生物 土壤中分解尿素的细菌的分离及其计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数定稿(1)
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数定稿(1)土壤中分解尿素的细菌的分离与计数定稿
土壤是支撑着植物生长的基础，其中微生物的数量和种类极其丰富。
其中，分解尿素的细菌是土壤中的一类重要微生物。
在真正的农业生
产和管理中，了解这些细菌数量的多少和多样性对于我们的作物生产
和土壤管理都极为关键。
分离土壤中的分解尿素细菌
分离土壤中的分解尿素细菌需要使用可培养的培养基。
常见的培养基
包括氯化钠泥土饼子培养基(CTN)和双氧水泥土饼子培养基(H2O2-CTN)等。
将采样的土壤样本分别放入这些培养基中，应用平板计数法进行
分离，同时进行不同培养时间段后分离细菌的数量计数，可将单菌株
分离得到。
在实验室中许多实验室均有自己的培养基制备和微生物分
离技术，这些基础技术对于微生物研究至关重要。
计数分解尿素细菌数量
在分离到分解尿素细菌后，需要对其进行数量计数。
在实验室中，通
常采用融合熔体计数法、荧光显微成像法、荧光定量PCR等方法计数。
使用融合熔体计数法时，将细菌在恰当时间生长后，用水溶性荧光染
料进行染色。
然后，使用荧光显微镜对染色进行检查，计算细胞数。
荧光定量PCR相比传统方法有所改进，可以精确和快速地计数给定DNA 段在样品中的存在情况。
总结
分离和计数分解尿素细菌的数量是研究土壤中微生物丰富性的关键方面，对于农业生产和土壤管理也十分重要。
熟练掌握培养基制备、分离技术和计数方法，将为研究分解尿素细菌数量提供有力手段。
完整版：土壤中分解尿素细菌分离与计数
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30— —300的平板，则说明稀释操作比较成功， 并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数 的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不 精确，需要重新实验。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进 行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
这个实例可以看出，实验结果要有说服力， 对照的设置是必不可少
二、实验设计
实验流程：
土壤取样 制备培养基 样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察
菌落计数
（一）土壤取样
“微生物的天然培养基” 数量最大、种类最多 大约70%—90%是细菌
鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存 1、酚红培养基：
鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→ 培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶 阳性 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红—美蓝结 合→ 菌落呈深紫色并带有金属光泽。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去 表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用 前都要灭菌。
（二）制备培养基 制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？ （对照作用）
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落 数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋 白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起 到了选择作用。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3g 3g 2g 3g 10g 15g 1.4g 2.1g 1.0g 0.2g 10g 15g：
配方如下： KH2PO4 Na2HPO4 尿素 MgSO4.7H2O 葡萄糖 琼脂 1.4g 2.1g 1.0g 0.2g 10g 15g
问题2：如何对分离出的细菌进行计数？ 稀释涂布平板法：常用于统计样品中活菌的数目
课题背景
尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌 将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2) + H2O 脲酶
2NH3 + CO2
专题2
微生物的培养与应用
课题2 土壤中分解尿素的细菌 的分离与计数
需要解决的两个问题：
1、如何分离土壤中分解尿素的细菌？ 2、如何对分离出的细菌进行计数？
问题3：如何设置本实验的对照实验？
思路： 配制大多数细菌都能生长的牛肉膏蛋白 胨培养基作对照，用来判断选择培养基是否 起到了选择作用。 现象： 在相同的稀释倍数下，在牛肉膏蛋白胨 培养基上生长的菌落数应该明显多于选择培 养基上的数目
请根据本节课的研究思路，通过小组讨论 完成该实验完整的实验流程 ② ③ ① ④ ⑤
原理：
平板上 菌落数
推测
样品中 活菌数
问题2：如何对分离出的细菌进行计数？
实例分析：（教材P22）
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的 注意事项： 细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以 1、一定要涂布至少三个平板，舍弃相差太远的数值， 下两种统计结果。 求平均值 1、第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的 菌落数为230. 2、为了保证结果准确，一般选择平板的菌落数在 2、第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的 30—300之间进行计数。 菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板 3、统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。 上菌落数的平均值作为统计结果。 你认为哪位同学的结果更接近真实值？ 你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要， 如何改进。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案尿素是一种含氮有机化合物，广泛用作化肥和动物饲料。
土壤中的细菌可以通过分解尿素来获取氮元素，从而促进土壤微生物群落的生长和发展。
为了研究土壤中分解尿素的微生物群落，可以进行以下实验：
1.采集土壤样品，将其通过蒸馏水过滤器过滤，以去除大颗粒物和悬浮物。
2.将过滤后的土壤样品接种到含有尿素的培养基中，利用不同的培养条件(如温度、pH值、氧气含量等)筛选出适宜于生长的细菌。
3.将筛选出的细菌进行单一克隆培养，然后通过染色、显微镜观察和生化测试等方法对其进行鉴定和分类。
4.最后，可以利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验步骤：
1.收集土壤样品，通过蒸馏水过滤器过滤。
2.制备含尿素的培养基，分别设置不同的培养条件，如温度、pH 值、氧气含量等。
3.将过滤后的土壤样品接种到培养基中，进行培养。
4.观察培养基中是否有细菌生长，记录细菌的数量和形态特征。
5.对生长的细菌进行单一克隆培养，然后进行鉴定和分类。
6.利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验注意事项：
1.在实验过程中要注意卫生，避免污染。
2.制备培养基时要严格按照配方和操作步骤进行。
3.培养时要控制好温度、pH值、氧气含量等条件，以便筛选出适宜于生长的细菌。
4.鉴定和分类时要准确和细致，避免误判。
