植物组织培养-外植体的选择与建立

第三节 外植体（培养物）的建立
• 与取样外植体年龄有关： 引起褐化程度的轻重常与取 样外植体组织的年龄有关， 通常是幼龄部位产生褐化 较轻，随着组织的老龄化 而褐化加重。因此，在外 植体接种时常需要剥去鳞 片和大叶片，尤其是以切 取幼嫩的芽尖或切取顶芽 分生组织（或带少量叶原 基）接种更为理想 。
材料预处理： • 在对外植体进行常规化学灭菌之前，对特殊材料进行特殊预处理，可以收到很好的 效果。例如，在对密披绒毛的枇杷幼果进行灭菌之前，先把绒毛刮去，灭菌效果很 好。对于密披绒毛的叶片，可先连枝带叶放在自来水下冲洗，去除污物后，用0.5 ％Tween20浸1h（其间换新鲜液2～3次），然后进行常规灭菌，就可起到彻底杀菌 的作用。对兰花花芽常规灭菌之前，先用10％的杀藻铵（Benzalkonium Chloride） 溶液浸渍材料10min，效果很好。
第三节 外植体（培养物）的建立
5、褐变（Browning）： （1）、概念：外植体在培养容器中被氧化变褐而死亡 的现象。
第三节 外植体（培养物）的建立
（2）、外植体材料褐化原理：
植物组织的褐化是通过含铜的氧化酶如多酚氧化酶和 酪氨酸酶起作用所致，其作用的底物通常是酪氨酸 和邻位羟酚类化合物如绿原酸等。酶和底物在植物 正常生长的情况下是在组织内的不同部位，当细胞 受伤或组织垂死时，酶和底物就跑到一起发生作用， 当酚被氧化为活性酸化物和环形多聚体氧化蛋白时 便形成深色化合物，这些物质又很快被氧化和变成 复杂的抑制性物质，从而导致外植体材料变褐死亡 并使培养基变褐 。
第二节 外植体（培养物）的选择
杜鹃花 ‘Rhodoendron’
第二节 外植体（培养物）的选择
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
年 龄 生长 童年期 转变年期 开花 成年期
阶段发育
第二节 外植体（培养物）的选择
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
植株的生长与发育
第二节 外植体（培养物）的选择
第三节 外植体（培养物）的建立
（5）、内源菌防治： 植物组织培养中对材料只能进行表面灭菌， 而对材料组织内部所带的细菌往往难 以对付。 1. 表面污染与内源污染的区别：
第三节 外植体（培养物）的建立
• 常见内源菌：芽孢杆菌（rod bacteria）为主，尤其是 Bacilus licheniformis 和B.subtilis （“white ghost”）。 真菌中主要是镰刀菌(Fusarium)、轮枝孢菌(Verticillium)、 瓶霉菌(Phialophora)和丝核菌(Rhizoctonia)。 • 内源菌的检测：通常情况下，通过观察培养瓶就可看到 一些污染的迹象；但是对于生长缓慢的细菌或内生菌来 说，仅靠肉眼观察是不够的，必须通过指示培养，即采 用微生物特别容易生长的培养基和培养条件，让外植体 上的微生物快速生长，然后予以鉴定[培养基中加入蛋白 胨（peptone）、胰蛋白胨（trypone）或酵母汁(YE)]。
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
年 龄 或 幼 化 程 度
外 植 体 建 立
阶 段 发 育
外 植 体 建 立
母株年龄和幼化程度与外植体建立
母株阶段发育与外植体建立
第二节 外植体（培养物）的选择
杜鹃花 ‘van Weerden Poelman’
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第三节 外植体（培养物）的建立
（6）、特殊污染源： 污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种 细菌为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟 缓芽孢杆菌(Bacilluslenlus)，它外被荚膜，耐 高温，一般灭菌剂难以杀死。它可以随培养材 料、用具等传播；它可出现在培养基表面，或 呈滴形云雾状存在于培养基内。 若出现应及时淘汰污染源，并对所用过的器皿和 用具进行严格高温灭菌处理。
第三节 外植体（培养物）的建立
• 抗生素对植物材料的毒性因植物类型不同差异很大，因 此，用植物离体培养进行基本的测试是实验成功的重要 一步。由于植物毒性影响或抗生素渗透性差，在处理污 染实验中，抗生素对分离组织也可能失效。了解抗生素 对细菌和植物二者的效应，是消除污染和保护培养物的 关键。 • 此外，抗生素常作为预防污染作用而加入到培养基中， 或者在已鉴定出细菌污染的情况下，用于抑制细菌生长 或消灭细菌。抗生素的抗菌作用在中性培养基(pH6.5— 7.5)中比常规状态提高许多，而在酸性条件下则失效， 而且抗生素具有热敏感性，不能采用高温高压灭菌，只 能采用过滤灭菌的方法加入培养基。
