第2章 发酵工业菌种
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发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解
的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
发酵工程2发酵工业菌种(精)
增殖、纯化和性能测定。
1、样品的采集 采样原则： 材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。在一 些极端环境（高温、高压、高盐等），可找到能
适应苛刻条件的微生物类群。
了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物
种类及其生理特征，可提高效率，事半功倍。
2、样品的预处理 目的：提高菌种分离效率。
物理方法：热处理（用于减少样品中的细菌数）；
1、退化的表现
菌落和细胞形态的改变：如苏云金芽孢杆菌的芽
孢和伴孢晶体变得小而少； 生长速度缓慢，产孢子越来越少：如细黄链霉菌 的菌苔变薄、生长缓慢，不再产生典型而丰富的 橘红色分生孢子层；
代谢产物生产能力下降：如藤仓赤霉产赤霉素
能力下降；
抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力
的减弱。
4、菌种分离
平板划线分离法
稀释分离法 涂布分离法
5、菌种的筛选 对菌株的筛选必须要有一个好的方法（最 简单的方法）来加以鉴定，如颜色的变化、抑
菌圈、透明圈等。
四、发酵工业菌种鉴定
1、经典的分类鉴定方法
形态学特征： 生理生化特性： 血清学试验与噬菌体分型： 氨基酸顺序和蛋白质分析：
2、现代分类鉴定方法
2
思考题
发酵工业菌种
1、常见的工业微生物包括哪些类群？
2、作为工业生产菌株应具备哪些基本特性？ 3 、了解发酵工业中的细菌、酵母菌、霉菌、放 线菌及其生产的产品。 4、掌握菌种分离筛选的基本过程。
5、诱变育种及其原理。
6、常用的化学诱变剂。
7、菌种退化、原因与防治。
8、菌种保藏的方法。
广义的微生物：
现象。有些霉菌如用其分生孢子传代易于衰退，
而改用其子囊孢子接种，则能避免退化。 5）采用有效的菌种保藏方法
第二章 菌种的筛选、选育和保藏
1、能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物。 2、有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌 种改造的可操作性要强。 3、遗传性能要相对稳定。 4、不易感染它种微生物或噬菌体。 5、产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上 最好与致病菌无关）。 6、生产特性要符合工艺要求。
菌种的筛选、选育和保藏
造成变异的原因是有： 长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变 作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因 也可能诱发自然突变等。 由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要 通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加 到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，可以看出 这是一个缓慢渐变的过程。
发酵工业菌种的分离、筛选 二、菌种获得的途径
1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵分离筛选的步骤
定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养-菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定
菌种的筛选、选育和保藏
发酵工业菌种的分离、筛选 定方案
菌种的筛选、选育和保藏
菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理（见书P38） 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，
快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、 中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一 般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险 性。
目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的 培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分 离。 常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法 6、小滴分离法
菌种的筛选、选育和保藏
造成变异的原因是有： 长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变 作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因 也可能诱发自然突变等。 由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要 通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加 到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，可以看出 这是一个缓慢渐变的过程。
发酵工业菌种的分离、筛选 二、菌种获得的途径
1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵分离筛选的步骤
定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养-菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定
菌种的筛选、选育和保藏
发酵工业菌种的分离、筛选 定方案
菌种的筛选、选育和保藏
菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理（见书P38） 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，
快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、 中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一 般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险 性。
目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的 培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分 离。 常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法 6、小滴分离法
发酵工程第二章发酵工业菌种
④抑菌圈法 抑菌圈法所用的工具菌是一些抗生素的敏 感菌。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌的平板培养基 上进行培养，若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物 质，如抗生素等，就会在被检菌的菌落周围形成工具菌 不能生长的抑菌圈，从而使被检菌很容易被鉴别出来。 采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。 例如，Meevootison等提出一套利用抑菌圈筛选青霉素 酰化酶产生菌的方法。工具菌是一种对6-氨基青霉烷酸 敏感而对苄青霉素有抗性的黏性沙雷氏菌，这种菌只有 当苄青霉素尚未被别种微生物的青霉素酰化酶转化为6氨基青霉烷酸时才能生长。将工具菌与苄青霉素混合于 平板培养基中，然后将待检菌涂布于平板上，进行培养， 周围出现抑菌圈的菌落就是青霉素酰化酶产生菌。