5.计数时要进行多次重复，以提高结果的精度和可靠性。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【土壤中分解尿素的细菌的分离和计数】一、研究思路1．筛选菌株尿素是一种重要的肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为和CO2，才能被植物利用，土壤中的这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成。
可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。
(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于_____ _生长的条件(包括营养、、pH等)，同时____ _或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
2．统计菌落数目(1)常用来统计样品中数目的方法是__________ _______。
即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中。
通过统计平板上的，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
例如每克样品中的菌株数= ,C代表 ,V代表 ,M代表。
通常统计出的菌落数比活菌的实际数目。
这是因为。
因此，统计结果一般用而不是活菌数来表示。
(2) 也是测定微生物数量的常用方法。
(3)细菌的数目还可以通过法来测定。
例如，测定饮水中大肠杆菌的数量，可将的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现色，可以根据培养基上的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。
在该实验中至少应取___个水样。
3．设置对照(1)设置对照的主要目的是排除实验组中___________对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用______________________________ 作为空白对照。
(2)对照实验是指除了的条件外，其他条件都的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
二、实验设计实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的以及时间安排等的综合考虑和安排。
关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1．土壤取样土壤微生物约70%～80%为，主要分布在距地表的近性土壤中。
实验03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、实验原理：（1）土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成尿酶。
（2）配置以尿素为唯一氮源的培养基，能够在这个培养基上生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
二、操作步骤：(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。
(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。
细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
②观察a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。
2、灭菌培养基：高压蒸汽灭菌法3、培养皿灭菌：干热灭菌法三、操作提示(1)无菌操作①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在酒精灯火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需注意的问题(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
(3)为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然因素对实验结果的影响。
(4)分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
(5)为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
况下进行培养，作为空的白实对验照，其，作以用证是比明照培实养验 基是
否受到污染。
组，排除任何其他可能原因 的干扰
通过这个事例可以看出，实验结果要 有说服力，对照的设置是必不可少的。
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三.实验的具体操作
（一）.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土
3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信
思考： 1、科学家为什么能从热泉中筛选出耐高温的Taq细菌？
因为热泉温度为70～800C，淘汰了绝大多数微生物只 有Taq细菌被筛选出来。
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2、从上述资料中你能得到什么启示？ 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的
要求，到相应的环境中去寻找。
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实验室中微生物的筛选，也是应用同样的原 理：即人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括 营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物 生长。也就是利用选择培养基筛选出你想要的目 的菌株。
强，pH升高。那么我们就可以在
以尿素为唯一氮源的培养基中加
入酚红指示剂。培养某种细菌后，
如果PH升高，指示剂变红，说明
该细菌能够分解尿素。
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滤膜法： 测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积
的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培 养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记数得 出水样中大肠杆菌的数量。
里样品中微生物的数量。 2、稀释涂布平板法——活菌数（最常用） 3、滤膜法
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稀释涂布平板法：
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的
一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌， 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中 大约含有多少活菌。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
基础知பைடு நூலகம்：
（一）筛选菌株
KH2PO4
1.4g
NaH2PO4
2.1g
MgSO4`7H2O 葡萄糖
0.2g 10.0g
尿素 琼脂
选择培养基
1.0g 15.0g
培养基配方
思 考：该培养基对微生物具有选择作用吗？如果 具有，是如何进行选择的？
只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种
• 2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生 物，其中也包括分解尿素的微生物。由于 瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后 会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生 物除了需要准备选择培养基外，还应参照 厌氧菌的培养方法进行实验设计。
分析P22实例:
