可用-APOE_4等位基因与尿AD7c_省略_测在阿尔茨海默病早期诊断中的价值_郑磊

APOE ε4等位基因与尿AD7c-NTP 联合检测在阿尔茨海默病早期诊断中的价值郑磊张凤春1李玉妹1袁栋才1魏琰1（哈励逊国际和平医院中心实验室，河北衡水053000）〔摘要〕目的探讨载脂蛋白ε4（APOE ε4）等位基因与尿阿尔茨海默病（AD ）相关神经丝蛋白（AD7c-NTP ）联合检测在AD 早期诊断中的价值。

方法根据精神疾病诊断与统计手册（DSM-Ⅳ）和美国国立神经病、语言交流障碍和卒中研究所-老年性痴呆及相关疾病学会（NINCDS-ADＲ-DA ）有关AD 的诊断标准，将临床诊断疑似AD 患者156例归为疑似AD （PAD ）组，另选120例健康者作为对照组。

分别检测各组APOE ε4等位基因频率和尿AD7c-NTP 含量。

结果①APOE ε4等位基因表达频率在PAD 组显著高于对照组（P ＜0.01）；②尿AD7c-NTP 在PAD 组中的含量较对照组显著升高（P ＜0.01）；③APOE ε4与AD7c-NTP 联合检测具有较好的诊断价值。

结论APOE ε4等位基因与尿AD7c-NTP 联合检测是监测及诊断AD 早期病变的较好指标，提升二者单独应用时的预测价值，为AD 早期诊断及疗效监测提供参考。

〔关键词〕阿尔茨海默病；阿尔茨海默病相关神经丝蛋白；载脂蛋白E ε4；早期诊断〔中图分类号〕Ｒ749〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2016）12-2914-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.041基金项目：河北省2013年医学科学研究课题计划指导性课题（No．20130345）；哈励逊国际和平医院研究生课题（No．201202）1哈励逊国际和平医院神经内科第一作者：郑磊（1983-），男，主管检验师，硕士，主要从事细胞生物学研究。

阿尔茨海默病（AD ）是一种严重的神经退行性疾病，临床上以记忆损失和认知功能下降为主，是老年痴呆的常见形式，极大的威胁老年人的生命及健康〔1〕。

目前，AD 的诊断主要依据患者临床表现并结合电子计算机X 射线断层扫描技术，核磁共振及神经心理学量表等综合评价。

然而，由于AD 的潜伏期较长，从症状出现到确诊一般要3年左右时间，且在AD 确诊时患者多已存在明显的神经元损害，而此时进行药物干预治疗的效果有限〔2〕。

因此，探寻准确特异的生物标记物早期鉴别诊断AD 易发人群，实现AD 早发现早治疗的目标已势在必行。

本研究旨在探讨APOE ε4等位基因与尿AD7c-NTP 联合检测在AD 早期诊断中预测效果及临床意义。

1资料与方法1.1研究对象2012年6月至2014年3月我院神经内科收治患者276例。

入组标准：①符合美国精神障碍诊断和统计手册（DSM-Ⅳ）及美国国立神经疾病、语言沟通障碍和脑卒中研究所-阿尔茨海默病及相关疾病学会（NINCDS-ADＲDA ）有关AD 的诊断标准，由2名副高职称以上的神经科医师明确诊断；②按照简易智能状态量表（MMSE ）评分标准，临床诊断为认知功能正常者MMSE 评分均≥25分，临床诊断疑似AD 患者MMSE 评分均在10 26分；③按照临床痴呆评定量表（CDＲ）判定AD 痴呆的严重程度，并根据CDＲ值进行分组，其中CDＲ=0为正常健康对照组，CDＲ=1为轻度痴呆组，CDＲ=2为中度痴呆组，CDＲ=3为重度痴呆组。

