高产溶纤酶菌株的选育
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达引言：纤溶酶是一种重要的酶类，能够降解纤维素生物质，具有广泛的应用前景。
筛选和克隆高活性纤溶酶菌株成为研究的重要方向。
本文将探讨一种高活性纤溶酶菌株的筛选方法，并介绍其基因克隆表达的技术。
一、高活性纤溶酶菌株的筛选方法1. 环境样品的收集与处理需要采集有可能存在纤溶酶菌株的环境样品，如土壤、沉积物等。
然后，将样品进行过筛处理，以去除较大颗粒物和杂质，得到较为纯净的菌种样品。
2. 纤溶酶的活性测定利用碳水化合物基质（如CMC）来检测样品中纤溶酶的活性。
将样品与基质混合后，在一定温度下反应一段时间，然后通过添加酚红指示剂来判断样品中是否产生了纤溶酶。
3. 分离纯化菌株通过向含有纤溶酶活性的样品中接种在有选择性培养基上，将含有纤溶酶菌株的单个菌落分离出来。
然后，通过连续传代培养，筛选出纤溶酶活性较高的菌株。
4. 提取基因组DNA采用常规方法，从筛选出的纤溶酶菌株中提取出基因组DNA。
5. 纤溶酶基因的聚合酶链式反应（PCR）扩增根据已知的纤溶酶基因序列，设计特异引物进行PCR扩增，以获得纤溶酶基因的DNA片段。
二、纤溶酶基因的克隆表达1. DNA片段的连接和克隆将纤溶酶基因的PCR产物与适当的载体（如pET、pUC等）进行连接，并转化到大肠杆菌中，形成重组菌株。
2. 重组菌株的筛选与鉴定通过对重组菌株进行抗生素筛选、PCR扩增和限制性酶切等方法，筛选出含有纤溶酶基因的目的菌株，并进行序列分析以确保基因的准确性。
3. 表达载体构建与转化将已验证的含有纤溶酶基因的重组质粒进行扩增放大，并用合适的浓度导入宿主菌株中。
4. 培养与诱导表达将含有重组质粒的宿主菌株进行培养，并在适当的时间和条件下通过添加诱导剂（如IPTG）来诱导基因的表达。
5. 纤溶酶表达产物的纯化与活性鉴定通过离心、层析等技术手段，将纤溶酶表达产物从培养物中分离纯化，并进行活性测定。
结论：通过以上筛选和克隆表达方法，可以得到高活性的纤溶酶菌株，并实现其基因的克隆表达。
高产纤溶酶突变株的筛选及发酵条件的优化
高产纤溶酶突变株的筛选及发酵条件的优化
单金津;李靖圆;谢和
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2013(041)006
【摘要】为给纤溶酶的开发应用提供理论依据,以解淀粉芽孢杆菌GZJSI-12为出
发菌株,对高产纤溶酶突变株进行了筛选,并优化了发酵条件.结果表明:经紫外线和2.5％硫酸二乙酯复合诱变获得稳定突变株GZJSI-12-1,菌株产酶活力达1
593.591IU/mL,是出发菌的2.22倍.最佳发酵条件为pH(灭菌前)9.5、接种量6％、装液量30mL/250mL.活力回收率为6.30％,纯化倍数为7.90,比活为
6383.06IU/mg.