你认为哪个同学的结果更接近真实值？你认 为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如 何改进？
第一位同学没有重复实验(至少涂布3个平板)，结 果不具有说服力。
第二位同学有重复实验，但结果不一致（误差较 大），说明在操作过程中可能出现错误，需要重 新实验。
【例1】为了计数微生物的数量，一位同学在4
1、酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增
强，PH升高→酚红指示剂，变红 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红-美蓝结合→菌落呈黑
色。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
课后练习
——利用血球计数板在显微镜下直接计数。
（2）活菌计数法——统计菌落数目
方法： 稀释涂布平板法。 原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长 的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
2.2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
专题2 微生物的培养与应用课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题背景尿素是一种重要的农业氮肥。
但尿素不能直接被农作物吸收。
土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
土壤中细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶。
相关方程式如下：研究思路（一）筛选菌株(1)自然界中目的菌株筛选的依据是根据它对的要求，到相应的环境中去寻找。
(2)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时或其他微生物生长。
(3)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
【实例】土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：KH2PO4 NaH2PO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖尿素琼脂1.4g2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g（1）从物理性质看此培养基属于哪类？（2）在此培养基中哪些作为碳源、氮源？【相关链接】利用选择培养基设计实验分离纯化微生物①真菌：用含的培养基分离。
②金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分离。
③固氮微生物：用培养基分离。
④自养型微生物：用含的培养基分离。
⑤光合细菌：用含无机碳源的培养基在无氧而有光照的环境中分离。
⑥厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在条件下分离。
⑦乳酸菌：用乳酸含量较高，pH较低的普通培养基分离。
⑧假单胞杆菌：用石油作为唯一碳源的培养基分离。
（二）统计菌落数目(1) 常用方法：法。
(2) 统计依据：当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌。
(3)平板选择菌落计数时一般选菌落数在的平板，计数公式为每克样品中的菌落数＝。
参数含义依次为C，V ，M 。
【相关链接】统计微生物数目的方法1．显微镜直接计数法(1) 原理：利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（一）筛选菌株
3、选择培养基
根据微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不
同，配制的允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他
种类微生物生长的培养基。
本课题使用的选择培养基
物理特性：固体培养基 功能特性：选择培养基
例：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应 稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是
(D )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和261，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平 均值163
【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每 毫升样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。
（二）统计菌落数目
2.间接计数法→活菌计数法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一 个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（2）常用Байду номын сангаас法：稀释涂布平板法。
葡萄糖
10.0g
不缺能乏分氮解源尿的素培，养缺基乏—氮—源分而离不固能氮生微长生物
尿素 琼脂
1.0g 15.0g
发在育无繁氧殖条，件而下受的到普抑通制培，养所基以—用—此分培离厌氧型将和上兼述性物质厌溶氧解型后微，用生蒸物馏水
养基就能够选择出分解尿素的微生物。
定容到1000mL。
例：下列能筛选出分解尿素的细菌的培养基是( A )
但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没 有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同 学排除上述两个可能影响因素吗？
人教版高中生物选修一专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学案含解析
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、研究思路1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
2．统计菌落数目(1)活菌计数法：常用稀释涂布平板法。
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C ÷V )×M 。
C ：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V ：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。
M ：代表稀释倍数。
③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。
.1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
3．测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。
稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目低。
4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
5．鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，依据是否变红进行判断。
(2)显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。
3．设置对照(1)对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。
(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
二、实验设计1．土壤取样从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。
2--2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(已用).