③生长圈法 生长圈法所用的工具菌是一些营 养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工 具菌并缺少工具菌所需营养物的平板培养基上， 进行培养，若某菌株能合成工具菌所需营养物， 在该菌株的菌落周围就会形成一个浑浊的生长 圈。 例如，用嘌呤缺陷型大肠杆菌作为工具菌，与 不含嘌呤的培养基混合倒平板，在平板培养基 上涂布含菌样品并恒温培养，周围出现生长圈 的菌落即为嘌呤产生菌。
养后，在数量上占优势。
分离：利用分离技术得到纯种。 菌种的筛选： 通过常规生产性能测定，进一步筛选产物合成能
力较高的菌株。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养
特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、 耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
菌种保藏
等。
第二节 发酵工业菌种的分离筛选
菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种 保藏部门索取或购买；
发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育
2、大肠杆菌 (Escherichia coli)
➢ 可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等 ➢ 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸 的定量分析 ➢ 基因工程的很好材料
3、乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.)
➢ 革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧 ➢ 可生产乳酸 ➢ 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作
第一组 长宽比为1～2 细胞多为圆形、卵圆形； 主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包
第二组 长宽比为2 多供生产葡萄酒、果酒用
第三组 长宽比大于2 耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用
啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类：
上面酵母—发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面
下面酵母—发酵度较低，易凝集沉淀
➢ 与一般放线菌不同，菌丝体长入 培养基内，不形成气生菌丝，而在 基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端 生一个球形、椭圆形孢子。
➢ 菌落致密，与培养基紧密结合在 一起，表面凸起，多崎岖，疣状； 菌落常为橙黄色、红色、深褐色、 黑色和兰色。
➢ 可产多种抗生素，如产庆大霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )
【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种
代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物 阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
酶发酵生产常用的微生物
微生物
枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉
生产的酶类
α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢 酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等 糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等 葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核 酸酶等 纤维素酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果 胶酶、纤维素酶等
样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法（浓缩）； 离心法（浓缩） 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特
定微生物的数量。
几丁质——放线菌；CaCO3——嗜碱性放线菌
诱饵法
石蜡、花粉、蛇皮、毛发等
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 选择性分离 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
2.发酵工业菌种
二 ①施加选择性压力
、 发
压力的选择 营养、环境条件
酵
工 ②随机分离法
业
菌 种
抗生素产生菌的分离:如抑菌圈法、稀释法、
的 分
扩散法、生物自显影法
离 筛
酶抑制剂产生菌的分离 体外
选 抗病毒药物产生菌的分离 噬菌斑
发 酵 工 程 — 菌种
6.发酵性能测定
二 、
对筛选出的菌种进行生产性能测定。这些特
发 酵 工
菌 种
须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，
选 育
且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其
常 敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要
规 当心。
育
种
发 酵 工 程 — 菌种
诱变剂的选择
①碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但
三 、
很少使用，回复突变率高，效果不大。
优 良 菌
②亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的 遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙
三 前体或产品的耐受力。
、 优
(4)抑制或消除产品分解酶。
良 菌 种
(5)改进菌种外泌产品的能力。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。
选
育
发 酵 工 程 — 菌种
具体来讲，有以下途径：
㈠提高特定基因的表达水平
三 、
(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效
优 良 菌
表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引 入强启动子；修改现有表达信号，提高基因
二、发酵工业菌种的分离筛选
二 、
典型步骤：样品采集→样品预处理→目标菌 富集→初筛→复筛→发酵性能测试→菌种鉴
发 酵
定→菌种保藏
工
业 菌
第二章发酵工业常用微生物及其培养
河内根霉 [R. tonkinensis Vuille-min]
结节根霉 [R. nodonus Nannyslowski]
甘薯根霉 [R. batas Nakazawa]
小麦曲根霉 [R. tritici Saito] 代氏根霉 [R. delemar (Boidin) Wehemer et
Haannzawa]
• 初级阶段——自然选育
• 发展阶段——代谢控制育种 （近代）
• 高级阶段——从诱发基因突变转向基因 重组，定向育种
第二章 发酵工业常用微生物及培养
4
§2 常用的工业微生物菌种
• 微生物在工业上的用途：
－直接利用微生物菌体 －利用其代谢产物 －利用它的酶
第二章 发酵工业常用微生物及培养
5
一、霉菌（Mould）
乳酸、反丁烯二酸，能转化甾族化合物， 耐高温(45℃能生长)
9.无根根霉 [R. arrhizus Fischer]
功能：能产生乳酸、反丁烯二酸、丁烯二酸， 脂肪酶，能对甾族化合物骨架C-6β、C-11α 起羟化作用
