糖化、形成高级结构。
The prokaryotic promoter
5’ -35 -10 16-19 bp 3’
TTGACA T82T84G78A65C54A45
TATAAT 5-9 bp
start site
T80A95T45A60A50T96 Transcriptional
外源基因在植物细胞中的表达
1、电激法：利用高压电脉冲把外源基因导入植物 细胞实现转化的方法。
1985年由斯坦福大学Fromm M等最先将CAT基 因通过电激法导入胡萝卜、烟草、玉米的原生质 体，测得瞬间表达。随后康乃尔大学将外源基因 导入原生质体实现稳定表达。
转化率随质粒DNA浓度、电脉冲强度以及持续 时间增加而增加。
2、基因枪法（particle bombardment） ：是 利用高速微弹粒将外源遗传物质导入细胞或组织 中的方法，也称为微弹射击法、粒子轰击法等。
1985年以后利用该方法将报告基因转入种 植物原生质体，获得瞬间表达或稳定表达。
PEG法转化率低，一般在10-5-10-6。
5、脂质体转化法： 利用磷酸碱或磷酸丝氨酸等脂质构成的 双层膜囊，可以包裹质粒，DNA大分子、病毒 颗粒等，通过脂质体与原生质体融合将外源 基因转入原生质体细胞，或通过注射法实现 转化。 6、真空渗入法： 利用真空作用使外源基因进入植物体，细 胞并实现DNA的整合。
2. 报告基因
报告基因是指用于检测组装的嵌合基因在导入细胞后 是否具有功能的一种指示基因，它通常是编码在离体条件 下易于检测的酶。
具体是将报告基因连接在待研究的目的基因的启动子 的下游，其后再连接真核生物的终止信号，然后将构建的 融合基因转化受体细胞，组织，获得转基因植株。在转基 因植株生长发育的不同阶段，不同器官和组织乃至细胞， 分析其中的报告基因产物-酶活性，从而了解该目的基因 在何时、何处表达。 作为报告基因，其表达产物及产物的类似功能在未转 化细胞中原本并不存在。
（1）新霉素磷酸转移酶（氨基葡萄糖苷磷酸转移酶， neomycin phosphotransferase Ⅱ, NptⅡ）
Npt Ⅱ 基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生 素（如新霉素，庆大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化， 使抗生素失去对细胞的毒性，这是由于磷酸化的抗生素不能 与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，进一步 影响70S起始复合体合成，干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物 合成，使植物细胞最终死亡，因此，与外源基因结合的Npt基 因转化细胞后，就可在含有抗生素的培养基上存活下来。
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。
以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。
质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。
2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。
这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。
3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。
选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。
4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。
这一步通常涉及DNA 连接酶。
5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。
质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。
6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。
这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。
7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。
8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。
这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。
9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。
这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。
整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。
这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。
第七八章-外源基因的表达及其优化策略20201112
略 稳定性 翻 译 的
培养基 环境因素对 受体菌生长 的影响
终止
诱导时间和
密码子
诱导剂量
的选择
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
一 、真核生物基因表达与调控的特点
一 、真核生物基因表达与调控的特点
二 、真核生物基因表达载体的组成特征
基因组DNA的存在形式可影响基因表达 原核DNA序列
转录与翻译不偶联
启动子
调控是多层次的 具有组织和细胞类型特异性
增强子 终止子 内含子 选择标记基因，
对信号分子反应不同
PloyA加尾信号
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
二、真核生物基因表达载体的组成特征
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
根据启动子的功能和作用方式不同，真核基因的表达载体 的启动子可以分为几种类型，每一种类型的优缺点是什么？ 三、真核表达的受体系统 按照宿主细胞的不同，常用外源基因的真核受体系统可大 致分为酵母、职务、昆虫和哺乳动物等受体系统。 每种受体的系统的特征如下表：
原核生物基因表达一般以操纵子为单位 启动子特征：作用要强；必须表现最低水平的基础转录活性；启动
子具有简便和廉价的可诱导性
原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原 特征：SD序列与起始密码子的间距对翻译起始效率影响较大；
核生物的启动子，催化所有RNA的合成 mRNA-rRNA的互补区域越长，基因翻译的概率越大；SD序列与起始
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
四 、合适分离纯化介质的选择 1 、分离纯化蛋白质的材料 理想的蛋白质分离纯化应具有以下几个方面的性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率；在分离纯化过程中不 会造成目标蛋白的变性；化学性能和机械性能稳定，重 复性好；价格低廉，成本低。
实验 7 外源基因在大肠杆菌中的表达(或诱导表达)和检测 (1)
原核（大肠杆菌）表达系统
特点： 表达质粒独立运转表达 基因重组速度快，生产工艺简单， 成本低，表达量较高， 重组蛋白翻译后修饰较差。
1978年，人胰岛素insulin 基因首次表达 目前仍是一个重要的表达系统
应用：活性要求不高的蛋白质 如抗原制备
原核表达系统－E.coli:
transformation
The metal binding domain of the fusion peptide allows simple purification of recombinant proteins by Immobilized Metal Affinity Chromatography with Invitrogen’s ProBond. resin (available in bulk, see page v). The enterokinase cleavage recognition site in the fusion peptide located between the metal binding domain and the recombinant protein allows for subsequent removal of this N-terminal fusion peptide from thepurified recombinant protein.
