L_异亮氨酸分批发酵动力学模型的研究

第31卷第4期　2001年12月工业微生物Industrial Microbiology　Vol.31No.4　Dec.2001作者简介:张伟国(1963～),男,博士,副研究员。

L -异亮氨酸分批发酵动力学模型的研究张伟国,　陈　坚,　伦世仪(江南大学生物工程学院,江苏无锡214036)摘　要 对黄色短杆菌L -异亮氨酸高产菌XQ -4(AHV r AEC r Suc g SG r Eth r α-AB r IleHx r )分批发酵动力学模型进行了研究。

建立了比较合理的L -异亮氨酸分批发酵动力学模型,为L -异亮氨酸补料分批发酵最优化的研究奠定基础。

关键词:L -异亮氨酸;　分批发酵;　动力学模型;　黄色短杆菌 目前,国内外L -异亮氨酸全部采用发酵法生产,因而发酵水平的高低基本决定了其产品的成本。

提高发酵水平有两条途径:一是选育优良的生产菌种;二是采用与生产菌种相匹配的最佳培养条件和控制手段。

前者是建立在代谢控制理论上的菌种选育技术;后者是建立在生化工程基础上的发酵过程控制技术。

国内长期以来把氨基酸发酵的研究重点放在菌种选育上,对其发酵动力学模型的研究较少,从而影响了对发酵过程的控制,以至于目前基本上还完全依赖于手工控制。

本研究在对L -异亮氨酸高产菌XQ -4菌体生长和产物形成不同阶段动力学和发酵数据进行分析的基础上,建立了比较合理的分批发酵动力学模型,为补料分批发酵最优化的研究奠定了基础。

1　材料与方法1.1　供试菌种 L -异亮氨酸高产菌XQ -4(AHV r AEC r Suc g SG r Eth r α-AB r IleHx r )[1]。

1.2　培养基 种子培养基(g/L ):葡萄糖,25;(N H 4)2SO 4,5;KH 2PO 4,1;MgSO 4・7H 2O ,0.5;玉米浆,40mL/L ;CaCO 3,10。

发酵培养基(g/L ):葡萄糖,50～170;(N H 4)2SO 4,5;KH 2PO 4,1;MgSO 4・7H 2O ,0.5;玉米浆,21mL/L 。

1.3　培养条件 斜面活化24h ;种子在31±1℃下振荡培养12～13h 。

2L 发酵罐中装液量为1.2L ,接种量为10%,温度控制在31～32℃,通风比1:1～3,流加氨水控制p H 值,搅拌转速根据要求而定。

1.4　分析方法 菌体浓度:吸取0.2mL 菌液到5mL 0.25mol/L HCl 溶液中,摇匀,采用721分光光度计,1cm 光程,562nm 测定OD 值。

所得的OD 值与吸光度———菌体干重曲线对照,计算出菌体浓度。

还原糖:菲林试剂滴定法。

L -异亮氨酸:纸上层析法、比色定量法及氨基酸自动分析仪测定。

1.5　发酵设备 瑞士INFOR 2L 台式发酵罐,发酵液溶氧自动显示、温度和p H 自动控制。

2　结果与讨论2.1　L -异亮氨酸分批发酵动力学模型2.1.1　菌体生长模型 目前应用最广泛、形式较为简单的微生物生长动力学模型仍然是Monod 提出的经验模型[2]:μ=d X d t =μmax XSK s +S(1) 对XQ -4菌株的动力学特性进行了研究,结果表明在底物(葡萄糖)限制的条件下,菌体生长符合Monod 方程,并且计算出μmax =0.265h -1,K s =0.789g/L 。

很明显,Monod 方程是对菌体生长的简单化描—31—述。

菌体生长过程中存在高浓度底物的抑制、代谢产物的反馈抑制和阻遏、营养物扩散限制而导致菌体生长迟缓等现象[3]。

在分批发酵过程开始时,底物浓度均维持在较高水平,当残糖浓度<8～10g/L 时意味着发酵结束,可见在分批发酵中葡萄糖对菌体生长的限制作用不可忽略不计,故不宜用Monod 方程来描述分批发酵的菌体生长模型。

μ=μmax (1-X X m ax)X(2) 式(2)为逻辑(logistic )模型,能很好地反映分批发酵过程中因菌体浓度的增加对自身生长存在的抑制作用,这在分批发酵中是普遍存在的。

当菌体浓度很低即发酵刚开始时,X 比X max 小得多,X/X max 项可忽略不计,表示菌体呈指数生长;当X =X max 时,表示菌体停止生长。

在对XQ -4进行分批发酵研究时,发现菌体生长有一最大饱和浓度;提高初糖浓度将造成菌体的比生长速率下降,这就证明了当底物浓度较高时,底物对菌体生长存在抑制作用。

关于底物对菌体生长的抑制作用可用Andrews 模型[4]来表达:μ=μmax11+K s /S +S /K iX ≈μmaxS K s +S 11+S /K iX(3) 一般在分批发酵中S >>K s ,故式(3)可简化如下:μ=μmax11+S /K iX(4) 抑制物的积累而引起菌体比生长速率下降可用下式来表示:μ=μmax (1-aI )(5) 式(5)中I 表示抑制物的浓度。