第三节 外植体（培养物）的建立
（1）、产生污染的因素： ①外植体：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多； 老的材料比幼嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多； 带泥土的材料比清洁的带菌多。一年中以雨季的材料带菌多， 一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。 ②培养基：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况， 以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤 灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。 ③操作环节：接种室是否清洁、干燥、密闭，是否经常用紫外线 灯照射、甲醛熏蒸、70％酒精喷雾杀菌等，操作是否等熟练。 ④培养环境：培养室要求清洁、密闭。每天用70％酒精喷雾除菌、 降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如有空气过滤装置效果更好。 培养室相对湿度太高时，污染加重。
第三节 外植体（培养物）的建立
• 单独使用一种抗生素，通常效果很差，几种抗生素 的配合使用，可以起到协同增益作用，但有时也可 能使个别药物相互作用而失效。几种高浓度杀菌剂 配合使用很可能对植物有毒害。 • 对于某一特定细菌，确定抗生素的最低杀菌剂量是 很重要的，这种最低剂量可以通过不同浓度的抗生 素与细菌进行液体共同培养来确定。若找到有效浓 度，则在实验处理前就可确定对植物材料的毒性范 围。
4、污染（Infection）
能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术 之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败； 对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。 因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问 题。 植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养 环境四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得 到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其 可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生 性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的 鉴定，并根据不同的微生物种类采取相应的控制措施，这方面 的研究进展较快。
第三节 外植体（培养物）的建立
常用如下抗生素： 链霉素(10 mg／L)、青霉素(20mg／L)、地霉素(5mg ／L)、夹竹桃霉素(20mg／L)、杆菌肽(50mg／L)、 新霉素(1mg／L)。 例如：用奥复星（氧氟沙星注射液）40～80 mg／L、 注射用的青霉素96～192 mg／L可有效抑制枣树试 管苗的细菌污染，而链霉素40～800mg／L和硫酸 庆大霉素20～60mg／L抑制枣树细菌效果不明显。
第三节 外植体（培养物）的建立
（4）、附生菌控制：
• 采用化学杀菌剂可以有效地杀死附生菌，但是一些较特殊的外植体材料，如密披绒 毛的叶片或幼果、花芽或带苞片的叶芽，附生菌可能潜伏在外植体上，无法彻底清 除。这时，必须采取一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。 取材来源： • 从保护条件下生长的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保护条件指温室、培 养箱、生长室等。从温室、培养箱里取材，可有效减少附生菌的群体数量。从栽培 于温室中的植株上取材和从露地取材相比，前者污染率更低。 • 所取植株的生长土壤，是组织培养中的一个重要污染源。如果采用温室栽培，事先 应进行土壤灭菌。此外，灌溉水也可能成为污染源。取材于用过滤水和用缄市饮用 水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.