OD600 = 0.4-0.6
37℃ overnight
IPTG
诱导表达4-6小时，time-course expression
SDS-PAGE分析
Invitrogen
T7 promoter: bases 20-39 Ribosome binding site: bases 84-90 6xHis tag: bases 112-129 T7 gene 10 leader: bases 133-162 Anti-XpressTM epitope: bases 169-192 Multiple cloning site: bases 202-248 pRSET reverse priming site: bases 295-314 T7 transcription terminator: bases 256-385 f1 origin: bases 456-911 bla promoter: bases 943-1047 Ampicillin (bla) resistance gene (ORF): bases 1042-1902 pUC origin: bases 916-2852 (C)
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 细菌的裂解： 常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法； ④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方 法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究 中应用较为广泛。 下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
1、酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳 多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。 主要步骤为： ① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃 上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。 ② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱 氧胆酸（在冷室中进行）。 ③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不 再粘稠。 2、超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎， 在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切 ，大大降低液体的粘稠度。 ① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 离心，15 min ；弃上清，约每 克湿菌加3 mLTE 缓冲液。 ② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g 离心，15min ，分别收集 上清液和沉淀。 ③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS PAGE 。 注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关， 应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
外源基因表达的基本流程
外源基因表达的基本流程包括以下几个关键步骤：克隆：1.1.选择合适的限制性内切酶将外源基因从其原始DNA中切割出来。
2.将切割后的外源基因插入到表达载体（如质粒、病毒载体等）的多克隆位点，确保正确的阅读框和若为分泌型蛋白还需考虑信号肽序列的一致性。
重组载体构建：1.通过连接酶的作用将外源基因与线性化的载体连接起来形成重组DNA分子。
2.验证重组体是否成功构建，通常采用PCR、酶切分析或测序技术。
2.转化：1.将重组载体导入宿主细胞，常见宿主有大肠杆菌、酵母菌或其他哺乳动物细胞系。
2.转化方法可以是电穿孔法、热激法、PEG介导法或者原生质体融合法等。
3.筛选与鉴定：1.在含有合适选择标记（如抗生素抗性基因）的培养基上筛选转化成功的细胞。
2.进一步通过PCR验证、Southern blotting 或 Westernblotting等方法确认外源基因是否已整合入宿主染色体并正确表达。
4.诱导表达（对于可调控表达系统）：1.如果使用的是诱导型表达系统，会在适当时间加入诱导剂（如IPTG对 lac 操纵子的诱导），促使外源基因开始转录和翻译。
5.表达产物检测与纯化：1.表达出的蛋白质可以通过SDS-PAGE、Western blotting等方法进行定性和定量分析。
2.对于需要进一步应用的重组蛋白，还需要通过亲和层析、离子交换层析等多种纯化策略得到高纯度的目的蛋白。
功能鉴定：1.最后，对外源基因编码的蛋白质进行生物学功能的测定，以证明其活性和用途，比如在药物研发、疫苗生产或遗传疾病治疗中的应用。
外源基因表达机制
B）构建重组异源蛋白表达系统 将SD序列和启动子安装在外源基因的5’端 ATG碱基前的正确位置，使外源基因高效表达序 列正确的天然蛋白． C）构建分泌型异源蛋白表达系统 将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因 拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直 接进入到培养基中． 优点：增大表达蛋白的稳定性大大简化后续 的分离纯化步骤．
原核生物启动子
转录起始位点。多数细菌启动子转录起始区序列为 CAT． Pribnow框。在距转录起始位点上游6bp处存在一个六联 体保守序列： TATAAT ，由于中间的碱基位于转录的起始 点上游的 10bp 处，又称为 -10 序列区。少数 Pribnow 框 中间碱基的位置在-9-18之间变化。 Sextama 框。在转录启动区的另一个六联体保守序列位 于距转录起 始位点上游 35bp 处，通常称为 -35 区，该 保守序列为TTGACA，它是 RNA聚合酶的识别位点。 间隔区。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基 组成对启动子的功能并不十分重要。但间隔序列的长 度却是影响启动子功能．
5 绝缘子
* 绝缘子（insulator）：在真核生物基因组中， 既是基因表达的调控元件，也是一种边界元 件．在果蝇和鸡的基因组中已发现多个绝缘子， 它能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启 动子起增强或抑制作用．
* 果蝇中绝缘子SCS和SCS’分别位于果蝇多线染色 体87A7座位hsp70基因两侧的核酸酶高度敏感 区，它们是一种具有顺式调控作用的边界元件， 能使其界定的染色体结构域上的基因免受区域 外两端正调控和负调控信号的影响．
Ⅲ型启动子。 * 内启动子:转录起始位点的下游，如tRNA和5sRNA 的启动子。 * 外启动子:转录起始位点的上游，如脊椎动物U6 核小RNA和7SK RNA启动子，其结构类似于真核生 物Ⅱ型启动子。
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1.原核生物基因表达的特点
与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点： （1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 （2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。 （3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是 连续进行的。 （4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细 胞的转录后加工系统。 （5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对