【总页数】5页(P110-114)
【作者】单金津;李靖圆;谢和
【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵
州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025
【正文语种】中文
【中图分类】S154.34
【相关文献】
1.高产纤溶酶霉菌固体发酵工艺条件的优化 [J], 闵伟红;李佳;王影;张锦玉;李玉
2.角质酶产生菌Thermobifida fusca WSH03-11诱变及高产突变株发酵条件优化[J], 张守亮;陈坚;华兆哲;堵国成
3.纤溶酶高产菌株筛选及其液体发酵条件研究 [J], 周伏忠;贾蕴莉;陈国参;谢宝恩;王红云
4.高产纤维素酶突变株的筛选及其产酶条件优化 [J], 邹宗胜;王婧雅;赵运英;毛银;邓禹
5.枯草芽孢杆菌产生在β－葡聚糖酶的研究：高产突变株CW－06的选育及其发酵条件的优化 [J], 黄为一;吴江;陈代杰
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一株高产纤维素酶菌的筛选及发酵条件优化
一株高产纤维素酶菌的筛选及发酵条件优化作者：柴明艳来源：《湖北农业科学》 2014年第13期柴明艳（淄博职业学院，山东淄博２５５３１４）摘要：采用羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ）－刚果红平板法，对富含腐烂玉米秸秆的土样进行纤维素酶产生菌的筛选及目标菌株发酵培养条件的优化试验。
结果表明，筛选分离出１０株产纤维素酶菌株，其中有３株菌株产酶效果较好，特别是菌株ｔｇ３１对玉米秸秆水解率高达３７．６２％，其最佳发酵工艺的温度为２８℃，发酵初始ｐＨ５．０，接种量６％，摇瓶转速１８０ｒ／ｍｉｎ，经５Ｌ罐放大试验，得出在１２０ｈ时其滤纸酶活力（ＦＰＡ）可达到１４．２１ＩＵ／ｍＬ。
关键词：纤维素酶；菌株；发酵；玉米秸秆；水解中图分类号：Q９３９．９６文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１４）１３－3141－０4中国是农业大国，每年产生的农作物秸秆总量超过７亿ｔ，约占世界秸秆总产量的１／３［１，２］，其中玉米秸秆产量高达２．２亿ｔ［３］。
玉米秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素等，难以被人类有效利用。
目前，中国玉米秸秆大部分被直接焚烧，不仅对环境造成了极大的污染，同时也浪费了大量的秸秆纤维素资源［４］。
为改变现状，开发纤维素酶降解玉米秸秆，实现废弃资源的生物利用，已逐渐成为该领域的研究热点之一。
纤维素酶可充分降解秸秆中的纤维素，将其转化为微生物可利用的糖类，大大提高玉米秸秆的经济利用价值，该技术在医药中间体、精细化工、食品、饲料及生物能源等领域都有广泛的应用前景［５，６］。
因此，展开高产纤维素酶菌株的选育、发酵工艺条件优化等研究工作，对纤维素的商业化开发具有重大意义。
本研究在玉米秸秆地进行针对性的取样筛选，获得一株高产、高玉米秸秆水解率的菌株，并对其产酶条件进行了摇瓶优化及５Ｌ罐发酵工艺放大，为玉米秸秆纤维素资源的产业化应用打下基础。
１材料与方法１．１材料１．１．１样品采集从辽宁省喀左县富含腐烂玉米秸秆地区取土样若干。
纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶是一种能够分解纤维素的酶，对生物质的利用具有重要意义。
选育纤维素酶高产菌株是提高纤维素酶生产效率的关键。
以下是一些选育纤维素酶高产菌株的常用策略和方法：
1. 采用自然筛选法：从自然环境中采集植物残渣、堆肥等具有高纤维素含量的样品，通过培养和筛选获取纤维素酶高产菌株。
这种方法的优势是能够发现具有适应性强、高纤维素酶产量的菌株。
2. 遗传工程法：通过对已知具有高纤维素酶产量的菌株进行基因工程改造，引入其他有利于纤维素酶产量提高的基因或突变体。
3. 诱变法：通过化学物质（如EMS、亚硝酸钠等）或辐射（如紫外光、X射线等）处理菌株，诱发基因突变，筛选出纤维素酶高产突变菌株。
4. 基因筛选法：通过分析纤维素酶基因的表达水平和调控机制，筛选具有高纤维素酶基因表达水平和调控机制的菌株。
