第十章 固定化酶与固定化细胞技术
酶和细胞的固定化
交联法
交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶 分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化 方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添 加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定 化酶。
交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定 酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较 难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法 的辅助手段。常用的双功能试剂有戊二醛、己 二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用 最广泛的是戊二醛。
共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定 化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载 体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先 用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某 些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价 键。
共价结合法的优缺点
共价结合法所得的固定化酶与载体结合比较牢 固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前 研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较 其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更 加严重。
缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度、 离子强度等条件的变化都易使酶从载体脱落， 并且污染催化反应产物。
离子结合法
离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交 换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载 体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换 树脂，如DEAE-纤维素 、AmberliteCG-50 、 XE-97和Dowex-50等。
物理吸附法：是利用酶和载体间的非特异性物 理吸附作用将酶固定在载体表面，这些物理吸 附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电 作用等。
物理吸附法的优缺点
优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很 大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯 化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不 变，因此对酶的催化活性影响小。
如光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化 酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于 条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。
固定化技术应用-酶和细胞的固定化
固定化技术应用－酶和细胞的固定化试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。
选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。
也就是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。
问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固定化细胞？011.固定化酶技术固定化酶技术是用物理或化学手段。
将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
2.固定化酶技术的发展以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。
科学家们就开始了同定化酶的研究工作。
1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。
我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。
当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。
邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。
Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。
酶工程第10章固定化酶催化的动力学特征)
一些酶在溶液中和固定化后的米氏常数值
酶
底物
固定化试剂
肌酸激酶 乳酸脱氢酶 α－糜蛋白酶 无花果蛋白酶 胰蛋白酶
ATP NADH N-乙酰酪氨酸乙酯 N-苯酰精氨酸乙酯 苯酰精氨酰胺
无（溶液酶） 对氨苯基纤维素
当 Da <<1时，酶催化的最大反应速度要大大 慢于底物的传质速率，此时该反应过程由反应动 力学控制；当 Da>>1时，底物的传质速率大大慢 于酶催化的最大反应速度，此时该反应过程由传 质扩散控制。
外扩散限制效应
（2）作图法求[S]i值和Vi值
根据 Vm[S]i
Km [S]i
kLa ([S]0
[S ]0
[S]0 [S]0
外扩散限制效应
引入 [S] [S]i ， K K m ，并定义 Da Vm ，
[S ]0
[S ]0
k L a [S ]0
[S ]i
Vm [S]0 1 [S]i
kLa [S]0 K m [S]i
[S ]0
[S]0 [S]0
Da [S] 1 [S] K [S]
Viห้องสมุดไป่ตู้
Vm [S ]0 Km [S]0
V0