第二章 发酵工业常用微生物及培养
22
少根根霉（低倍镜见假根）
第二章 发酵工业常用微生物及培养
第二章 发酵工业常用微生物 及其培养
•发酵工业对微生物菌种的要求 •常用的工业微生物菌种 •微生物菌种选育和优化技术 •菌种的培养（培养基的设计与优化）
第二章 发酵工业常用微生物及培养
1
• 发酵工业以微生物的生命活动为基础
原核细胞型微生物－细菌、
衣原体、立克次氏体、
•
原核生物界
支原体、螺旋体、蓝绿 藻、放线菌
第二章 发酵工业常用微生物及培养
18
例如：胆固醇
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢酵母菌
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产
第二章 微生物菌种选育
第二章 微生物菌种选育
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
第二章-菌种选育、保藏与复壮
第二章
菌种选育、保藏与复壮
Contents
第一节 食品发酵与酿造工业菌种 第二节 菌种选育 第三节 菌种保藏与复壮 第四节 国内外主要菌种保藏机构
第一节 食品发酵与酿造工业菌种
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；
（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；
（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；
冷冻真 空干燥
低温(-20℃以 下)、干燥、 缺氧
除少数不产孢 子只产菌丝体 的丝状真菌外 均可
5-10年
保藏期长，成活 率高
需特定设备、 操作繁琐,要求 严格
液氮超低 温
2024/7/17
超低温 (-150～196℃)
各类微生物
10年以上
保存时间长
需特殊设备， 操作复杂
51
第四节 国内外主要菌种保藏机构
❖ 广义—— 是指在菌种的生产性状尚未衰退前， 就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的 测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一 种措施。
❖ 狭义—— 指菌种已经发生衰退后，再通过纯 种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找 出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有 典型性状的一种措施。
❖ 复壮的方法
（一）纯种分离
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
（一）引起菌种退化变异的因素
❖ 遗传基因型的分离
丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复 杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离---数量遗传的自体调节现象。
菌种选育、保藏与复壮
Contents
第一节 食品发酵与酿造工业菌种 第二节 菌种选育 第三节 菌种保藏与复壮 第四节 国内外主要菌种保藏机构
第一节 食品发酵与酿造工业菌种
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；
（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；
（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；
冷冻真 空干燥
低温(-20℃以 下)、干燥、 缺氧
除少数不产孢 子只产菌丝体 的丝状真菌外 均可
5-10年
保藏期长，成活 率高
需特定设备、 操作繁琐,要求 严格
液氮超低 温
2024/7/17
超低温 (-150～196℃)
各类微生物
10年以上
保存时间长
需特殊设备， 操作复杂
51
第四节 国内外主要菌种保藏机构
❖ 广义—— 是指在菌种的生产性状尚未衰退前， 就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的 测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一 种措施。
❖ 狭义—— 指菌种已经发生衰退后，再通过纯 种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找 出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有 典型性状的一种措施。
❖ 复壮的方法
（一）纯种分离
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
（一）引起菌种退化变异的因素
❖ 遗传基因型的分离
丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复 杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离---数量遗传的自体调节现象。
第二章发酵工业微生物菌种ppt课件
第二章 发酵工业微生物菌 种制备原理和技术
2019
-
1
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
一、工业微生物的特点 1. 能够利用廉价的原料，或使用来源丰富的原料. 2.菌体温度应适应较高的温度. 3. 遗传性能要相对稳定 4.菌对所采用的设备和生产过程的适应性 5.菌的产物得率和产物在培养基中的浓度 6.产物容易从发酵液（细胞）中提取
2019
-
6
(3) 放线菌 霉菌 放线菌是由不同长短的纤细菌丝所形成 霉菌与人类日常生活密切相关。除了用于传 的单细胞微生物。放线菌是抗生素的主 统的酿酒、制酱油外，近代广泛用于发酵工 要产生菌。除抗生素外，放线菌在甾体 业和酶制剂工业。工业上常用的霉菌，有子 激素生物合成和酶制剂生产上也有广泛 囊菌纲的红曲霉、藻状菌纲的毛霉、根霉和 应用。 犁头霉，以及半知菌纲的曲霉及青霉等
2019 17
自然选育在工业生产上的意义 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
2019
-
18
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验
7. 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 201）细菌 发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽 孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭 状芽孢杆菌大肠杆菌等。 (1) 醋酸杆菌（Acetobacter）：用于酿 醋，把乙醇氧化成乙酸。 (2) 假单胞菌（Pseudomonas）
2019 8
2019
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1
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
一、工业微生物的特点 1. 能够利用廉价的原料，或使用来源丰富的原料. 2.菌体温度应适应较高的温度. 3. 遗传性能要相对稳定 4.菌对所采用的设备和生产过程的适应性 5.菌的产物得率和产物在培养基中的浓度 6.产物容易从发酵液（细胞）中提取
2019
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(3) 放线菌 霉菌 放线菌是由不同长短的纤细菌丝所形成 霉菌与人类日常生活密切相关。除了用于传 的单细胞微生物。放线菌是抗生素的主 统的酿酒、制酱油外，近代广泛用于发酵工 要产生菌。除抗生素外，放线菌在甾体 业和酶制剂工业。工业上常用的霉菌，有子 激素生物合成和酶制剂生产上也有广泛 囊菌纲的红曲霉、藻状菌纲的毛霉、根霉和 应用。 犁头霉，以及半知菌纲的曲霉及青霉等
2019 17
自然选育在工业生产上的意义 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
2019
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18