排除标准：①长期大量服用抗精神病药物和曾有严重头部外伤史；②患者累及中枢神经系统功能的内科疾病；③患有严重精神疾病患者；④认知功能检查过程不能配合的患者。

按照以上标准，共收集认知功能正常者120例〔对照组，平均年龄（70.4ʃ8.2）岁，MMSE （29.7ʃ1.4），CDＲ=0，临床诊断疑似AD （PAD ）患者156例（PAD 组），平均年龄（72.2ʃ9.2）岁，MMSE （16.2ʃ2.6），CDＲ=2〕，各组在年龄，性别，教育年限方面差异无显著性（P ＞0.05）。

1.2研究方法1.2.1样本采集所有研究对象空腹抽取静脉血10ml ，采用肝素锂抗凝保存，常温保存时间不多于24h ，晨尿30 50ml ，4ħ保存时间不多于7d 。

1.2.2限制性内切酶基因亚型分型利用Hixson 等〔3〕的PCＲ及限制性内切酶APOE 基因亚型分型方法，通过红细胞裂解液分离静脉血样本（10ml ）中的白细胞，白细胞经预冷的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，提取基因组DNA 进行基因扩增，扩增引物为F4（5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3'）和F6（5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'），扩增产物经Hha Ⅰ酶切（酶切位点为GCGC ）后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳后分离条带的位置及数量区分不同的APOE 等位基因亚型。

1.2.3酶联免疫吸附检测尿AD7c-NTP 酶联免疫吸附检测试剂盒购自深圳市安群生物工程有限公司，严格按试剂说明书操作。

1.3统计学方法采用SPSS17.0软件行t 及χ2检验。

2结果2.1APOE 等位基因在对照组、PAD 组中表达频率的比较PAD 组APOE ε4等位基因较对照组的表达频率显著提高（χ2=16.53，P ＜0.01），而APOE ε2或ε3等位基因对照组和PAD 组间中表达频率无差异（P ＞0.05），见表1。

表1APOE 等位基因在各组的表达频率〔n （%）〕组别nε2ε3ε4PAD 组15615（9.62）72（46.15）69（44.23）对照组12016（13.33）79（65.83）25（20.83）·4192·中国老年学杂志2016年6月第36卷2.2两组尿样AD7c-NTP的含量PAD组尿样中AD7c-NTP 的含量较对照组显著升高〔（4.62ʃ1.53）ng/ml vs（1.28ʃ1.16）ng/ml，t=19.91，P＜0.01〕。

PAD组1.44ng/ml患者比例〔78.85%（123/156）〕明显高于对照组〔16.67%（20/120），P ＜0.05〕。

2.3APOEε4与AD7c-NTP联合诊断与单独诊断比较尿AD7c-NTP水平在APOEε4等位基因阳性的患者中显著升高〔（5.36ʃ1.64）vs（3.52ʃ1.42）ng/ml，t=7.53，P＜0.01〕，PAD 组中APOEε4阳性者ADTC-NTP值＞14.4ng/ml的患者比例高于阴性者〔91.30%（62/69）vs70.11%（61/87），P＜0.05〕。

此外，相比于APOEε4等位基因阴性患者，该基因阳性的患者在平均发病年龄上明显提前〔（62.22ʃ8.72）vs（76.53ʃ9.36）岁，t=9.85，P＜0.01〕。

3讨论预计到2050年，全世界将有8000万人遭受AD困扰〔4〕。

由于AD病因及发病机制尚未阐明，现有以AD病理特征为基础的病理学检测仍为AD诊断的金标准，然而AD病理检测活检受限，加之结果受检测人员专业素养和主观性影响，使其无法满足临床对AD早期诊断的迫切需求〔5 7〕。

因此，探寻准确特异的生物标记物早期诊断鉴别AD易发人群，监测病程进展和药物疗效，以实现AD早发现早治疗的目标已势在必行。

近期，全基因组关联研究证实，APOE基因多态性与AD发病风险关系密切，其APOEε4等位基因是AD最强的遗传危险因素，与早发性和迟发性AD发病风险增加呈正相关〔8，9〕。