在这种情况下，酶反应速度不受传质速率的 影响，为该酶的本征反应速度，或称在此条件下 可能达到的最大反应速度，用V0表示。
外扩散限制效应
当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应 速度很快，此时传质速率成为限制步骤。固定化 酶外表面上的底物浓度趋于零，有
Vi k L a[S ]0 Vd max
kLa ([S]0
[S]i )
固定化细胞技术
固定化细胞技术（简称IMC），也称固定化微生物技术，是指通过 化学或物理手段，将微生物细胞固定在载体上使之成为不悬浮于水但仍保 留其固有的生物催化活性，在适宜条件下能被重复连续使用的生物工程技 术。最初主要用于工业微生物发酵中。70年代后期，由于水污染问题日 益严重，迫切需要开发高效废水处理技术。于是人们开始考虑将固定化细 胞技术引入废水处理领域。该技术可将筛选出的优势菌种或微生物加以固 定，从而构成一个高效的废水处理系统。
Thank you！
2、包埋法 包埋法的原理是将微生物细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的
网络空间中或埋于半透膜聚合物的超滤膜内，通过聚合作用、离子网络形 成、沉淀作用，以及通过改变溶剂、温度、pH 值来阻止细胞的泄漏，同 时能让底物渗入和产物扩散出来。
目前应用最为广泛的是凝胶包埋法固定大肠杆菌细胞。与液体发酵 相比，包埋的大肠杆菌生产周期短、产物分离方便、能耗低、设备投资少 且大大改善操作条件。包埋法仍存在一些不足，如包埋材料对细胞的毒性 作用、材料本身阻碍大分子底物和氧的扩散、使用过程中的杂菌污染等， 这些还需要进行更深入的研究。
（5）在反应器内长时间运转过程中，固定化系统具有良好的机械稳定性 和化学稳定性； （6）用于制备固定化细胞的载体对细胞来说是惰性的，不损伤细胞； （7）固定化系统使底物、产物和其他代谢产物能够自由扩散，因为产物 和其他代谢产物常常能抑制细胞的酶反应，更需要能够尽快扩散，以消 除抑制作用； （8）单位体积的固定化系统拥有尽可能多的细胞，以更后，氧和底物的传质速率也发生了变化，尤其是采用多 孔载体时，由于载体的作用，使得反应系统中主体的底物浓度及氧浓度与 微生物所处区域的底物及氧浓度发生差异，从而引起固定化后传质效果的 变化。通常，固定化后氧传质收到的阻碍更为明显，因此在好氧条件下， 由于氧传质的限制，固定化微生物处理的废水中的有机物浓度不能过高， 以免限制高密度的微生物活性的充分发挥；在厌氧条件下，由于不存在氧 传质供应的问题，废水中有机物的浓度可以大大高于好氧情况。所以，固 定化微生物的高处理能力可以得到充分体现，而且可以长时间地保持较高 的生物量和活性，充分显示出固定化微生物的优越性。
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗：将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2～3 次
↓ 发酵：将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，25 ℃下发酵 24 h
3．用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中，常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4．固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中，生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ，所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔， 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ，说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就过少；海 藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近， 尤其是大分 子物质，反 应效率下降
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。
（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。
（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。
（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。
（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。
b.提高了果糖的产量和品质。
2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。
（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。
二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。
葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。
活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
酶与细胞的固定化
酶与细胞的固定化
一、为什么要进行酶的固定化？
（1）游离酶的稳定性较差：在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。
(2)游离酶难于连续化生产：酶与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用。
这种一次性使用酶的方式，不仅使成本较高，而且难于连续化生产。
(3)游离酶给下游的纯化工作带来了难度：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难。
二、固定化酶的概念：是指固定在载体上或被限制在一定的空间范围内，能连续进行催化反应，且反应后能回收并重复利用的酶。
三、固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。
也称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。
四、与游离酶相比，固定化酶优缺点各在哪里？
固定化酶优点：
五、固定化方法有哪几类？各类的优缺点及适合范围是什么？
酶固定化的方法很多，主要可分为载体结合法、交联法、包埋法和热处理法等。
现分述如下；。
吸附法思考!直接使用酶固定化酶与固定化细胞各有什么优缺点