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验
7. 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 201）细菌 发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽 孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭 状芽孢杆菌大肠杆菌等。 (1) 醋酸杆菌（Acetobacter）：用于酿 醋，把乙醇氧化成乙酸。 (2) 假单胞菌（Pseudomonas）
2019 8
发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：
1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。
第三次平板分离
第三次原种斜面
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
种子培养
1株3-5瓶 较优菌株
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
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第2章 发酵工业菌种
微生物的五大共性
体积小，面积大 吸收多，转化快 生长旺，繁殖快 适应强，易变异 分布广，种类多
到目前为止，人们所知道的微生物种类不到总数的10%，而
真正被利用的还不到1%。
发酵工业应用的微生物可分为：可培养微生物和未培养微生 物。
可培养微生物：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌。 未培养微生物（uncultured microorganisms）：是指迄今所
工业菌种改良方法
（1）解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因 的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量； 在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢 途径。
（2）增加前体物的浓度。
（3）改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对 高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。
取样特点：碳水化合物工业的废弃物
筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液 状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来 筛选高产菌。
第三节
工业菌种的育种方针
工业菌种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定 生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通 过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不 良性质或增加新的性状。
寻找老产品的新的优良菌株。 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：
经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点
选择性 灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计
含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微 生物的可能性大？） 样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可 能性实现） 菌种分离
改进菌种的生长效率
提高菌株对底物的利用率方法：
a. 通过确定并改变代谢中的耗能部分;
b. 由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。 c. 赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能 力，由此可降低操作费用。
有些微生物能在极端的环境下生长
二、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强
遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致 病菌无关）
生产特性要符合工艺要求
选择性分离技术
富集液体培养技术 固体培养技术
施加选择压力，进行定向筛选
A. 富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或
不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件
培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生
长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻 遏；
确定含有所需的辅因子（Co2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+）；
使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
多糖产生菌的筛选
（1）待改良性状的本质及与发酵工艺的关系（如批式或连续
发酵试验）；
（2）对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度； （3）经济费用。
如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采 用随机诱变、筛选及选育等技术。 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则 可选择基因重组等手段进行定向育种。
1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。
分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
获得适于工业发酵菌株 只获得选育所需的出发菌株
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目 的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株 寻找新的发酵产品的产生菌；
新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要 求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把 所需要的菌种挑选出来。 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进 行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的 设备与之配合。
菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌
自然选育→代谢控制育种
3、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使 用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α -淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
4、常用的基因表达系统
(1)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
三、已工业化产品生产菌的介绍
1、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
