Marc—145细胞传代培养条件优化
猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备和鉴定
猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备和鉴定李建;廖园园;朱微;曹娟;秦伟;漆世华;谢红玲;杨雷【摘要】以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA、IPMA和IFA试验进行杂交瘤筛选,共获得2株能分泌针对PRRSV单克隆抗体(简称单抗)的杂交瘤细胞株,分别命名为3D10和4H11,3D10亚类为IgG1,4H11亚类为IgG2b,单抗腹水的间接ELISA效价均达到1.0 ×10 7,染色体数目介于90～110之间.2株单抗与猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应,IPMA和IFA结果显示单抗均能与接种于猴肾细胞(Marc 145)的PRRSV发生特异性反应,证实抗PRRSV单抗具有良好的特异性和敏感性,为PRRSV 抗原表位分析及相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2013(047)012【总页数】4页(P1-4)【关键词】猪繁殖与呼吸综合征病毒;单克隆抗体;特异性;敏感性【作者】李建;廖园园;朱微;曹娟;秦伟;漆世华;谢红玲;杨雷【作者单位】武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高度接触性传染病，又称“蓝耳病”[1]。
该病以怀孕母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪呼吸困难、高死亡率和育肥猪呼吸异常为特征，也称“猪不孕与流产综合征”[2]。
实验方案
实验方案繁殖障碍类病毒病(PR、PP、PRRS)弱毒疫苗的研制1. 病毒的克隆1.1 细胞制备原种细胞系（MARC－145，IBRS－2）复苏、传代1.1.1复苏（a）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即置37℃水浴中不断摇晃，待融化后，将细胞倒入25mL的克氏瓶中，加入含10％BCS的MEM生长液，37℃培养，5－6h后换液以倾去死亡细胞, 37℃培养。
待长成单层后，进行传代培养。
（b）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即投入37－38℃水浴中，待融化后（约1min），室温下在5min内用25℃左右的血清营养液稀释至原体积的4倍，500r/min离心10min，弃上清，加新鲜营养液悬浮细胞，并将细胞转入25mL的克氏瓶中补足营养液，37℃培养。
1.1.2传代取长满单层后的细胞（约72h），倾去原来的营养液，用Hank’s液冲洗一次，加入0.25%的胰酶(或是0.5%的胰酶和0.04%EDTA的等量混合液)，其加入量以能在细胞上形成1mm 厚的液层为宜。
置室温或37℃温度中消化，当细胞层开始由瓶壁脱离时（眼观可见细胞面呈毛玻璃样，镜下观察可见细胞圆缩，间隙增大，即将脱落），将消化液倾出，加入少量营养液，轻晃冲洗细胞层后倾弃，再加入相同于原营养液量的新营养液，以大口径吸管充分吹打，直到细胞完全分散，再加同量营养液，吹打数次后即可分瓶。
（为便于吹打和分散细胞，开始时可以少加一些营养液，吹打分散后再逐步追加营养液至需量。
）其分种率为1：2或1：3，37℃培养。
1.2 病毒培养种毒（PRRSV[欧美株]、PRV、PPV）复壮、病毒增殖1.2.1种毒复壮（PRRSV[欧美株]、PRV）(1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液[1％Gln，2％NaHCO3(7.5%),1%双抗的MEM]，洗2－3遍，倾弃清洗营养液；(2) 接毒冻干毒种（原装量为2mL，湿毒1mL，保护剂1mL），以无血清MEM恢复为原装量，每瓶（100mL瓶）接毒1mL；(3) 吸附37℃吸附1h，其中每20min轻轻晃一次，以使接种毒液能与细胞层更好地接触以利病毒吸附。
猪繁殖与呼吸综合症的诊断方法及防治措施
猪繁殖与呼吸综合症的诊断方法及防治措施作者：李晓辉来源：《现代畜牧科技》2017年第05期摘要：猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）是一种危害严重的传染性疾病。
由于该病传播途径广泛，所以构建快速有的效诊断方法，在生产实践中也有着重要意义。
此外，该病目前尚无特效的治疗药物，主要以预防为主。
因此，文章对PRRS诊断的几种方法以及防治措施进行阐述。