5. 代谢工程法：通过改造代谢途径，优化产生纤维素酶所需的底物和能量供应等因素，提高纤维素酶产量。
以上方法可根据实验室条件和研究目的选择合适的方法进行选育纤维素酶高产菌株。
纤维素酶高产菌株的选育
（Ｕ／ ）来 表 示 。 Ｉ ｍＥ １ ３ 抗 分 解代谢 阻遏 的 突 变株 的选 育过 程 ． １ ３ １ 诱 变处 理 过程 ．．
纤 维 素物 质 的酶 促水 解 具 有 良好 的应 用 前景 。但
是 ，目前所存在的主要问题是酶解效率不高。为提高 纤维素酶解 的效率 ，多采用选育高产纤维素酶菌种和 改变纤维材料的结构 ，提高对酶的敏感性的方法 。选 育优 良菌种是提高纤 维素酶活力的关键 。通常，从 自 然界 分 离筛 选 的野 生 型菌 株 其产 酶 能力 比较 低 。为提 高纤维素酶 活力 ，诱 变育 种是一 种有效 的方法 。 目
基础。
天～１ 天 ，液体培养 ６ ～８ 。 ０ 天 天
１ ２ 分析 方 法 ．
还 原糖 测 定 ：取 上清 液 ，按 照 Ｍｉｅ 方 法 ，使 用 ｌｒ ｌ ＤｉＳ试 剂 测定 还 原 糖 的含 量 。 以葡 萄糖作 为标 准 。 Ｎ 纤 维素 酶 活力 测定 ：采 用 Ｍａ ｄｌ方 法来 测 定 滤 ｎｅ ｓ 纸 酶 活 （ ｉｅ ａｅ ｔ ｉ ，简 称 为 Ｆ Ａ）和 Ｃ ＦｌｒＰｐｒ ｉ ｔ ｔ Ａｃ ｖ ｙ Ｐ ＭＣ 酶 活 （ ＩＣ’ｅ） 其 酶 活 力 单 位 用 国 际 单 位 ＣＶ ａ 。 Ｉ ｓ
高产溶纤酶菌株的筛选鉴定及特性研究
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｎ ｉｅ ｓｒ ｃ ： ｎ Ｂａ ｉ ｕ ｓ ｂ ｌ ｉ ｓｒ ｉ ｓ ｃ ｌ ｓ ｕ ｉ ｔｓ ｔａｎ ｗｉ ｈ ｇ ｆｂ ｉ ｏ ｙ ｉ ｅ ｚ ｍｅ ｃ ｉｉｙ ｌ ｉ ｔ ｈ ｉ ｈ ｉｒｎ ｌｔｃ ｎ ｙ ａ ｔｖｔ ｗｅ ｅ ｃ ｅ ｎ ｄ ｎ ｒ ｓ ｒ ｅ ｅ ａ ｄ
ｃ ａ ａ ｔ ｒｓｉ ｓｏ ｒ ｗｔ ， ｒ ｄ ｃ ｎ ｂ ｉ ｏ ｙ ｉ ｎ ｌ ｃ ａ ｙ ａ ｅ ｏ ｗｅ ｅ ａ ｓ ｎ ｅ ｔｇ ｔ ｄ ｈ ｒ ｃ ｅ ｉｔ ｆ ｏ ｈ ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｆ ｒｎ ｌ ｓｎ ａ ｄ ｇ ｕ ｏ ｍ ｌ ｓ ｆ ｃ ｇ ｉ ＢＳ１ ｒ ｌｏ ｉ ｖ ｓｉ ａ ｅ ．
１ （ ：５ ￣ ６ ８ ５） ９ ３
Ｏｃ ２ ０ ｔ０６
１ ０月
文 章 编 号 ： １０ － ０ ０２ ０ ）５０ ５ －５ ０ ２ ２ ９ （０ ６０ －０ ９０
高产 溶纤 酶菌株 的筛 选鉴 定及特性 研 究
郭德 军，邓景致 ，王欣
（ 龙江 八一 农 垦大学 食品 学 院， 大庆 １３ １ ） 黑 ６ ３ ９
纳 豆 激 酶 （ ａ ｔ ｋ ｎ ｓ ）是 由 日本 学 者 须 见 洋 行 …在 １７ Ｎ ｔ ｏ ｉａ Ｐ ９ ８年 首先 从 纳 豆 中发 现 的 一 种 丝 氨 酸
蛋 白酶 ，该酶不 仅具有 明显的溶栓活性 ，还可 以激活体 内的纤溶酶原 ，从而可增加 内源 性溶纤酶 的 量 。 目前 ，临床 上 用 于 治疗 心 脑 血 管 栓 塞 的 药 品 如 尿 激 酶 （ Ｋ 、 链 激 酶 （Ｋ 、ｔ ｏ ｈ ｍ ｉａ ｃ ａ ａ ｔ ｒｓｉｓ ｔ ｅ ｉ ｃ ｅ ｃ ｌ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔｃ ， ｈ Ｂａ ｉ ｕ ｓ ｂ ｌ ｉ ｓｒ ｉ ｓ ｃ ｌ ｓ ｕ ｉ ｔｓ ｔａｎ ｗｅ ｅ ｉｅ ｔ ｉｄ Ａ ｍｏ ｇ ｈ ｍ ， ｍ ｅ ｉｍ ｌ ｉ ｒ ｄ ｎ ｉ ｅ ． ｆ ｎ ｔ ｅ ｄｕ ｓ ｐ ｒ ａａ ｔ ｆＢＳ ， ｕ ｅｎ ｔｎ ｓｏ １ ＢＳ ｎ ７ ｏ ｌ ｔｏ ｇ ｙ ｉｈ ｂ ｔ ｈ ｒ ｗｔ ｆｓａ ｈ ｌ ｃ ｃ ｕ ｕ ｅ ｓ Ｉ ｄ ｉｉｎ ３ａ ｄ ＢＳ ｕｄ ｓｒ ｎ ｌ ｎ ｉ ｉ ｔ ｅｇ ｏ ｈｏ ｔｐ ｙ ｏ ｏ ｃ ｓａ Ｔ ｕ ． ｎ ａ ｄ ｔｏ ， ｃ