已经证实，APOEε4以剂量相关方式增加AD的发病率并使患者发病年龄提前，Farrer等〔10〕研究发现，91%的APOEε4纯合基因携带者在68岁左右发病，而在APOEε4非携带者中，仅20%的人在85岁时才发生AD。

研究表明，APOE与Aβ代谢密切相关，其中，APOEε4可强烈影响Aβ沉积所形成的老年斑，并促进脑淀粉样血管病发生，而二者正是AD最主要的病理特征〔11 15〕。

此外，APOE还与AD其他的风险因子密切相关，已经证实，APOEε4可通过与动脉粥样硬化，周围血管疾病及2型糖尿病等协同作用增加AD的发病风险。

近年来，APOEε4作为AD发病的风险因子正逐渐成为探索AD发病机制的热点，然而单纯的以APOEε4等位基因预测AD仍存在一些局限。

如Itabashi等〔16〕研究发现，仅通过APOEε4诊断AD的敏感度和特异度不高（50%左右），且不能有效监测AD病程进展和药物疗效。

因此，单独应用APOEε4作为AD诊断的生物标记物时，应结合其他生物标记物联合诊断以提高其在AD早期诊断的价值。

已经证实，早期AD患者脑脊液和尿液中AD7c-NTP的表达水平都选择性增加〔17〕。

AD7c-NTP属神经丝蛋白家族的一个成员，AD7c-NTP主要存在于组织学尚完整的变性神经元中的表达增加，待神经元细胞衰亡后，大量的AD7c-NTP被释放到脑脊液中，后经尿液排出。

de la Monte等〔18〕发现，在AD病程的早期AD7c-NTP基因过度表达，从而引起AD7c-NTP免疫活性的增强，进而导致磷酸化tau蛋白免疫介导的细胞骨架病变，但AD7c-NTP不参与淀粉样蛋白的聚积。

越来越多的证据表明，AD7c-NTP的异常变化是AD病程早期的生物学事件，其在脑脊液和尿液中的含量与AD疾病的严重程度呈正相关〔19，20〕。

若脑脊液或尿液中含量异常增高，早期可疑或可能AD占62%，死后确定诊断的AD占84%。

然而，有对脑脊液中AD7c-NTP进行检测有损伤大脑的风险，且需专业人员及特殊设备，使其在应用时存在一定的局限性。

AD患者尿液中AD7c-NTP的水平较正常老人显著增加，与年龄无关。

尿AD7c-NTP诊断早期AD的特异度为90%，灵敏度为80% 85%，与脑脊液标本的检测相比具有取材简单、无创、易复查等特点，使其在AD早期诊断具有较好的应用价值〔17〕。

