植物组织培养-外植体的选择与建立

第三节 外植体（培养物）的建立
• 抗生素对植物材料的毒性因植物类型不同差异很大，因 此，用植物离体培养进行基本的测试是实验成功的重要 一步。由于植物毒性影响或抗生素渗透性差，在处理污 染实验中，抗生素对分离组织也可能失效。了解抗生素 对细菌和植物二者的效应，是消除污染和保护培养物的 关键。 • 此外，抗生素常作为预防污染作用而加入到培养基中， 或者在已鉴定出细菌污染的情况下，用于抑制细菌生长 或消灭细菌。抗生素的抗菌作用在中性培养基(pH6.5— 7.5)中比常规状态提高许多，而在酸性条件下则失效， 而且抗生素具有热敏感性，不能采用高温高压灭菌，只 能采用过滤灭菌的方法加入培养基。
根据细胞全能性学说，植物体的每一个细胞 都含有全部的遗传信息，都能再生出一个 新植株。但是，要使每个细胞的全能性都 表现出来，在目前还是不易做到的事。因 而，外植体（初始培养物）的选择非常重 要。
第二节 外植体（培养物）的选择
1、基因型：
再生能力 （1）、双子叶>单子叶； （2）、被子植物>裸子植物； （3）、双子叶植物中：茄科（Solanacea）；秋海棠 科（Begoniaceae）；景天科（Crassulaceae）； 苦苣苔科（Gesneriaceae）；十字花科（Cruciferae） 再生力特强；郁金香（Tulip）再生力较弱。 （4）、同一种植物中：活体（in vivo）再生力强者， 离体（in vitro）再生力也强。
3 个材料/容器： 污染率=100-（60%）3=78.4% 污染量=100X78.4%=79 获得量= 100X（60%）3= 21 4 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）4=13 5 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）5=8 • 防止污染的对策： 小容器、多数量、尽量分散、相 互隔离
第三节 外植体（培养物）的建立
常用如下抗生素： 链霉素(10 mg／L)、青霉素(20mg／L)、地霉素(5mg ／L)、夹竹桃霉素(20mg／L)、杆菌肽(50mg／L)、 新霉素(1mg／L)。 例如：用奥复星（氧氟沙星注射液）40～80 mg／L、 注射用的青霉素96～192 mg／L可有效抑制枣树试 管苗的细菌污染，而链霉素40～800mg／L和硫酸 庆大霉素20～60mg／L抑制枣树细菌效果不明显。
第三节 外植体（培养物）的建立
防止方法： • 在培养基中加入抗 生素。 • 利用茎尖培养。 • 利用无菌材料。
第三节 外植体（培养物）的建立
抗生素防治内源菌： • 外植体顶芽培养发现的污染、不同采收期外植体存 在的污染和表面彻底消毒后的细菌污染都可能是内 生菌造成的。内生菌的污染，无论用何种表面消毒 方法都不能彻底消除，因此，必须使用抗生素进行 间接防治处理。 • 选用适当的抗生素特别重要。理想的抗生素应该具 备以下特性：可溶性、稳定性、不受pH高低和培养 基差异的影响、无边界效应、广谱性、杀菌性、不 产生抗性诱导、既廉价又对人体无害。
第三节 外植体（培养物）的建立
（4）、附生菌控制：
• 采用化学杀菌剂可以有效地杀死附生菌，但是一些较特殊的外植体材料，如密披绒 毛的叶片或幼果、花芽或带苞片的叶芽，附生菌可能潜伏在外植体上，无法彻底清 除。这时，必须采取一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。 取材来源： • 从保护条件下生长的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保护条件指温室、培 养箱、生长室等。从温室、培养箱里取材，可有效减少附生菌的群体数量。从栽培 于温室中的植株上取材和从露地取材相比，前者污染率更低。 • 所取植株的生长土壤，是组织培养中的一个重要污染源。如果采用温室栽培，事先 应进行土壤灭菌。此外，灌溉水也可能成为污染源。取材于用过滤水和用缄市饮用 水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.