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达一、纤溶酶的生物学功能及应用价值纤溶酶（Fibrinolytic enzyme）是一种能够降解血栓中纤维蛋白的酶，具有溶解血栓、改善微循环、降低血液黏稠度等生物活性，因此被广泛应用于心脑血管疾病的治疗。
纤溶酶还可以在食品加工、皮革制品、纺织品等领域发挥生物催化作用，在环境保护领域也有一定的应用潜力。
二、高活性纤溶酶菌株的筛选以往对纤溶酶菌株的筛选通常依靠于对自然环境中的微生物进行采集和筛选，耗时耗力且效率较低。
而基于基因工程技术的菌株筛选方法将大大提高筛选效率。
通过采集不同环境中的样品，如土壤、水源、动植物组织等，提取其中的微生物菌种。
接着，利用PCR 技术针对纤溶酶基因进行筛选，选择出纤溶酶基因阳性菌株。
通过对菌株的培养和纤溶酶活性的测定，得到高活性纤溶酶菌株。
三、纤溶酶基因的克隆和表达对于获得的高活性纤溶酶菌株，需要进一步对其纤溶酶基因进行克隆和表达。
通过菌落PCR或全基因组测序技术获得纤溶酶基因的全长序列。
将纤溶酶基因的全长序列进行合成，同时在序列两端加入适合目的菌株的启动子、启动子和终止子等控制元件。
然后，将重组的纤溶酶基因导入目的菌株中，通过表达载体将其整合到目的菌株的染色体上。
通过对重组菌株的连续培养和纤溶酶的活性测试，筛选出表达纤溶酶活性高的菌株。
四、优化表达条件和提高产酶量为了进一步提高纤溶酶的产酶量和表达效率，可以通过优化培养条件和表达条件来实现。
优化培养基成分和培养条件，如调整碳源、氮源和微量元素的配比以及培养温度、pH 值和培养时间等参数，来提高菌株的培养密度和产酶量。
利用工程菌株技术对目的菌株进行改良和优化，如通过基因编辑技术改良菌株的代谢途径和产酶效率，通过构建工程菌株来提高目的产物的表达效率。
通过发酵工艺的优化，如选择合适的发酵罐和搅拌速度，控制发酵过程中的氧气和碳源供应等，来提高纤溶酶的产酶量和纤溶酶的纯度。
五、结语基于基因工程技术的高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达方法，可以大大提高纤溶酶的产酶效率和活性，为纤溶酶的大规模生产提供了新的途径。
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达
高活性纤溶酶菌株的筛选与基因克隆表达是一项重要的研究工作，可以通过该研究获取具有高纤溶酶活性的菌株，为纤溶酶的产业化应用提供有力的支持。
本文将从菌株筛选和基因克隆表达两个方面探讨高活性纤溶酶菌株的研究方法。
菌株筛选是高活性纤溶酶菌株研究的首要步骤，可以通过以下几种方法来进行：
第一种是传统的筛选方法，即通过对不同来源的土壤或水样进行分离和培养，结合纤溶酶活性检测方法，筛选出具有高纤溶酶活性的菌株。
这种方法简单易行，但是筛选效率较低。
第二种是通过筛选新颖的环境样品，如深海沉积物、温泉、矿山等特殊环境样品进行筛选。
这些环境样品中可能存在着与常规土壤或水样中不同的菌株，具有更高的纤溶酶活性。
第三种是通过改进培养条件来筛选菌株。
可以通过优化培养基的成分和培养条件，如温度、pH值、氧气浓度等来提高纤溶酶的合成和分泌。
通过这种方法，可以筛选出在特定条件下具有高纤溶酶活性的菌株。
基因克隆表达是高活性纤溶酶菌株研究的另一个重要方面，可以利用重组DNA技术将纤溶酶基因从菌株中克隆并表达。
具体步骤如下：
需要获取纤溶酶基因的DNA序列。
可以通过文献检索或基因测序技术获得。
然后，将纤溶酶基因的DNA序列插入到适当的表达载体中，如质粒或病毒基因组。
接着，将重组载体转化到宿主菌中，如大肠杆菌。
利用适当的选择标记筛选出带有纤溶酶基因的菌落。
随后，通过培养和诱导表达，使宿主菌中的纤溶酶基因得以表达并产生高活性的纤溶酶。
通过纤溶酶活性检测方法，如酶活性测定、酶联免疫吸附试验等，对表达的纤溶酶进行定量和鉴定。
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究研究目标本研究旨在筛选高产纤维素酶的菌株，并优化其产酶条件，以提高纤维素降解效率和产酶量。
方法1. 菌种收集与筛选1.收集土壤、水源等环境样品，分离出潜在的纤维素酶产生菌株。
2.通过平板培养和传代培养，筛选出具有纤维素酶活性的菌株。