关键词：猪；繁殖与呼吸综合症；诊断方法；防治措施中图分类号：S858.28 文献标识码：A文章编号：2095-9737（2017）05-0008-02Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome of Siagnostic Methods and Control Measures Li Xiaohui（Animal Husbandry Technology Popularization Station of Dashiqiao， Dashiqiao，Liaoning 115100，China）Abstract：Porcine reproductive and respiratory syndrome （PRRS） is a serious infectious disease. Building a rapid and efficient diagnostic method in the production practice is significance for the disease spreading widely. In addition， the PRRS is mainly to prevent as there is no effective treatment and drug at present. Therefore， this thesis gives some overviews about several diagnosis and control measures of the PRRS.Key words：PRRS； diagnostic methods； control measures猪繁殖与呼吸综合症又称“猪蓝耳病”是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）所引起的猪繁殖障碍和呼吸疾病为主要特征的一种传染性疾病。
不同细胞工厂培养Vero细胞增殖效果
不同细胞工厂培养Vero细胞增殖效果马芳芳;康碧静;马春英;刘振斌;王明明;乔自林;张家友;乔永平;王家敏【期刊名称】《西北民族大学学报:自然科学版》【年(卷),期】2022(43)4【摘要】为建立细胞工厂筛选方法,比较市售三个厂家(Corning、Thermo、兰州百灵)细胞工厂培养Vero细胞的生长增殖情况.通过Vero细胞光学显微镜观察、生长曲线、贴壁率、流感病毒增殖对比指标,比较三个厂家细胞工厂培养Vero细胞增殖效果.结果显示,光学显微镜观察三个不同来源的细胞工厂培养的Vero细胞形态变化无明显生长差别,连续传代培养Vero细胞,细胞生长良好.三种不同细胞工厂均能较好促进细胞的生长增殖且细胞生长曲线均呈“S”型;贴壁率分别为(86.20±0.62)%、(94.50±0.70)%、(89.53±0.60)%.甲型H5N1流感病毒感染细胞48 h后,出现明显细胞病变,且血凝效价HA为1∶16,感染性滴度为2.5.三个不同来源的细胞工厂均能支持Vero细胞培养及甲型H5N1流感病毒的增殖,可为细胞工厂筛选提供参考.【总页数】7页(P70-76)【作者】马芳芳;康碧静;马春英;刘振斌;王明明;乔自林;张家友;乔永平;王家敏【作者单位】西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心;西北民族大学生命科学与工程学院;西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室;武汉生物制品研究所有限责任公司国家联合疫苗工程技术研究中心;兰州民海生物工程有限公司甘肃省生物工程材料工程研究中心;兰州百灵塑料制品有限公司【正文语种】中文【中图分类】Q28【相关文献】1.无血清微载体培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒2.不同培养基及不同的葡萄糖浓度对VERO细胞生长状况的影响3.犬瘟热病毒在MA-104、Marc-145、Vero3种细胞内增殖效果的比较4.鸡新城疫Ⅰ系统苗株Vero细胞培养物的免疫试验及Vero细胞…5.不同培养条件对vero细胞的增殖及其检测病毒含量的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PRRSV强弱毒感染PAM和Marc-145细胞入胞途径差异的研究
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）引起的猪场最重要传染病之一，给全世界养猪业造成了持续的经济损害。
减毒活疫苗免疫接种作为防控PRRS 的有效手段在全世界范围内得到广泛应用。
减毒活疫苗毒株是在猴源细胞系上连续传代获得的，导致其与亲本毒株在生物学特性上存在巨大差异，同时本实验室前期结果也提示HP-PRRSV 野毒株和疫苗毒株在入胞途径上可能存在差异。
Na +/H +交换的依赖是巨胞饮的标志性特征，阿米洛利（EIPA ）是Na +/H +交换的特异性抑制剂，细胞骨架重排在病毒的入胞过程中发挥重要作用，细胞松弛素D （Cyt D ）是肌动蛋白聚合的特异性抑制剂。
分别利用EIPA 和Cyt D 预处理PAM 和Marc-145细胞后接毒，对比强弱毒在两种细胞内病毒拷贝数、蛋白表达水平及子代病毒的释放上与空白对照组的差异。
结果表明，PRRSV 强弱毒均不利用巨胞饮途径感染Marc-145或者PAM 细胞，但强弱毒在感染不同细胞时对肌动蛋白的依赖性存在明显的区别。