2、氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点： 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变
菌种选育改良的具体目标
提高目标产物的产量； 提高目标产物的纯度，减少副产物 ；
改良菌种性状，改善发酵过程；
改变生物合成途径，以获得高产的新产品。
初级代谢产物（Primary Metabolism）：是微生物 合成的主要供给细胞生长的一类物质（对自身生长 和繁殖必需的物质） 次级代谢产物（Secondary Metabolism ）：是指由 微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物 质。如抗生素、色素、毒素等是与初级代谢产物（ 如氨基酸、核酸）相对产生的次级代谢产物。
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
(2) 真核细胞表达系统
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
第二节 自然界中有目的微生物分离
从自然界分离的菌种 诱变育种 基因工程 生产用菌种 扩大培养 接种 诱变育种 原 料
发酵罐 灭菌 培养基配制 发酵条件控制
分离 提纯 代谢产物
微生物菌体
产 品
一、菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种 保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、分离思路
三、新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特 性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增 殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、 培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品 品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最 适pH值、提取工艺等。
集目的菌。
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
菌种的营养特征独特
生长特征独特
无选择性特征
选择性分离
根据产物的特征进行 随机分离
选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而 实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术
生长条件的选择与控制原理
控制营养成分
控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件
诱发基因突变→基因重组的定向育种
菌种选择的要求
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的 目的产物产量高、易于回收；
生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；
培养条件易于控制； 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
菌种选择的要求（续）
菌种不易变异退化；
对放大设备的适应性强；
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物 质和毒素。
紫红曲霉
最常用的工业微生物
放线菌（Actinomycetes）
链霉菌属
小单孢菌属
地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
第一节
概述
一、微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长
有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长
有些微生物能进行复杂的代谢
有些微生物能利用较复杂的化合物
（4）抑制或消除产品分解酶。
（5）改进菌种外泌产品的能力。 （6）消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似 物抗性。
提高特定基因的表达水平
（1）引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载 体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修 改现有表达信号，提高基因效力等。 （2）诱导解除基因表达抑制的突变。
发酵工业菌种改良方法
常规育种（诱变育种） 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种
蛋白质工程育种
代谢工程育种
育种过程
包括下列3个步骤：
微生物的五大共性
体积小，面积大 吸收多，转化快 生长旺，繁殖快 适应强，易变异 分布广，种类多
到目前为止，人们所知道的微生物种类不到总数的10%，而
真正被利用的还不到1%。
发酵工业应用的微生物可分为：可培养微生物和未培养微生 物。
可培养微生物：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌。 未培养微生物（uncultured microorganisms）：是指迄今所
工业菌种改良方法
（1）解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因 的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量； 在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢 途径。
（2）增加前体物的浓度。
（3）改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对 高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。
取样特点：碳水化合物工业的废弃物
筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液 状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来 筛选高产菌。
第三节
工业菌种的育种方针
工业菌种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定 生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通 过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不 良性质或增加新的性状。
寻找老产品的新的优良菌株。 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：
经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点
选择性 灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计
含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微 生物的可能性大？） 样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可 能性实现） 菌种分离
改进菌种的生长效率
提高菌株对底物的利用率方法：
a. 通过确定并改变代谢中的耗能部分;
b. 由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。 c. 赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能 力，由此可降低操作费用。
有些微生物能在极端的环境下生长
二、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强
遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致 病菌无关）
生产特性要符合工艺要求
选择性分离技术
富集液体培养技术 固体培养技术
施加选择压力，进行定向筛选