2. 纤维素酶活性测定1.利用Congo Red染色法测定菌株的纤维素酶活性。
2.选择具有较高纤维素酶活性的菌株作为后续研究对象。
3. 优化产酶条件1.确定最适pH：在不同初始pH值下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
2.确定最适温度：在不同培养温度下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
3.确定最适碳源：使用不同碳源（如纤维素、木质素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
4.确定最适氮源：使用不同氮源（如蛋白质、尿素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
4. 鉴定菌株1.利用生化和分子生物学方法对优选出的菌株进行鉴定，确定其属于哪个科、属、种。
2.利用16S rRNA基因序列分析确定菌株的系统发育关系。
5. 产酶机制研究1.利用电镜观察菌株在不同培养条件下的形态结构变化。
2.利用基因组学方法分析纤维素酶基因在不同条件下的表达情况。
发现1.从环境样品中筛选出了多个具有纤维素酶活性的菌株，其中某一菌株表现出较高的纤维素酶活性。
2.最适pH为7.0，最适温度为50℃，最适碳源为纤维素，最适氮源为蛋白质。
3.经鉴定，该菌株属于纤维素酶产生菌属，并命名为XX菌株。
4.电镜观察发现，在最适产酶条件下，XX菌株的纤维素酶形态结构清晰可见。
5.通过基因组学方法分析，发现XX菌株在最适产酶条件下纤维素酶基因的表达水平较高。
结论1.通过本研究筛选出了一株高产纤维素酶的菌株XX。
2.最适产酶条件为pH 7.0、温度50℃、碳源为纤维素、氮源为蛋白质。
3.该菌株具有潜力应用于纤维素降解和生物质转化领域。
4.通过深入研究其产酶机制，可以进一步优化该菌株的产酶性能和应用前景。
高产纤维素酶木霉菌株的筛选
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纤 维 素资源 是地球 上 最大 的可再 生资 源 ， 球上 每 年 地
光合作 用 的产 物 高达 １５×１ ～２ ０ｘ１ ｔ ． ０ ． ０ 。
安徽 科技 学院发 酵实 验室保 存 。
１ １ ２ 培养 基 马铃 薯 培 养 基 （ Ｄ 培 养 基 ） 马 铃 薯 ．． ＰＡ ： ２ ０ 、 Ｈ 自然 、 １ ｏ 菌 。 （ 铃 薯 去 皮 ， 成 块 煮 沸 ０ ｇｐ １５Ｃ灭 马 切 ３ ｍｉ， ０ ｎ 然后用 纱布 过滤 ， 加葡 萄糖 １ 再 ２～１ ｇ及琼 脂 １ ｇ ６ ８，
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高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达高活性纤溶酶（Fibrinolytic enzyme）是一种能够降解纤维蛋白聚合物的酶类，具有重要的应用价值。
本文旨在介绍高活性纤溶酶菌株的筛选与基因克隆表达方法。
纤溶酶产生菌株的筛选可采用传统的筛选方法，如菌落筛选、液体培养筛选等。
在筛选菌株过程中，需要注重菌株的纤溶酶活性和产酶能力。
一般可采用琼脂酶纤维素（CMC）平板培养基，将菌株接种在该培养基上，培养一定时间后，通过印迹法或其他方法，观察菌落的透明圈，透明圈越大表示纤溶酶活性越高。
菌株筛选后，需要进行基因的克隆表达。
需要进行菌株的DNA提取工作。
一般可采用常规的细菌DNA提取试剂盒进行提取，如使用酚/氯仿法提取DNA。
提取出来的DNA需要进行酶切，将目标基因片段从总DNA片段中分离出来。
接下来，需要构建目标基因片段的表达载体。
可选择适当的质粒载体，如pET28a等常用的表达载体。
将目标基因片段和载体进行酶切，然后进行连接反应，将目标基因片段插入载体中。
连接后的质粒需要进行转化，转化到大肠杆菌等宿主细胞中。
将连接后的质粒和大肠杆菌进行共培养，使质粒进入大肠杆菌细胞内。
转化后的细菌需要进行筛选，通常采用抗生素筛选法。
将转化后的细菌接种到含有抗生素的平板培养基上，只有带有目标基因的细菌能够生长，从而筛选出含有目标基因的细菌克隆。