本研究结果初步揭示了PRRSV 野毒株和疫苗毒株入胞过程的差异，为进一步揭示PRRSV 疫苗毒株致弱机制提供了前期基础。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；入胞途径；巨胞饮；肌动蛋白中图分类号：S858.28 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）04-0018-08Analysis of the Differences of the Entry Pathway of PAM and Marc-145 Infectedwith Highly Pathogenic and Attenuated PRRSVsZHU Haojie 1, GAO Fei 1, XU Jingjing 1, LIU Yuting 1, TONG Guangzhi 1, JIANG Yifeng 1, LI Guoxin 1,2(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for the Prevention andControl of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)收稿日期：2021-01-02基金项目：国家生猪现代产业技术体系（CARS-35）；国家自然科学基金（31670158）作者简介：朱豪杰，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：李国新，E-mail：*****************.cn；姜一峰，E-mail：********************.cnPRRSV 强弱毒感染P AM 和Marc-145细胞入胞途径差异的研究朱豪杰1，高 飞1，徐晶晶1，刘宇婷1，童光志1，姜一峰1，李国新1,2（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）2023,31(4):18-25Abstract: Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), which caused by Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is considered as the most important infectious disease to the pig industry. Immunization is considered as an effective way to control PRRS all over the world. Live attenuated vaccine which obtained by continuous generation on Marc-145 cells was considered as the most effective vaccine, the generation on allogenic cell line resulting huge biological difference compaired with their parents strains including growth characteristic. Our previous results also showed that PRRSV fi eld strain and vaccine strain might have differences in the pathway of entry the cell. Na +/H + exchange is the key characteristic of macropinocytosis, Amiloride (EIPA) is the specific inhibitors of Na +/H +exchange, Cytochalasin D (Cyt D) was widely used to inhibited actin polymerzation. The PAM and Marc-145 cells were pretreated· 19 ·朱豪杰等：PRRSV 强弱毒感染PAM 和Marc-145细胞入胞途径差异的研究第31卷第4期猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种急性且高度传染的病毒性疾病。
4种病毒在细胞上达最大吸附量所需时间测定
4种病毒在细胞上达最大吸附量所需时间测定张晋强;牛丽;宋美琴;白喜云【摘要】The time of the Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) , Marek virus(MDV), Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(PRRSV), Porcine Pseudorabies Virus (PRV) reaching the biggest adsorption quantity on cell was determined. The time was decided through the cytopathic effect induction by virus adsorption at different times. Results showed that after some time of the IBDV, MDV, PRRSV, PRV adsorption, the cytopathic effect became more heavier with the increase of adsorption time, they reached the peak at 60,120,60, and 60 min, respectively. The time of IBDV on CEF reached the biggest adsorption quantity was 60 min,and MDV on CEF 120 min. The time for PRRSV on Marc-145 reached the biggest adsorption quantity was 135min,and for PRV on PK-15 60min.