结合(4)和(5)两式,得菌体的生长模型如下:μ=μmax11+S /K i(1-aI )X(6) 假定抑制物的浓度与菌体比生长速率的下降呈线性关系,即a ≌常数,又假定抑制物的生成速率与菌体的生长速率成正比,则:d I d t =b d Xd t(7) 若以t =0时,I =0为初始条件进行积分,得I=b (X -X 0),将其代入式(6)得式(8):μ=μmax11+S/K i{1-ab (X -X 0)}X=μm ax11+S/K i(1+abX 0)(1-abX1+abX 0)X (8) 假定μmax (1+abX 0)≌K ,(1+abX 0)/ab ≌X max ,则式(8)可简化为:μ=KX (1-XX max )11+S /K i(9) 假定K ≈μ3max ,代入上式(9),得分批发酵中菌体生长模型如下[5]:μ=μ3max X (1-XX max )11+S /K i(10)2.1.2　产物生成模型 产物形成动力学模型中较为通用的模型是由Luedeking &Piret 在描述乳酸发酵所提出的数学表达式[6]:π=d P d t=αμ+βX(11) 虽然上述模型是为乳酸发酵生产而提出来的,但Ollis 等证明这一模型同样对胞外多糖及其它多种产物的发酵都适用[7]。

L -异亮氨酸发酵属于二类发酵,但从Luedeking &Piret 方程中反映不出底物葡萄糖对产物形成的影响。

Bajpai 曾提出一个底物非竞争抑制模型用来描述青霉素发酵的产物形成,该模型能很好地解释了高浓度底物对青霉素形成的抑制作用[8]。

宫衡在其赖氨酸发酵中提出如下产物形成模型[5]:π=K (S S +K sp )(11+S /K ipX(12) 本文将其进一步简化,得如下产物形成模型:π=KSK sp +S (1+S /K ip)X(13) L -异亮氨酸发酵不同于青霉素发酵,但高浓度葡萄糖对产物形成的抑制作用确实是存在的。

研究表明,发酵中后期维持较低的葡萄糖浓度有利于L -异亮氨酸的高产和稳产。

因此为了能反映出底物葡萄糖对L -异亮氨酸发酵的抑制作用,结合Ba 2jpai 方程和Luedeking &Piret 方程,建立如下的产物形成动力学模型:—41—　第4期 工　业　微　生　物第31卷　π=K 1μ+K 2SK sp +S (1+S /K ip)X (14)2.1.3　底物消耗模型 在分批发酵时,如果限制性底物是碳源,则消耗掉的碳源中一部分生成细胞物质,一部分形成产物,一部分产生能量供细胞维持生命活动之用。

σ=-d S d t =1Y x μ+1Y pπ+m X(15)2.1.4　分批发酵动力学模型参数 以(10)、(14)和(15)式分别对分批发酵菌体生长曲线、产物生成曲线和底物消耗曲线进行拟合。

根据实际测得的数据,采用Mathematica 软件和SAS 统计软件,进行非线性规划,求得各个参数,结果见表1。

Y x 、Y p 为底物转化为菌体和产物的真实转化率,对于XQ -4菌株而言其值分别为0.499g/g 和0.379g/g ,经拟合计算出m 值为0.112。

表1　L -异亮氨酸分批发酵动力学模型参数取值参数μ3max X max K i K 1K 2K spK ip Y x Y p m数值0.35017.71500.1600.2009.9024.20.4990.3790.112 表2为初糖浓度138g/L 时动力学模型计算值与实验值的比较。

从表2可看出,用动力学模型拟合L -异亮氨酸分批发酵过程除极个别点外,一般误差均小于5%。

表2　动力学模型计算值与实验值的比较培养时间(h )菌体浓度(g/L )实验值　计算值产物浓度(g/L )实验值　计算值底物浓度(g/L )实验值　计算值0 2.0 2.1001381388 3.6 3.50.20.313413516 6.6 6.4 1.1 1.3127127249.89.7 3.1 3.21161183213.413.2 6.5 6.3991014016.115.89.79.881824816.917.013.713.659615617.617.718.317.640396417.717.821.521.023217217.617.723.523.488　2.2　分批发酵动力学模型的适用范围 在建立分批发酵动力学模型的过程中,参数的求解和模型的验证是基于初糖浓度为138g/L 条件下进行的,因此有必要在更广的初糖浓度范围内对模型的适用性进行考察。

图1不同初糖浓度时L -异亮氨酸分批发酵的实验值与模型计算值比较(图中虑线表示实验值,实线表示模型计算值)。

从图中可看出该模型对初糖浓度100～150g/L 时L -异亮氨酸分批发酵拟合较好;当初糖浓度50g/L 、170g/L 时,该模型计算值与实验值除个别点有较大的偏差外,其余也不太大。

因此,在不同底物浓度范围内该模型有良好的适应性。

图1　不同初糖条件下实验值与模型计算值比较—51—　第4期张伟国,等:L -异亮氨酸分批发酵动力学模型的研究第31卷　2.3　分批发酵动力学模型分析2.3.1　初糖浓度对产物形成速率的影响 综合式(10)和(13),产物形成速率如下:d P d t ={K 1μmax 11+S /K i+K 2SK sp +S (1+S /K ip )}X =KX(16) 由式(16)可看出,维持较高的菌体浓度对产物形成是有利的。

菌体生长,大约需要35.5g/L 的葡萄糖(以X max =17.7g/L ,Y x =0.499g/g 计)。

实际发酵中,由于产物合成和菌体生长需要,获得高浓度菌体的初糖浓度要大于这个值。

初糖浓度过低,会造成菌体浓度X 下降,使得产物形成速率下降;但初糖浓度过高又会造成K 的下降,使得产物形成速率下降。