本研究证实，在疑似AD患者中，APOEε4等位基因的表达频率显著增高，而尿AD7c-NTP的水平亦显著升高，二者的变化与AD疾病早期进展关系密切。

通过APOEε4与AD7c-NTP 联合检测可互补二者在单独应用时的不足，提升AD诊断的预测价值，可为AD易发人群筛查及早期诊断提供生物学参考。

4参考文献1Alzheimer's Association.2012Alzheimer's disease facts and figures〔J〕．Alzheimers Dement，2012；8：131-68.2Liu CC，Kanekiyo T，Xu H，et al．Apolipoprotein E and Alzheimer dis-ease：risk，mechanisms and therapy〔J〕．NatＲev Neurol，2013；9（2）：106-18.3Hixson JE，Vernier DT.Ｒestriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaI〔J〕．J LipidＲes，1990；31（3）：545-8.4Humpel C.Identifying and validating biomarkers for Alzheimer's disease 〔J〕．Trends Biotechnol，2011；29（1）：26-32.5Mullard A.Sting of Alzheimer's failures offset by upcoming prevention tri-als〔J〕．NatureＲev Drug Discov，2012；11（9）：657-60.6Herrmann N，Chau SA，Kircanski I，et al．Current and emerging drug treatment options for Alzheimer's disease：a systematic review〔J〕．Drugs，2011；71：2031-65.7Lu B，Nagappan G，Guan X，et al．BDNF-based synaptic repair as a dis-ease-modifying strategy for neurodegenerative diseases〔J〕．NatＲev Neu-rosci，2013；14（6）：401-16.8Harold D，AbrahamＲ，Hollingworth P，et al．Genome-wide association study identifies variants at CLU and PICALM associated with Alzheimer＇s disease〔J〕．Nat Genet，2009；41（10）：1088-93.9Huang Y，Mucke L.Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies 〔J〕．Cell，2012；148（6）：1204-22.10Farrer LA，Cupples LA，Haines JL，et al．Effects of age，sex，and ethnici-ty on the association between apolipoprotein E genotype and Alzheimer disease.A meta-analysis.APOE and Alzheimer Disease Meta Analysis Consortium〔J〕．JAMA，1997；278（16）：1349-56.11Bu G.Apolipoprotein E and its receptors in Alzheimer's disease：path-ways，pathogenesis and therapy〔J〕．NatＲev Neurosci，2009；10（5）：333-44.12Kok E，Haikonen S，Luoto T，et al．Apolipoprotein E-dependent accumu-lation of Alzheimer disease-related lesions begins in middle age〔J〕．Ann Neurol，2009；65（6）：650-7.13Barthel H，Gertz HJ，Dresel S，et al．Cerebral amyloid-βPET with flor-betaben（18F）in patients with Alzheimer's disease and healthy controls：·5192·郑磊等APOEε4等位基因与尿AD7c-NTP联合检测在阿尔茨海默病早期诊断中的价值第12期a multicentre phase 2diagnostic study 〔J 〕．Lancet Neurol ，2011；10（5）：424-35.14Castellano JM ，Kim J ，Stewart FＲ，et al ．Human apoE isoforms differenti-ally regulate brain amyloid-βpeptide clearance 〔J 〕．Sci Transl Med ，2011；3（89）：89-57.15Deane Ｒ，Sagare A ，Hamm K ，et al ．apoE isoform-specific disruption of amyloid beta peptide clearance from mouse brain 〔J 〕．J Clin Invest ，2008；118（12）：4002-13.16Itabashi S ，Arai H ，Matsui T ，et al ．Absence of association of alpha1-an-tichymotrypsin polymorphisms with Alzheimer's disease ：a report on au-topsy-confirmed cases 〔J 〕．Exp Neurol ，1998；151（2）：237-40.17Levy S ，McConville M ，Lazaro GA ，et al ．Competitive ELISA studies of neural thread protein in urine in Alzheimer's disease〔J 〕．J Clin Lab A nal ，2007；21（1）：24-33.18de la Monte SM ，Wands JＲ.The AD7c-NTP neuronal thread protein bio-marker for detecting Alzheimer's disease 〔J 〕．Front Biosci ，2002；7：d989-96.19de la Monte SM ，Wands JＲ.Alzheimer-associated neuronal thread pro-tein-induced apoptosis and impaired mitochondrial function in human-central nervous system-derived neuronal cells 〔J 〕．J Neuropathol Exp Neurol ，2001；60（2）：195-207.20Youn YC ，Park KW ，Han SH ，et al ．Urine neural thread protein meas-urements in Alzheimer disease 〔J 〕．J Am Med Dis Assoc ，2011；12（5）：372-6.〔2014-12-30修回〕（编辑赵慧玲/曹梦园）针灸百会、涌泉穴治疗老年性痴呆的临床效果魏艳霞张保朝1周静2苟成钢3（南阳市中心医院康复科，河南南阳473000）〔摘要〕目的探讨老年性痴呆应用针灸百会、涌泉穴治疗的临床疗效及其临床应用价值。