第三节 外植体（培养物）的建立
（1）、产生污染的因素： ①外植体：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多； 老的材料比幼嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多； 带泥土的材料比清洁的带菌多。一年中以雨季的材料带菌多， 一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。 ②培养基：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况， 以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤 灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。 ③操作环节：接种室是否清洁、干燥、密闭，是否经常用紫外线 灯照射、甲醛熏蒸、70％酒精喷雾杀菌等，操作是否等熟练。 ④培养环境：培养室要求清洁、密闭。每天用70％酒精喷雾除菌、 降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如有空气过滤装置效果更好。 培养室相对湿度太高时，污染加重。
第三节 外植体（培养物）的建立
（5）、内源菌防治： 植物组织培养中对材料只能进行表面灭菌， 而对材料组织内部所带的细菌往往难 以对付。 1. 表面污染与内源污染的区别：
第三节 外植体（培养物）的建立
• 常见内源菌：芽孢杆菌（rod bacteria）为主，尤其是 Bacilus licheniformis 和B.subtilis （“white ghost”）。 真菌中主要是镰刀菌(Fusarium)、轮枝孢菌(Verticillium)、 瓶霉菌(Phialophora)和丝核菌(Rhizoctonia)。 • 内源菌的检测：通常情况下，通过观察培养瓶就可看到 一些污染的迹象；但是对于生长缓慢的细菌或内生菌来 说，仅靠肉眼观察是不够的，必须通过指示培养，即采 用微生物特别容易生长的培养基和培养条件，让外植体 上的微生物快速生长，然后予以鉴定[培养基中加入蛋白 胨（peptone）、胰蛋白胨（trypone）或酵母汁(YE)]。
• 污染估算：首次接种通常污染 率40—60% 按40%计：接种100个材料 1个材料/容器： 污染量=100X40%=40 获得量=100-40=60。 2个材料/容器： 2污染：1X40%X40%=16% 弃掉 1污染：2X40%X40%=32% 2未污染：60%X60%=36% 污染率=100-36=62% 污染量=100X62%=62 获得量=100-62=48
3、根据时间和季节取材
生 长 物 质 含 量
抑 制 物 质 含 量
时间或季节
时间或季节
第二节 外植体（培养物）的选择
3、根据时间和季节取材
取材时间 取材时间
物 质 含 量
抑制物质
生长物质
时间或季节
第二节 外植体（培养物）的选择
4、根据母株位置选择：
具原基结构的外植体：茎尖、 侧芽、原球茎、鳞芽、分生 组织 不具原基结构的外植体：根、 茎、叶、花、果等器官，需要 脱分化。
4、污染（Infection）
能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术 之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败； 对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。 因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问 题。 植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养 环境四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得 到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其 可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生 性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的 鉴定，并根据不同的微生物种类采取相应的控制措施，这方面 的研究进展较快。
第三节 外植体（培养物）的建立
5、褐变（Browning）： （1）、概念：外植体在培养容器中被氧化变褐而死亡 的现象。
第三节 外植体（培养物）的建立
（2）、外植体材料褐化原理：
植物组织的褐化是通过含铜的氧化酶如多酚氧化酶和 酪氨酸酶起作用所致，其作用的底物通常是酪氨酸 和邻位羟酚类化合物如绿原酸等。酶和底物在植物 正常生长的情况下是在组织内的不同部位，当细胞 受伤或组织垂死时，酶和底物就跑到一起发生作用， 当酚被氧化为活性酸化物和环形多聚体氧化蛋白时 便形成深色化合物，这些物质又很快被氧化和变成 复杂的抑制性物质，从而导致外植体材料变褐死亡 并使培养基变褐 。
第三节 外植体（培养物）的建立
（6）、特殊污染源： 污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种 细菌为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟 缓芽孢杆菌(Bacilluslenlus)，它外被荚膜，耐 高温，一般灭菌剂难以杀死。它可以随培养材 料、用具等传播；它可出现在培养基表面，或 呈滴形云雾状存在于培养基内。 若出现应及时淘汰污染源，并对所用过的器皿和 用具进行严格高温灭菌处理。
第三节 外植体（培养物）的建立
• 与取样外植体年龄有关： 引起褐化程度的轻重常与取 样外植体组织的年龄有关， 通常是幼龄部位产生褐化 较轻，随着组织的老龄化 而褐化加重。因此，在外 植体接种时常需要剥去鳞 片和大叶片，尤其是以切 取幼嫩的芽尖或切取顶芽 分生组织（或带少量叶原 基）接种更为理想 。
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
年 龄 或 幼 化 程 度
外 植 体 建 立
阶 段 发 育
外 植 体 建 立
母株年龄和幼化程度与外植体建立
母株阶段发育与外植体建立
第二节 外植体（培养物）的选择
杜鹃花 ‘van Weerden Poelman’
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第三节 外植体（培养物）的建立
1、主要任务：成功的将外植
体建立在试管中。
2、主要技术环节：
（1）、外植体的选择 （2）、外植体的消毒 （3）、培养基的选择、配制 （4）、外植体消毒与接种
3、关键问题：
（1）、污染（Infection） （2）、褐变（Browning）
第二节 外植体（培养物）的选择
材料预处理： • 在对外植体进行常规化学灭菌之前，对特殊材料进行特殊预处理，可以收到很好的 效果。例如，在对密披绒毛的枇杷幼果进行灭菌之前，先把绒毛刮去，灭菌效果很 好。对于密披绒毛的叶片，可先连枝带叶放在自来水下冲洗，去除污物后，用0.5 ％Tween20浸1h（其间换新鲜液2～3次），然后进行常规灭菌，就可起到彻底杀菌 的作用。对兰花花芽常规灭菌之前，先用10％的杀藻铵（Benzalkonium Chloride） 溶液浸渍材料10min，效果很好。