练习:
1、制备固定化酵母细胞的过程中错误的是（
）
A、取干酵母，加入蒸馏水，使其活化
B、配制海藻酸钠时，加热用大火，直到海藻酸钠溶化为止
C、将溶化好的Βιβλιοθήκη 藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵
母细胞
D、将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右
2、下列叙述不正确的是（
）
A、从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶容易
B、固定化细胞比固定化酶对酶的活性影响更小
C、固定化细胞固定的是一种酶
D、将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化细
胞技术
一种酶只能催化一种 化学反应，而在生产 实践中，很多产物的 形成都通过一系列的 酶促反应才能得到的。
固定后的酶或细胞与
成本低，操作更容易。
反应物不容易接近， 可能导致反应效果下
降等。
三、实验操作
（一）制备固定化酵母细胞
1、酵母细胞的活化
思考： 关于酵母菌你知道哪些知识？ 什么是活化？ 怎样活化？ 应注意什么？
固定化细胞固定的是一系列酶 4．如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应 该选择哪种方法？ 固定化细胞技术
5．如果反应底物是大分子物质，又应该采用哪种方法？ 固定化酶技术
1、 对固定酶的作用影响较小的固定方法 是什么？
吸附法。
2、 将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵 过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、 细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固 定（酶、细胞）。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L 的CaCl2溶液
3、配制海藻酸钠溶液
应当注意什么问题？ 1、加热时要用小火，或者间断加热 2、海藻酸钠的浓度 浓度过高——将很难形成凝胶珠； 浓度过低——形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，
固定化酶与固定化细胞
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
第十章 固定化酶2010
究，并第一次实现了酶的固定化。
1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化 研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。 氨基酸的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这 是世界上固定化酶用于工业的开端。
1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-
1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆
2、微囊化包埋法（微囊型） 微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体中。 微囊型固定化酶通常是直径为几微米到几百微米的球 状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和 产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。 胶囊和脂质体主要用于医学治疗。 作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲 基丙烯酸甲酯等。
三、包埋法
1、凝胶包埋法（胶格包埋法）（网格型） 将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ： 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液 中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合， 结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的 机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的 同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。 K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶可与二、三价金属 离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固 定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 海藻酸钠、胶原和明胶也是常用的包埋载体。
（二）固定化酶性质的改变 1.活力变化 固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专 一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因： 酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变 化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。 固定化后的空间障碍效应的影响。 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近 受阻。
（2）界面聚合法：是利用亲水性单体和疏水性单体在 界面发生聚合的原理包埋酶。 它所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包 埋过程中发生化学反应而失活。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种将酶或细胞固定在载体上的技术，以使其具有更好的稳定性和重复使用性。
固定化技术已被广泛应用于生物医学、工业、环境等领域。
下面将对酶及细胞固定化技术进行详细介绍。
酶是生物催化剂，广泛应用于食品、医药、化工等领域。
传统的酶工程主要基于游离酶，但是游离酶不具有稳定性和重复使用性弱的缺点，这就限制了其在工业生产方面的应用。