对照组和实验组都在同一研究对象上进行； ④相互对照：
不单设对照组，而是几个实验组相互对照。
实例：教材P23
教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不 同，可能的解释有两种：
一是由于土样不同； 二是由于培养基污染或操作失误。 如何设置对照实验来确定原因？ 方案一： 其他同学用与A同学一样的土样进行实验。 如果结果与A同学一致，则证明A同学操作 无误； 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误 或培养基的配制有问题。
微生物的培养与观察
关注菌落的形状、 大小、隆起程度、 颜色、质地等等， 都是区分细菌的重 要手段。
特别注意的几个具体操作
〖注意〗研究未知的微生物，一定要注意进 行规范的无菌操作，以防被致病的微生物感 染，实验后，一定要洗手。
（六）鉴定：筛选后必鉴定 鉴定（鉴别）培养基：加入某种指示剂或化学药 品，不影响微生物的生存。 1、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌是否存在
活学活用
1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长； 在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长； 在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。 利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分
离出( ) C
A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌 B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌 C.固氮细菌、霉菌、放线菌 D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
培养不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间。
细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培 养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数在我们生活的地球上，土壤是一个极其复杂而又充满生机的生态系统。
在这个生态系统中，存在着各种各样的微生物，它们在物质循环和能量流动中发挥着至关重要的作用。
其中，分解尿素的细菌就是一类非常特殊且具有重要功能的微生物。
尿素是一种常见的含氮化合物，广泛应用于农业生产中作为氮肥。
然而，植物并不能直接吸收和利用尿素，需要经过分解尿素的细菌将其转化为氨等植物能够吸收的形式。
因此，研究土壤中分解尿素的细菌对于提高氮肥的利用率、减少环境污染以及深入了解土壤生态系统的功能都具有重要意义。
要分离和计数土壤中分解尿素的细菌，首先需要采集合适的土壤样本。
我们通常会选择那些长期施用尿素肥料的农田、花园或者草地的土壤。
在采样时，需要使用无菌的工具，如无菌铲或者无菌勺，从不同的地点和深度采集土壤，以确保样本的代表性和多样性。
将采集到的土壤放入无菌的塑料袋中，并尽快带回实验室进行处理。
回到实验室后，第一步是制备培养基。
用于分离分解尿素的细菌的培养基通常是选择培养基，其中含有尿素作为唯一的氮源。
除此之外，还需要添加碳源（如葡萄糖）、无机盐、生长因子等营养物质，以及琼脂作为凝固剂。
在制备培养基的过程中，要严格遵守无菌操作，防止杂菌的污染。
接下来，将土壤样本进行稀释。
这是一个关键的步骤，目的是将土壤中的微生物分散开来，以便能够在培养基上形成单个的菌落。
我们可以使用无菌水对土壤样本进行一系列的梯度稀释，比如 10 倍、100 倍、1000 倍等。
稀释的程度要根据土壤中微生物的数量和实验的要求来确定。
然后，将稀释后的土壤溶液涂布在制备好的培养基上。
使用无菌的涂布棒，将溶液均匀地涂布在培养基的表面。
涂布完成后，将培养基倒置放入恒温培养箱中进行培养。
培养的温度和时间要根据所分离的细菌的特性来确定，一般来说，温度在 30℃至 37℃之间，培养时间为2 至 3 天。
在培养的过程中，分解尿素的细菌会在培养基上生长并形成菌落。
土壤中分解尿素的细菌的分离与记数
尿素分解细菌的纯培养
尿素分解细菌的纯培养是分离尿素分解细菌的关键步骤， 通过选择性培养基，将土壤中的尿素分解细菌分离出来， 获得单一菌落。
培养基中添加尿素作为唯一氮源，以筛选出能够分解尿素 的细菌。同时，培养基中还应添加适量的其他营养成分， 以满足尿素分解细菌的生长需求。