进行表达与纤溶酶活性测定。
将含有目标基因的细菌进行培养，经过诱导表达后，收集菌体，进行纤溶酶活性的测定。
在表达过程中，还可以对目标基因进行改造，以提高纤溶酶的表达效率和稳定性。
可以通过点突变、插入、缺失等方法进行基因工程操作。
高活性纤溶酶菌株的筛选与基因克隆表达是一项复杂而重要的工作。
通过仔细的实验设计和操作，可以筛选出高产纤溶酶的菌株，并通过基因克隆表达方法实现纤溶酶的高效表达与功能研究。
纤溶酶高产菌株筛选及其液体发酵条件研究
２ 实验方 法
２１ 纤 溶酶产 生 菌 的分离 筛 选 ．
取 豆豉 等各 种待 分 离食 品 １ ， Ｏｇ加入 １０ｍ ０ Ｌ灭菌 水 中 ， 荡 ，０ 振 １０℃沸 水 煮沸 ５ｍｉ， 止 片刻 后 取上 层 ｎ静
收稿 日期：２０ — ９ １ ０７０ —０
基金项 目：河南省省属科 研单位 社会公益项 目（６ １ ８２ ３ ０４ ０ ０ ） １ 作者简介：周伏忠 （９ ５ ） 男 ， 南浚县人， １６ 一 ， 河 副研究员 ， 硕士， 研究方 向为微生物发酵工程 ．
和 ６ ～ ４ｈ 在优 化条件下 ， ０ ８ ． 菌株 １ 菌株 ２液体发酵最 高酶活分 别为 ３６４ ｍＬ和 ３９７ ｍＬ 、 ０ ．６Ｉ Ｕ／ １ ．６Ｉ Ｕ／ ．
关键词 ：纤溶酶； 菌株 筛选 ； 液体发酵
中图分类号 ：Ｑ９ ９９ ３ ． 文献标识码 ：Ａ
心 脑血 管 疾病 是 当前 危 害人 类健 康 ， 致死 亡 率最 高 的疾 病 之一 ， 中血栓 栓塞 类 疾 病如 脑 栓塞 、 导 其 心肌 梗 塞 、肺栓 塞等 给病 患 者带 来终 身痛 苦 ．治疗 血栓 栓塞 类疾 病 目前 最 为有 效 并且 可 靠 的方法 是 溶栓 疗 法 ． 然 而 ， 统溶 栓药 物如 尿 激 酶 、 激 酶等 具 有 半衰 期短 、 出血 、 传 链 易 口服 无 效等 缺 点 ． 自从 １８ ９７年 日本科 学家 须 见洋行 等【 ｌ 】 从 ｊ 纳豆食 品 中分 离 到一种 具 有 强烈纤 溶 活性 的酶 即纳 豆激 酶 以来 ， 首先 微生 物来 源 的新 型 溶 栓 药物 的研 究 开发 受 到世 界各 国 的普 遍 重 视［４０４ ２，－１ －１１．我 国科 技人 员 也 从我 国各类 传 统 食 品如 豆 豉 、 酒 药
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
14
1.1.3 试剂 1mg/mL 葡萄糖标准液: 葡萄糖置于 110℃烘箱
中烘 2h 至恒重，称取 0.1g 烘好的葡萄糖，溶解并定 容至 100mL。
0.01M 乙酸-乙酸钠缓冲溶液 (pH4.8):A 液：冰 醋酸 6mL，蒸馏水定容至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸 溶 液 ；B 液 ： 称 取 8.2g 醋 酸 钠 ， 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸钠溶液；以 A：B=4：6 的比 例混合，低温冷藏备用。
5g 固 体 曲 湿 料 加 50mL 去 离 子 水 ，30℃ 浸 提 6min，纱 布 过 滤 ，3000r/min 15min，上 清 液 即 为 用 于 测定的固体曲酶液。 1.2.4.2 DNS 法测定波长的确定
取 0.5mL 葡萄糖标准液及 0.5mL 蒸馏水分别置 于 25mL 试 管 中 ，再 各 加 2mL DNS 试 剂 ，沸 水 浴 加 热 5min，流水冷却，蒸馏水定容至 25mL。 将 DNS 试 剂-水(空白)、葡萄糖显色液-DNS 试剂(空白)分别在 波长 400nm～600nm 范围内进行扫描。 1.2.4.3 葡萄糖标准曲线的绘制
第 46 卷（总第 155 期）
Food and Fermentation Technology
第 46 卷（第 1 期） Vol.46，No.1
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
方尚玲，杨丹丹，钱志伟，李小强，陈茂彬*
（发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉 430068）