而酶固定化技术可以通过化学或物理方法将酶固定在载体上，使其具有更好的稳定性和重复使用性。
1. 化学固定法化学固定法是一种通过共价键连接酶和载体的方法。
该方法基于酶和载体之间的化学交互作用，通过改变酶的分子结构，以使其固定在载体上。
化学固定法适用于固定生物分子化学性质类似的酶，并产生最小的影响，请酶的活性。
物理固定法是一种通过物理作用将酶固定在载体上的方法。
该方法基于酶和载体之间的物理交互作用，如静电吸附、离子交换、锁链和凝胶气相沉积等。
物理固定法适用于固定易溶胶的酶，以保持酶活性和稳定性。
细胞固定化技术是将细胞固定在载体上的方法。
固定细胞后，其活性和稳定性得到提高，使得其在工业生产中得到广泛应用。
细胞固定化技术分为两类：静态和动态。
静态细胞固定化技术通过静止相来实现细胞固定化。
最常用的静态细胞固定化技术包括：微囊化、凝胶微囊化和包埋。
微囊化是将细胞封装在聚合物或蛋白质材料中，以形成筛网结构，使细胞能够在载体上安全地生长。
凝胶微囊化是将细胞悬浮在凝胶中，以形成凝胶微囊。
包埋是将细胞置于凝胶、聚合物或其他材料中，以固定细胞并形成细胞团块。
动态细胞固定化技术使用特定装置来保持细胞与载体的稳定性。
最常用的动态细胞固定化技术包括：滤池、旋转生物反应器、循环床反应器。
滤池是将细胞置于纤维滤袋中，以滤分离细胞并悬浮于培养液中。
旋转生物反应器是将细胞与载荷一起旋转，并同时提供氧气和培养液以促进细胞的生长。
循环床反应器是将细胞与载体在床中循环，以提供一定的氧气和培养液。
生化工程固定化酶和细胞
底物从反应液传递到载体表面 （外扩散）
↓
底物从载体表面移向酶活性中心 （内扩散）
↓
底物与酶反应
↓
产物由反应位点移向载体表面 （内扩散）
↓
产物传递到反应液中（外扩散）
¾ 总的反应速度取决于最慢的步 骤
就是说固定化酶反应过程是由底物及产物的外 扩散、内扩散及反应等一系列分过程组成的。 传质过程必然影响到总体过程的速率。
④选择率Ssp (selectivity)
当反应过程中有副反应发生，除生成目的产物 外，还生成其它产物时，通常使用选择率这个概 念。
Ssp是指实际转化成目的产物量与全部底物可生
成产物S的sp 理= 论as量p (之sp0 比− 。s)
式 中 asp代表1摩尔底物能生成目的产物P的理论量 （摩尔），其数值取决于反应的计量式。
这种由物质扩散引起的固定化酶反应动力学与 游离酶间的差异称为扩散效应。
一般规律为： ①这种效应对反应速度的影响程度既取决于该效
应本身的大小，也取决于它和酶反应固有速度的 相对大小。这就是说，如果酶反应本身的速度很
小，扩散限制产生的影响也就小一些；反之，扩 散限制就将在整个过程起律速作用。
将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床， 然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现 酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液 (含产物)。在柱床中，液体流动状态接近于平推 流(又称活塞流)型，因此，填充床反应器可以近 似地看成是一种平推流型反应器。
填充床反应器
带循环的填充 床反应器
由于它且有高效率、易操作、结构简单等优点， 因而是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反 应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体 颗粒、强度不大的底物溶液，以及有产物抑制的 转化反应。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种将酶或细胞固定在某种材料上，以便进行特定反应的技术。
这种技术可以有效地提高反应速率、稳定性和重复使用性，广泛应用于生物技术、食品工业、环境保护和医药领域。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的原理、应用和未来发展方向。
酶及细胞固定化技术的关键在于将酶或细胞固定在一种载体上，以便进行特定反应。
常用的载体材料包括天然材料如海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇等，以及合成材料如聚丙烯酸酯、氧化硅、氨基硅烷等。
通过交联、吸附、包埋等方法，将酶或细胞与载体结合在一起，形成固定化的酶或细胞系统。
固定化技术的主要优点在于可以提高酶或细胞的稳定性和重复使用性。
通过固定在载体上，酶或细胞可以更好地抵抗外界因素的影响，如温度、pH值、离子强度等。
固定化的酶或细胞可以通过简单的分离和回收，实现反应产物的纯化和酶的再利用。
二、酶及细胞固定化技术的应用酶及细胞固定化技术在生物技术、食品工业、环境保护和医药领域有着广泛的应用。
1. 生物技术领域在生物技术领域，酶及细胞固定化技术被用于生产化学品、药物和生物燃料。
以葡萄糖氧化酶为例，固定化的葡萄糖氧化酶可以用于葡萄糖检测、生物传感器以及生物燃料电池中。
固定化的工程酶也被用于合成生物材料、精细化学品和医药中间体，以实现高效、环保的生产过程。
2. 食品工业领域在食品工业领域，酶及细胞固定化技术被用于食品加工、酿造和酶制剂制备。
在酿造过程中，固定化的酵母细胞可以实现连续发酵，提高酒精产率和控制发酵过程。
而在食品加工中，固定化的酶可以用于降解醣类、蛋白质和脂肪，改善食品的口感和营养价值。
3. 环境保护领域在环境保护领域，酶及细胞固定化技术被用于废水处理、土壤修复和污染物降解。
固定化的微生物可以被用于处理含有重金属、有机物和氮、磷等污染物的废水，减少对环境的影响。
固定化的酶也可以用于土壤修复，去除油污和有机污染，改善土壤的质量。
4. 医药领域在医药领域，酶及细胞固定化技术被用于药物的制备、生物传感器和组织工程。
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• 2、凝胶包埋 • 希望药物能够较长时间维持一个稳定 的血药浓度,可采用凝胶包埋法，即用生 物相容性好的高分子聚合物与药物混合 制正含有药物的凝胶.植入体内特定部位 以达到缓释给药的效果．
• 3 微球制剂 • 用高聚物微球包埋或比学偶联药物可 制成微球制剂，它具有靶向性．缓冲性 及减少抗药 性等特点；微球与靶细咆 接触，可以通过胞饮进入胞内发生作用 不影响细胞膜通透性.不会产生 产生抗 药性，早期使用的微球制剂不被生物降 解，多为口服制剂．
二、利用固定化微生物细胞(酶)制造生物 传感器
• 生物传感器是由固定化生物细胞或酶与各种 能量转换器，密切结合而成的传感装置． • 通常由感受器；换能器和电子线路三部分组 成。 • 当待测物质通过传感器时固定在感受器上亲 和配基与待测生物分子相互作用的瞬间发生 能量的转栘。经过换能器，以电或光等物理 讯号,方式输出，经过电子系统放大处理显示, 就可以测出物质的量.
