微生物工程 - 教案07

（一）分批灭菌
又称实罐灭菌或实消，是将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽加热，达到灭菌温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度。
投资少，设备简单，灭菌效果可靠；但加热和冷却时间长，培养基养分受到破坏。
一般蒸汽压力在0.3~0.4MPa；是中小型发酵罐常用的灭菌方法。
（二）培养基连续灭菌
第一节灭菌原理与方法
灭菌（sterilization）是指利用物理或化学方法，杀灭或去除物料或设备中所有微生物的技术或工艺过程。灭菌方法有化学物质灭菌、辐射灭菌、过滤介质除菌和热灭菌等。
一、化学物质灭菌
通过改变微生物细胞膜的渗透性，或者损伤细胞膜，影响微生物细胞的正常代谢。
不适合于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。
二、微生物的热死规律
对微生物进行湿热灭菌时，死亡速率可视为一级反应，即微生物的死亡速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律，其数学表达式为：
-dN/dt=kN积分得lnN/N0=-kt或N=N0exp(-kt)
式中N——存在的活菌数，个；
N0——当t=0时，培养基中的活菌数，个；
t——灭菌时间，s；
一、实验室培养基灭菌
1.高压蒸汽灭菌法Hale Waihona Puke 121℃灭菌15~30min
2.液体除菌器
对于热不稳定、体积小的液体培养基，不适合用高压蒸汽灭菌，可采用过滤除菌的方法。此法的最大优点是不破坏培养基中的化学成分。
种类很多，有瓷质、玻璃制、石棉制以及火胶棉等。比如滤膜过滤器。
二、大生产培养基灭菌
工业生产中培养基的灭菌方法有分批灭菌和连续灭菌2种。
授课题目
灭菌技术
授课类型
理论
首次授课时间
2011年10月19日
学时
2
教学目标
1．了解灭菌的方式方法，区别几种灭菌方式的相同点和不同点；
2．了解实验室培养基灭菌及工业灭菌的特点及操作方法；
3．了解空气灭菌的基本方法，掌握典型的空气除菌流程。
重点与难点
微生物的热死规律
教学手段与方法
教学模式：启发讲解与学生讨论相结合。
2.发酵对空气无菌程度的要求
一般控制染菌概率为10-3，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许1次染菌。
通常细菌繁殖一代只需20~30min，如果进入一个细菌，繁殖15h后，即可达到109个，使发酵受到严重干扰。
发酵用的无菌空气，是将自然界的空气经压缩、冷却、减湿、过滤等过程，达到以下标准：
（1）连续提供0.1~2.0VVM（单位时间min单位体积m3培养基中通入标准状况下的空气体积m3）的压缩空气；（2）空气压强为0.2~0.4MPa；（3）进入过滤器前，空气相对湿度≤70%；（4）进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10~30℃；（5）压缩空气的洁净度一般以失败概率10-3为指标。
培养基营养成分受热破坏也可看做一级反应，即
式中c——对热不稳定物质的浓度，mol/L；
kd——分解速率常数，s-1。
温度升高时，微生物死亡速率的增加，比营养成分的分解速率的增加大得多。因此，在较高温度下可以通过缩短灭菌时间而减少营养成分的损失，这是高温瞬时灭菌法（HTST）的理论基础。
第二节培养基灭菌
将配好的培养基在向发酵罐输送的过程中灭菌，要经过加热、保温、冷却过程，也称连消。
加热、保温、冷却3个阶段分别在不同的专有设备中进行。
灭菌温度比分批灭菌更高，灭菌时间缩短，营养物质破坏减少；但设备比较复杂，投资较大。
蒸汽压力一般高于0.5MPa
第三节空气除菌
好氧发酵过程都需要氧气，通常以空气作为氧源。
k——速率常数或死亡比速率常数，s-1。死亡比速率k的绝对值反映了微生物耐热性的强弱，k越大，表明微生物越易死亡。
在某一恒定温度下，以细胞数N对时间作图，可得到图5-1。P69
从图中可以看出，如果要达到彻底灭菌，即N=0，所需的灭菌时间t为无限长，这在生产上是不可行的。为了达到一定的无菌水平Nst，显然需要一定的灭菌时间tst，通常Nst值约为10-4个细胞/ml。
三、过滤介质除菌
工业上利用过滤的方法制备大量的无菌空气，供好氧微生物的深层培养使用。