第三节 外植体（培养物）的建立
1、主要任务：成功的将外植
体建立在试管中。
2、主要技术环节：
（1）、外植体的选择 （2）、外植体的消毒 （3）、培养基的选择、配制 （4）、外植体消毒与接种
3、关键问题：
（1）、污染（Infection） （2）、褐变（Browning）
第二节 外植体（培养物）的选择
3 个材料/容器： 污染率=100-（60%）3=78.4% 污染量=100X78.4%=79 获得量= 100X（60%）3= 21 4 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）4=13 5 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）5=8 • 防止污染的对策： 小容器、多数量、尽量分散、相 互隔离
• 污染估算：首次接种通常污染 率40—60% 按40%计：接种100个材料 1个材料/容器： 污染量=100XΒιβλιοθήκη Baidu0%=40 获得量=100-40=60。 2个材料/容器： 2污染：1X40%X40%=16% 弃掉 1污染：2X40%X40%=32% 2未污染：60%X60%=36% 污染率=100-36=62% 污染量=100X62%=62 获得量=100-62=48
第三节 外植体（培养物）的建立
（2）、污染的防止： • 母株保护：保持母株清洁，减少喷 灌。温室种植，喷施杀菌（虫）剂， 减少病原菌含量。 • 材料选择：选取生长发育健壮，病 虫危害少的材料。 • 严格清洗、消毒与无菌操作。 • 小容器、分散接种。
第三节 外植体（培养物）的建立
（3）、污染估算及对策：
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
4、根据外植体的大小选择：
外 植 体 大 小
外 植 体 建 立
外植体大小与外植体建立
第二节 外植体（培养物）的选择
第三节 外植体（培养物）的建立
3、根据时间和季节取材
生 长 物 质 含 量
抑 制 物 质 含 量
时间或季节
时间或季节
第二节 外植体（培养物）的选择
3、根据时间和季节取材
取材时间 取材时间
物 质 含 量
抑制物质
生长物质
时间或季节
第二节 外植体（培养物）的选择
4、根据母株位置选择：
具原基结构的外植体：茎尖、 侧芽、原球茎、鳞芽、分生 组织 不具原基结构的外植体：根、 茎、叶、花、果等器官，需要 脱分化。
第三节 外植体（培养物）的建立
防止方法： • 在培养基中加入抗 生素。 • 利用茎尖培养。 • 利用无菌材料。
第三节 外植体（培养物）的建立
抗生素防治内源菌： • 外植体顶芽培养发现的污染、不同采收期外植体存 在的污染和表面彻底消毒后的细菌污染都可能是内 生菌造成的。内生菌的污染，无论用何种表面消毒 方法都不能彻底消除，因此，必须使用抗生素进行 间接防治处理。 • 选用适当的抗生素特别重要。理想的抗生素应该具 备以下特性：可溶性、稳定性、不受pH高低和培养 基差异的影响、无边界效应、广谱性、杀菌性、不 产生抗性诱导、既廉价又对人体无害。
第三节 外植体（培养物）的建立
（3）、褐化发生的可能因素： • 与组培植物品种有关： 不同的植物种与品种之间常有很大差异，有人 把此归结为基因型的不同。一般来说，植物 材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高， 易引起外植体材料的严重褐化。多数木本植 物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物 比一年生草本植物易引起褐化 。
根据细胞全能性学说，植物体的每一个细胞 都含有全部的遗传信息，都能再生出一个 新植株。但是，要使每个细胞的全能性都 表现出来，在目前还是不易做到的事。因 而，外植体（初始培养物）的选择非常重 要。
第二节 外植体（培养物）的选择
1、基因型：
再生能力 （1）、双子叶>单子叶； （2）、被子植物>裸子植物； （3）、双子叶植物中：茄科（Solanacea）；秋海棠 科（Begoniaceae）；景天科（Crassulaceae）； 苦苣苔科（Gesneriaceae）；十字花科（Cruciferae） 再生力特强；郁金香（Tulip）再生力较弱。 （4）、同一种植物中：活体（in vivo）再生力强者， 离体（in vitro）再生力也强。