A. 富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或
不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件
培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生
长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻 遏；
确定含有所需的辅因子（Co2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+）；
使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
多糖产生菌的筛选
（1）待改良性状的本质及与发酵工艺的关系（如批式或连续
发酵试验）；
（2）对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度； （3）经济费用。
如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采 用随机诱变、筛选及选育等技术。 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则 可选择基因重组等手段进行定向育种。
1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。
分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
获得适于工业发酵菌株 只获得选育所需的出发菌株
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目 的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株 寻找新的发酵产品的产生菌；
新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要 求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把 所需要的菌种挑选出来。 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进 行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的 设备与之配合。
菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌
自然选育→代谢控制育种
3、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使 用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α -淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
4、常用的基因表达系统
(1)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
三、已工业化产品生产菌的介绍
1、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
2、氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点： 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变
菌种选育改良的具体目标
提高目标产物的产量； 提高目标产物的纯度，减少副产物 ；
改良菌种性状，改善发酵过程；
改变生物合成途径，以获得高产的新产品。
初级代谢产物（Primary Metabolism）：是微生物 合成的主要供给细胞生长的一类物质（对自身生长 和繁殖必需的物质） 次级代谢产物（Secondary Metabolism ）：是指由 微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物 质。如抗生素、色素、毒素等是与初级代谢产物（ 如氨基酸、核酸）相对产生的次级代谢产物。
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
(2) 真核细胞表达系统
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
第二节 自然界中有目的微生物分离
从自然界分离的菌种 诱变育种 基因工程 生产用菌种 扩大培养 接种 诱变育种 原 料
发酵罐 灭菌 培养基配制 发酵条件控制
分离 提纯 代谢产物
微生物菌体
产 品
一、菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种 保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、分离思路
三、新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特 性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增 殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、 培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品 品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最 适pH值、提取工艺等。
集目的菌。
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
菌种的营养特征独特
生长特征独特
无选择性特征
选择性分离
根据产物的特征进行 随机分离
选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而 实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术
生长条件的选择与控制原理
控制营养成分
控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件
诱发基因突变→基因重组的定向育种
菌种选择的要求
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的 目的产物产量高、易于回收；
生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；
培养条件易于控制； 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
菌种选择的要求（续）
菌种不易变异退化；
对放大设备的适应性强；
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物 质和毒素。
紫红曲霉
最常用的工业微生物
放线菌（Actinomycetes）
链霉菌属
小单孢菌属
地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
第一节
概述
一、微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长
有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长
有些微生物能进行复杂的代谢
有些微生物能利用较复杂的化合物
（4）抑制或消除产品分解酶。
（5）改进菌种外泌产品的能力。 （6）消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似 物抗性。
提高特定基因的表达水平
（1）引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载 体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修 改现有表达信号，提高基因效力等。 （2）诱导解除基因表达抑制的突变。
发酵工业菌种改良方法
常规育种（诱变育种） 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种
蛋白质工程育种
代谢工程育种
育种过程
包括下列3个步骤：