尿素分解细菌的计数方法
尿素分解细菌的计数可以采用菌落计数法或细胞计数法。菌落计数法是通过培养 基上形成的菌落数量来计算尿素分解细菌的数量，而细胞计数法则采用显微镜直 接观察和计数细胞。
菌落计数法操作简便，但可能存在菌落重叠和无法区分死菌和活菌的问题。细胞 计数法虽然准确度高，但操作较为复杂，需要使用显微镜和专业的细胞计数器。
尿素分解细菌的计数实验步骤
将土壤样品稀释后涂布在含有尿素的 培养基上，然后进行培养。
对筛选出的尿素分解细菌进行纯培养， 并进行进一步的生理生化实验和分子 生物学鉴定，以确定其种类和特性。
采集时间
采样方法
选择适宜的时间采集土壤样品，通常 在春季或秋季进行，此时土壤中的微 生物活性较高。
采用多点采样法，在不同地点和深度 采集土壤样品，以获得更全面的土壤 信息。
采样地点
选择具有代表性的土壤区域进行采样， 如农田、森林、草地等，确保采集的 土壤样品具有广泛性和代表性。
分离尿素分解细菌的方法
生长特性
这些细菌在尿素培养基上 生长良好，表现出对尿素 的良好分解能力。
尿素分解细菌的记数结果
菌落计数
通过菌落计数法，对分离 出的尿素分解细菌进行数 量统计。
数量分布
在土壤的不同区域，尿素 分解细菌的数量分布存在 差异。
生长条件
部分尿素分解细菌对生长 条件较为敏感，如温度、 pH值等。
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土壤中分解尿素的细菌的分离及其计数
一、筛选菌株
1、自然中目的菌株的筛选
实例：PCR技术
DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。
2、实验室中微生物的筛选原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同
时抑制或阻止其他微生物生长。
3、选择培养基
二、统计菌落数目
1、稀释涂布平板法（活菌计数法）
为结果准确，一般选择菌落数在30--300的平板上进行计数。
计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml）
M代表稀释倍数
2、显微镜直接计数（总菌计数法）
缺点：不能区分细菌的死活；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以观察。
Q：稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
A:稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落;显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
三、设置对照
A、空白对照：将未接种的培养基同时进行培养。
B、条件对照：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。
目的：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
实验设计
一、土壤取样
从富含有机质、酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样。
先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
二、制备培养基
1、制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
（筛选出能分解尿素的细菌）
2、制备牛肉膏蛋白胨培养基
（与选择培养基做对照，检测选择培养基是否具有选择作用）
三、样品的稀释与涂布平板
分离不同的微生物要采用不同的稀疏度，测定土壤中细菌的数量，选用的稀释范围也不相同。
四、微生物的培养与观察
1、培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。
2、在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。
3、不同微生物会表现出不同的菌落特征，包括菌落的形状、大小、颜色和隆起程度等。
这也是区别不同微生物的关键。
五、菌落计数
Q:在选择培养基上生长的肯定是所筛选的目的微生物吗？
A:还可能是所筛选微生物的代谢产物。
课题延伸：鉴定菌株
原理：产脲酶的细菌将尿素分解成氨，培养基PH会升高，通过检测培养基PH变化来判断该化学反应是否发生。
方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养该细菌，如果 PH升高，指示剂变红，可以初步鉴定该种菌能分解尿素。