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固 定化酶的过程。 固定化酶的形状： 颗粒---工业发酵 线条----工业发酵 薄膜---酶电极 酶管---工业生产（机械强度大）
固定化酶的特点
优点：1.可多次使用，且酶的稳定性提高。 2.反应后，酶易与底物和产物分开。 3.反应条件易于控制 。 缺点：1.费用太高。 2. 大分子的底物不易使用。
二、偶联率及相对活力的测定
• 固定化酶的活力回收是指固定化后固定 化酶（细胞）所显示的活力占被固定的 等当量游离酶(细胞）总活力的百分数。
• 偶联率＝1时．表示反应控制好，固定化酶失 活不明显； • 偶联率＜１时，扩散限制对酶活力有影响； • 偶联率＞1时．有细胞分裂或从载体排除抑制 剂等原因。
(四) 交联法
• 是用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的 交联形成共价键,得到交联网架结构的方 法。 • 最常用的交联试剂是戊二醛，还有双重 氮联苯胺等。
以戊二醛为例说明如下：
（五）非共价结合法
• 对于在水不溶的有机相中进行的反应。 • 包括： • 1.结晶法—使酶结晶而实现固定化的方 法。 • 2.分散法—将酶分散于水不溶相中实现 固定化的方法。
三、固定化酶（细胞）的半衰期
• 操作稳定性是影响固定化酶（细胞) 实 用的关键因素． ห้องสมุดไป่ตู้ 半衰期----在连续测定条件下，固定化酶 （细胞）的活力下降为最初活力一半所 经历时间，以t1/2表示。
• 半衰期是衡量稳定性的指标．
• 固定化酶（细胞）活力随时间成指数关系， 半衰期：
第五节
固定化技术的应用
固定化细胞
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为 细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的 细胞称为固定化细胞。 特点： 1. 无需进行酶的分离和纯化。 2. 细胞本身含有多酶体系，可催化一系列反应。 3. 酶的辅助因子可以再生，稳定性高。 4. 保持酶的原始状态，酶的回收率高。 5. 抗污染能力强。
（2）离子吸附法
• 酶通过离子键吸附于有离子交换基的载 体的固定化方法。 • 阴离子交换剂： DEAE-纤维素， DEAE-葡萄糖凝胶等 • 阳离子交换剂： 羧甲基纤维素等
离子吸附法
• • • • • • 优点： 1.操作简单； 2.条件温和； 3.回收率高； 缺点： 酶易脱落；
蛋白质在载体上的吸附和解吸与下列因素有关。
• 1. 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚
胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的 化学修饰后固定在超滤器中。
• 2. 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。
辅酶固定化的形式：
第三节 细胞的固定化
•将细胞限制或定位于特定空间位置的方 法称为细胞固定化技术。 •被限制或定位于特定空间位置的细胞称 为固定化细胞。
三、影响固定化酶的因素
酶本身的变化
影响固定化酶的因素
载体的影响
第二节 辅酶和辅基的固定化
原因
• 辅酶固定化 方法 形式
辅酶固定化原因
• 1）辅酶因子中特殊化学基团参与催化反应；
• 2）辅酶因子流失，且不能再生； • 3）辅酶因子价格昂贵；
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留 和再生。
辅酶固定化的方法：
药物的新剂型
• 药物的新剂型特点---合理给药体系，即是从 时间和空间分布上控制药物的释放。 • 药物的新剂型包括：聚合的修饰、凝胶包埋、 微球、脂质体及免疫导向等；
• 控释体系将药物与聚合物载体偶联或固定于 某种聚合物载体上，称为载体药物。
• 1．聚合物修饰 • 多用于蛋白质类药物；这类药物半衰 期短,免疫原性强,可用适当水溶性高分 子聚合物加以改善其性能。例如，用甲 基壳聚糖对天冬酰胺酶的修饰及聚乙二 醇对原核表达重组人血小板生成素分子 的修饰等，均可起到降低毒性；延长半 衰期的作用
影响固定化酶最适pH因素主要有两个： 1.载体的带电性质；
负电的载体固定化酶，最适pH比游离酶高； 正电的载体固定化酶，最适pH比游离酶低； 电中性的载体固定化酶，最适pH一般不改变。
2.酶催化反应的产物性质。
产物为酸性时，固定化酶的最适pH比游离酶高； 产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低； 产物为中性时，最适pH一般不改变。
（三）共价结合法
• 酶蛋白分子上功能团和固相支持物上的 反应基团之间形成化学共价键的方法。 功能团: • 酶分子N端:α-氨基，ε-氨基． • 酶分子C端: 羧基、疏基、羟基、苯环 等。