取 8 支洗净烘干的 25mL 比色管，编号后按表 1 加入标准葡萄糖溶液和蒸馏水， 配制成一系列不同 浓度的葡萄糖溶液。 充分摇匀后， 向各试管中加入 2mLDNS 溶液,沸水浴 5min，取出冷却后用蒸馏水定 容至 25mL，充分混匀。 在选定波长下，以 1 号试管溶 液作为空白对照， 测定其它各管溶液的 OD 值并记 录结果。 以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的 OD 值为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线。 1.2.4.4 内切纤维素酶活[8](Cx，CMC 酶活)
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达摘要纤溶酶是一种重要的蛋白酶，具有广泛的应用价值。
本文以土壤中分离到的纤溶酶菌株为研究对象，通过测定菌株的产酶能力，筛选出了一株高纤溶酶活性的菌株。
并利用PCR技术，克隆出其纤溶酶基因并进行表达。
Abstract一、引言纤溶酶是一种能够分解血栓的蛋白酶，它具有广泛的应用价值。
在医药领域，纤溶酶可以被用于治疗心肌梗塞、脑梗塞等病症；在食品工业中，纤溶酶可以被用于酒类等产品的生产。
因此，研究高活性纤溶酶菌株的分离与筛选、基因克隆与表达等问题，对于纤溶酶的开发与利用都具有重要的意义。
二、实验材料与方法1. 实验菌株的分离与培养将土壤样品接种于固体LB培养基上，经过18~24h的培养后，选取单一菌落，移植到液体LB培养基中，经过18~24h后，进行菌的分离与筛选。
选取培养液中对纤维蛋白水解能力强的菌株，进行测定，最终得到了一株高活性纤溶酶菌株。
3. 纤溶酶基因的克隆利用PCR 技术，基于高活性纤溶酶菌株的基因组DNA，设计纤溶酶基因的引物，并进行PCR扩增。
PCR前向引物为 5'-ATGTCGTGCCACCCAGGAAAG-3'，PCR反向引物为5'-TCAATACGGTT TAGTTTCGGCTTTT-3'。
PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2 μl，2.5 mM MgCl2 2.0 μl，10 mM dNTPs混合物1 μl，每只引物0.5 μl，稀释的基因组DNA 2 μl，TaKaRa TaqTM DNA聚合酶,5 U/μl 0.2 μl，双蒸水12.3 μl，共计20 μl。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，再变性1min，退火57℃ 1min,延伸72℃1min，循环30次，最后延伸72℃10min。
将PCR扩增得到的纤溶酶基因进行酶切，然后将其与表达载体pET-28a（+）连接。
接着将得到的重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并进行诱导表达。
高产纤维素酶菌株选育及其产酶工艺的研究
高产纤维素酶菌株选育及其产酶工艺的研究
王静蕾;李嘉琪;樊津池;宋丽芬;曲威
【期刊名称】《陕西农业科学》
【年(卷),期】2024(70)2
【摘要】为获取高产纤维素酶的菌株,本研究以潮湿纤维单胞菌(Cellulomonasuda)为研究对象,采用紫外诱变方式进行菌株突变,通过刚果红选择培养基筛选,以及测定纤维素酶活性后得到菌株W3,酶活高达37.6 U/mL,较初始菌株提升了49.4%。
经传代十次后仍有较高酶活,结果说明该突变菌株遗传性状稳定且产纤维素酶能力强。
对突变菌株进行单因素优化实验确定最优培养条件,后对关键因子通过正交实验确定最佳参数。
最佳培养条件为:12.5 g/L蔗糖,2 g/L硝酸铵,2 g/L磷酸二氢钾,菌悬液接种量体积比3%,pH=6.0,发酵培养温度35℃。
优化后酶活性达43.06 U/mL,极显著高于原始菌株(P=0.008 9<0.01),较最初菌株酶活性提高了78.7%。
研究结果可为高效降解纤维素提供一定理论依据和应用价值。
【总页数】6页(P8-12)
【作者】王静蕾;李嘉琪;樊津池;宋丽芬;曲威
【作者单位】中国农业大学烟台研究院
【正文语种】中文
【中图分类】S141.4
【相关文献】