四、干热灭菌
火焰灼烧法
干热空气灭菌法：140~160℃维持2~3h。
五、湿热灭菌
湿热灭菌条件为121℃维持20~30min。
巴氏杀菌（Pasteurization）低温消毒法，主要应用于生产酸奶乳制品。目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种：
教学手段：板书。
教学过程：（包括授课思路、过程设计、讲解要点及各部分具体内容、时间分配等）
授课过程：
第五章灭菌技术sterilization
为什么要灭菌？（杂菌污染的后果）
1.营养基质或产物被消耗损失；
2.抑制生产菌的生长；
3.抑制产物的生物合成；
4.杂菌繁殖导致培养液性质（如pH）改变，造成生物反应异常。
乙醇：脱水、使蛋白质变性和沉淀，70~75%最有效。
二、辐射灭菌
紫外线：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；空气在紫外线照射下产生臭氧，臭氧也具有一定的杀菌作用。
X射线、γ射线：能量极高，被菌体吸收后，菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、过氧化氢和有机过氧化物，这些过氧化物阻碍微生物的代谢活动而导致菌体迅速死亡。
2.除油除水：通常要求通过空气过滤器的压缩空气的相对湿度在50%~60%为好。
（二）空气过滤除菌设备
P90图5-10
1.粗过滤器2.空气压缩机3.空气冷却器4.分水器5.空气储罐6.旋风分离器7.丝网分离器8.加热器9.过滤器10.发酵罐
思考题、讨论题、作业
讨论：微生物人工代谢调节的应用实例。
教学后记
绝对过滤：过滤介质的滤孔小于细胞和孢子，如多孔的聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF）经热处理制成孔径小于0.3μm的滤膜（空气中的菌体大小一般0.5~5μm），或纤维素、硅酸硼纤维、聚四氟乙烯等；用于医疗和特种发酵。
深层（介质）过滤：介质孔隙一般大于微生物细胞，必须有一定的厚度。利用惯性撞击截留作用（或惯性碰撞滞留作用）除菌。棉花、玻璃纤维、合成纤维、颗粒活性炭等。工厂、实验室广泛采用。
四、空气除菌流程
（一）压缩空气的预处理
空气过滤除菌并输送要利用空气压缩机或鼓风机。空气压缩后往往温度较高，冷却后会释出水分，压缩过程中可能夹带机器润滑油，这些水、油很容易污染空气过滤器，影响过滤效果，因此需要进行预处理。
1.冷却：压缩后的空气温度很高，高温空气可能引起过滤介质的炭化或燃烧，还会增加发酵液水分的蒸发，影响微生物生长，因此压缩空气在进入空气过滤器前必须冷却降温。
除菌方法有：干热杀菌、辐射杀菌、静电除菌、过滤除菌等。
一、发酵对空气质量的要求
1.空气中的微生物
空气中的微生物多为细菌、孢子，也有霉菌、酵母和病毒，大小从几微米到几十微米不等。
空气中微生物数目的数量级一般为103~104个/m3，每提高2.5m，空气中的微粒数可减少一个数量级。
一般情况下悬浮在空气中的微生物大多是能耐恶劣环境的孢子或芽孢，繁殖需要较长的调整期，但在阴雨天气或环境污染严重时，空气中也会悬浮大量的活力较强的微生物，在培养条件良好时，只要很短的调整时间，即可进入对数生长期而大量繁殖，这也是为什么阴天下雨时容易发霉的原因。
一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。
第二种方法将牛奶加热到75~90℃，保温15~16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。
（一）无机酸、碱及盐类
酸碱的杀菌能力主要由其电离度而定，电离出得氢离子或氢氧根离子浓度越高，杀菌力越强。
盐溶液的杀菌力与其浓度成正比。（腌咸菜可以保藏很长时间而不染菌）
（二）重金属盐
杀菌原理是重金属盐使细胞中蛋白质失活。比如升汞。服食牛奶、鸡蛋等高蛋白含量食物可解毒。
（三）氧化剂
高锰酸钾
（四）有机化合物
二、空气除菌方法
辐射杀菌、加热杀菌、化学物质杀菌等，都是使有机体的蛋白质变性而破坏其活性。
静电吸附和介质过滤的方法是把微生物分离出去。
过滤除菌法是目前发酵工业中经济适用的空气除菌方法。
三、过滤除菌机理
过滤除菌法，是让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所有微生物，而取得无菌空气。
分为绝对过滤和深层介质过滤2类。