• 优点： • 酶和载体之间的连接很牢固，不会发生酶的 脱落，稳定性较好。 • 缺点: • 1.载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条 件也比较剧烈。 • 2. 若共价结合包含酶活性中心有关的基团， 会导致酶的活力损失。
一、固定化酶制备的方法
• 固定化酶的制备方法大致可分为4类： ①吸附法； • ②共价结合法； • ②交联法； • ④包埋法。
（一）包埋法
• 它是一种用物理方法将酶包埋在高聚物 内，反应条件温和．并且不改变酶结构 的固定化方法。 • 包埋法又可分为 • （1）网格型； • （2）微囊型；
• 1．网格型：材料有聚丙烯酰胺、三醋 酸纤维、淀粉、硅胶、血纤维和胶原等。 • 2．微囊型：悬浮液被包裹在膜内，使 酶存于类似细胞的环境中，阻止了酶的 脱落。小分子底物则能迅速通过膜与酶 作用，产物扩散出来。
（三）最适温度变化
1.固定化酶的最适作用温度一般与游离 酶差不多，活化能也变化不大。
2.由于固定化后，酶的热稳定性提高， 所以最适温度也随之提高。
（四）固定化酶稳定性
• 固定化酶对热、各种变性剂的耐受性增 强，稳定性提高。 固定化酶稳定性提高的原因： • 1. 酶分子与载体多点连接，可防止酶变 形； • 2. 酶活力的缓慢释放； • 3. 抑制酶的自降解；
三、固定化细胞的性质
• 与固定化酶和游离的细胞比较：
（一）目的产物的产量提高；--高密度生长。 （二）克隆基因产物的表达；--连续操作。 （三）质粒遗传稳定性；--P+和P-细胞无法在胶 粒中竞争。
四、培养条件对质粒影响
• • • • • • 1. 接种量------重组数增多； 2. 固定化颗粒数-----细胞数增多，稳定性高； 3. 介质浓度------扩散下降，转化反应下降； 4. 营养物质-----影响质粒稳定性； 5.培养温度及pH-----影响转化产量； 6.溶解氧浓度------影响质粒稳定性；
• 微主物细胞固定化后,受载体影响，只用于生产各种能 够分泌到胞外产物 。 • 一、利用固定化微生物生产各种产物 • （1）酒精、酒类。生产酒精、啤酒、葡萄酒。 • （2）氨基酸。谷氨酸、赖氨酸、精氨酸等。 • （3）有机酸。苹果酸，柠檬酸．葡萄糖酸．衣康酸。 • （4）酶和辅酶。淀粉酶．糖化酶；蛋白酶等。 • （5）抗生素。
（二）吸附法
含酶水溶液和吸附剂接触，经洗涤除去 不吸附的酶便能制得固定化酶。 吸附法包括： • （1）物理吸附法； • （2）离子吸附法；
（1）物理吸附法
常用吸附剂： • 无机载体：高岭土、膨润土、磷酸钙凝 胶、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、白土、 羧基磷灰石等； • 有机载体：淀粉、离子交换树脂、琼脂 糖的烷基衍生物等；
二、固定化酶的性质
（一）固定化酶的活性
• 固定化酶的活性较水溶性酶有所下降。 • 原因： • 1.酶分子空间结构的变化，影响活性中心氨基酸。 • 2.空间位阻影响底物与酶的定位作用。 • 3.内扩散阻力影响底物与酶的接触。 注： • 个别固定化酶活力增强可能是酶得到化学修饰或稳定 性增加。
（二）最适pH的变化
第四节 评价固定化酶生物催化剂的指标
• 一、固定化酶(细胞）的活力 • 定义：----固定化酶细胞催化策一特定化学反应的能 力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的 反应的速度来表示。 • 固定化酶（细胞）的单位可定义为每毫克干重固定化 酶（细胞）每分钟转化底物（或生产产物）的量。 μmol.min-1
• 1．pH：PH能影响载体蛋白质的电荷，
从而影响菌在载体上的吸附。一般情况 下，在蛋白质的等电点可以达到最大吸 附。 • 2．盐：一般认为盐阻止吸附，盐也被 用来洗脱从低盐溶液中吸附的酶。 盐可以促进蛋白质吸附在惰性支持物上， 即称“盐析”吸附。
• 3. 酶浓度：一般在一定量载体上的吸附，总 是随酶浓度的增加而增加，直到饱和。 • 4．温度：通常随温度升高而增加酶的吸附， 但温度升高会造成酶失活的加速。 • 5．吸附速度：酶在固体支持物上吸附速度 比较缓慢, 是由于酶的扩散速度较低所致。 • 6．载体：影响酶活力的重要因素是载体表 面积、多孔度及载体的预处理。
• 4．脂质体 • 脂质体是磷脂双分子层在水溶液中,自发 形成超微中空小泡，它同微球制剂一样 都有靶向性；长效性．并且可以通过胞 饮作用向胞内释放药物从而避免抗药性.
• 5．导向药物 • 导间药物具有主动靶向性；将针对肿瘤细 胞的单克隆抗体与化疗药物交联，直接作用 于肿瘤细胞产生杀伤作用，并且降低全身毒 性但是抗体药物复合物与肿瘤细胞结合数目 有限，难于有效手伤肿瘤细胞。因而用毒性 强烈的毒素取代化疗药物制备免疫毒素，具 有更强烈的杀伤效果,免疫毒素还可用于骨髓 移植中，供体骨髓中T细胞的选样性杀伤以避 免栘植物抗宿主病的发生.