根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于ρ因子 的转录终止子及不依赖于ρ因子的转录终止子。
（3）S-D序列 S - D 序 列 是 位 于 起 始 密 码 子 （ A U G ） 上 游 3 ~10bp 处 的 由
3~9bp组成的序列。这段序列正好与16S rRNA 3’端序列互 补，是rRNA的识别和结合位点。
列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、增强子、衰减子等序 列。
（1）启动子
启动子(promoter)是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并 能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调 控序列。没有启动子，基因就不能转录。
原核生物的启动子是由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序 列组成。
■-35区（TTGACA）：位于转录起始位点上游的-35bp附近， 是RNA聚合酶初始识别和结合位点。
基因产物的直接控制要慢。 （6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译 起始密码子及16S核糖体RNA 3’ 末端碱基互补的序列，即 S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。
2.原核表达系统的注意事项
从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必 须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和S-D 序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须 满足以下条件： （1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的 酶系统合成外源蛋白。 （2）外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或化学合
5.外源基因在大肠杆菌中的表达部位
（1）不同表达部位 克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有
的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是 以分泌到细胞外的方式表达。 ■细胞质中表达
大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式 存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集 折叠而成的晶体结构。 ■周质中表达
的基因，而不能用基因组DNA。 （3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控 制外源基的表达。 （4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读 框架。 （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外 源基因的表达产物对宿主菌的伤害。
3.原核生物基因表达的调控序列
只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上， 才能够 构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效 率、高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序
周质是指在大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外 膜之间的细胞结构部分。周质中表达的蛋白需要在信号肽的引
导下才能穿越内膜，进入细胞周质。 ■细胞外表达
➢在编码序列的下游紧接着一段人工合成的多克隆位点片断， 包括三个单一酶切位点，Eco RI、Hind III、Bam HI。
（3）融合蛋白表达载体pGEX系统
载体的组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子tac 及lac操纵基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。
这类载体与其它表达载体不同之处在于S-D序列下游是谷胱 甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转 移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基 转移酶和目的基因产物的融合蛋白。
S-D序列存在与否及S-D序列与起始密码子之间的距离，是影 响mRNA翻译成蛋白质的主要因素之一。 （4）增强子
增强子（enhancer)是能够增强启动子转录活性的DNA顺式 作用序列。
4.几种类型的原核表达载体
在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计的不同，总的 来说可以产生融合型和非融合型表达蛋白。不与细菌的任何蛋 白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。融合蛋白指 蛋白质的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列编码，C端 由真核DNA的完整序列编码。
这个载体系统是由pBR322为基础构建的。 ➢带有大肠杆菌最强的启动子之一，即Ipp（脂蛋白基因）启 动子。在启动子的下游装有laclac I）也克隆到这个质粒上。这样目 的基因的表达就成为可调节的了。 ➢在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（SD序列及ATG）。 ➢信号肽序列取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜 蛋白基因）。
■-10区（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶结合于此处 导致DNA双链形成单链。
原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启 动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（λ噬菌体左向和右 向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。
（2）终止子
在一个基因或一个操纵子的3’端往往有一个特定的核苷酸序 列，它有终止转录的功能，这一段DNA序列称为终止子 （terminator)。终止子在结构上有一些共同的特点，即有一 段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C区域具有回文 对称结构，使转录后的RNA具有茎环结构。
（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3
➢具有一个强的tac（trp-lac）启动子，这个启动子是由trp启 动子的-35区、lac UV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列 组成。
➢紧接着tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头，使之很 容易把目的基因定位在启动子和S-D序列之后。
➢在多位点下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的rrnB 核糖体RNA的转录终止子。 ➢载体的其余部分由pBR322组成。 （2）分泌型克隆表达载体pIN III系统