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纤溶酶生产菌株的筛选、诱变及发酵工艺的研究的开题报告
纤溶酶生产菌株的筛选、诱变及发酵工艺的研究的开题报告题目：纤溶酶生产菌株的筛选、诱变及发酵工艺的研究一、研究背景和意义：纤维蛋白溶解酶（Fibrinolytic enzyme，简称纤溶酶）是一种能够溶解纤维蛋白、促进纤维蛋白溶解产物清除的酶类。
具有抗凝、抗炎、抗菌、消肿解毒等多种生物学活性，对心血管病等疾病的治疗具有重要意义。
因此，纤溶酶的研究和开发一直受到广泛关注。
目前，纤溶酶的生产主要依靠微生物发酵技术，而纤溶酶生产菌株的筛选和诱变则是提高纤溶酶产量和活性的重要途径。
同时，在生产过程中优化发酵工艺也是提高纤溶酶产量和活性的关键，因此对纤溶酶生产菌株的筛选、诱变及发酵工艺的研究具有重要意义。
二、研究内容和方法：本研究将以呈现高纤溶酶产能的菌株为基础，对其进行诱变，试图获得更高的纤溶酶产量和活性。
同时，将对不同变异菌株进行筛选，优选出纤溶酶产量和活性较高的菌株，并探索其发酵工艺进行优化。
具体的研究过程将包括以下方面：1. 纤溶酶生产菌株的筛选：根据文献报道，寻找已知纳种中纤溶酶活性较高的菌株作为研究对象，或从样品中分离获得纤溶酶生产菌株进行初步筛选。
2. 诱变：采用物理法和化学法对纤溶酶生产菌株进行诱变，通过比较不同变异菌株的纤溶酶产量和活性来优选变异菌株。
3. 发酵条件优化：对优选的纤溶酶生产菌株进行发酵条件的优化，包括菌种预处理、发酵温度、pH值、培养基配方等。
4. 纤溶酶产量和活性的测定：采用UV吸收光度法测定纤溶酶产量，同时采用凝块酶法和定量法测定纤溶酶活性。
三、预期结果和意义：本研究预期可以有效地筛选和诱变出纤溶酶产量和活性较高的菌株，并且可以优化其发酵工艺，进一步提高纤溶酶的产量和活性。
同时，对纤溶酶的生产技术和应用也将有所贡献。
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达
高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达摘要：本文探讨了高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达的方法。
首先介绍了纤溶酶在医药、食品、环保等领域中的应用价值，然后阐述了纤溶酶的产生机理与分类，以及纤溶酶活性的测定方法。
接着，介绍了纤溶酶的生物合成过程，包括纤溶酶基因的结构和功能以及其在细胞内的表达调控机制。
最后，讨论了基于现代分子生物学技术的高活性纤溶酶菌株筛选和基因克隆表达方法，包括利用基因工程技术构建表达载体、引入表达宿主并进行蛋白表达和纯化等步骤。
本文旨在为研究员提供关于高效筛选和表达纤溶酶基因的参考。
引言纤溶酶是一种酶类蛋白质，能够水解体内产生的纤维蛋白，分解血栓以及参与血管内皮细胞的功能调节。
因此，在医药、食品、环保等领域中有广泛的应用价值。
随着分子生物学等技术的发展，越来越多的研究者开始从基因水平上探讨纤溶酶的合成机理和调控机制，并应用现代分子生物学技术进行纤溶酶基因克隆及表达。
本文将介绍纤溶酶基本的产生原理、分类和生物合成过程，并着重讨论现代分子生物学技术在高效筛选和表达纤溶酶基因方面的应用。
一、纤溶酶的产生原理与分类纤溶酶是由微生物或动物体内产生的酶类蛋白质，可分为真纤溶酶和假纤溶酶两类。
真纤溶酶是指以纤维蛋白为底物，仅水解纤维蛋白，并不引起其他蛋白质的水解。
而假纤溶酶则具有水解多种蛋白质的能力。
真纤溶酶根据对纤维蛋白的结构特征不同可分为α、β、γ三种类型。
其中，α型纤溶酶可将原纤维蛋白（Fib）和纤原蛋白（FDP）裂解为可溶解性的肽段，转化为FDP。
而β型及γ型纤溶酶则只能将FDP分解为D和E两部分。
二、纤溶酶的活性测定方法纤溶酶活性的测定方法尤为重要，常见的方法包括酶联免疫吸附试验法（ELISA）、凝血酶原时间测定法（PT）、激活部分凝血酶时间测定法（APTT）等。
三、纤溶酶的生物合成过程纤溶酶是由蛋白质转化而来的酶类物质，在体内的合成也是一系列的生化反应经过。
其基因的表达会受到环境、营养条件和基因组结构等的影响，并与一些生物信号通路相结合，进而实现纤溶酶在体内的生物合成。