%为确定鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒、鸡马立克氏病毒(MDV)弱毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪伪狂犬病毒( PRV)在细胞上达到最大吸附量所用时间,通过观察病毒在细胞上吸附不同时间后的细胞病变情况来测定病毒在该细胞上达到最大吸附量所用时间.结果表明:IBDV、MDV、PRRSV以及PRV 4种病毒在细胞上吸附一定时间后,细胞病变随着吸附时间的延长而加重,分别在60、120、60、60 min时达到峰值.37℃孵育条件下,IB-DV在CEF上的吸附量在60 min时达到最大值；MDV在CEF上的吸附量在120 min时达到最大值;PRRSV在Marc-145上的吸附量在60 min时达到最大值；PRV在PK-15上的吸附量在60 min时达到最大值.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(031)004【总页数】4页(P373-376)【关键词】IBDV;MDV;PRRSV;PRV;病毒吸附【作者】张晋强;牛丽;宋美琴;白喜云【作者单位】山西农业大学信息学院,山西太谷030801;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】S855.3近年来，人们对病毒的研究越来越深入，包括在细胞模型上高通量筛选抗病毒药物并且进一步在细胞水平以及分子水平上研究病毒致病机制、药物抗病毒机制等方面进行大量研究［1］。
传代培养注意事项
传代培养注意事项传代培养是在细胞或微生物培养物中进行连续传递的过程，其目的是保持细胞或微生物的生存和维持其特性。
在进行传代培养时，需要注意以下几个方面。
1. 无菌操作：传代培养需要在无菌条件下进行，以防止外界的污染物进入培养物中，影响细胞或微生物的正常生长和特性稳定性。
因此，在实验操作中，应采取严格的无菌操作措施，包括洗手消毒、实验台面消毒、使用无菌工具和试剂等。
2. 优选培养基：选择适宜的培养基是传代培养的关键。
不同的细胞或微生物对培养基的需求不同，包括营养物质、pH值、温度等。
因此，在传代培养过程中，需要根据具体细胞或微生物的要求选择合适的培养基，以维持其正常生长和特性。
3. 传代时机：传代培养的时机需要充分考虑细胞或微生物的生长状态和代谢活性。
通常，传代培养应在细胞或微生物处于对数生长期时进行，以保持其生长活力和特性的稳定性。
同时，也需要避免细胞或微生物的过度生长，否则可能导致细胞凋亡或微生物变异。
4. 传代比例：传代时需要根据细胞或微生物的生长速度和传代需求来确定传代比例。
一般情况下，如果细胞或微生物生长迅速且培养物中细胞或微生物数量较多，则传代比例可适当增加。
相反，如果生长较慢或数量较少，则传代比例可适度减少。
传代比例的控制可以有效地维持细胞或微生物的生长和特性稳定。
5. 传代条件：在进行传代培养时，还需要考虑传代条件的合理性。
传代条件包括培养温度、培养周期、培养液的处理等。
一般情况下，细胞或微生物的传代温度要与其适宜生长温度相符合；传代周期应根据细胞或微生物的生长速度来确定，以避免过度或不足的传代；培养液的处理应根据具体情况来确定，如对培养液进行滤过、离心等操作，以消除其中可能存在的细胞或微生物残留物。
6. 传代记录：在进行传代培养时，要对每次传代进行详细的记录，包括传代时间、传代比例、培养基配方等信息。
这样可以方便后续的实验操作和数据分析，同时也能追踪细胞或微生物的传代历史，以判断其特性的稳定性和变异情况。
细胞培养与病毒培养实验步骤
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
mark--145细胞培养 的相关知识
一．Marc-145细胞培养1.细胞消化传代Marc-145细胞培养48-72小时后，将细胞用0.2%的胰酶消化后以1：3的比例传代。
细胞培养液（6%小牛血清、1%双抗、93%DMEM培养液），细胞维持液（3%小牛血清、1%双抗、96%DMEM培养液）。
2.细胞冻存（15ml中号培养瓶）将细胞形态较好，细胞活力旺盛（即传代后36-48小时细胞长成单层面）用0.2%的胰酶消化后加入细胞冻存液20ml（30%小牛血清、10%二甲基亚砜DMSO、60%DMEM 培养液），混匀后2ml/管分装，放入细胞冻存盒置-70℃冰箱72小时后放入液氮罐保存。
3.细胞复苏将液氮罐中的细胞快速取出，置37℃温水中解冻，再将解冻后的细胞1000转离心5分钟，在无菌操作台内小心倒掉上清，加入1ml细胞培养液后吹打混匀，吸入到5ml细胞培养瓶内，在加入5ml细胞培养液。
marc 145细胞培养的简单综述2008-07-25 00:00 来源：丁香园点击次数：1930 关键词：marc 145细胞细胞培养综述分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网Marc 145细胞培养和维持有关资料综述一、细胞及培养1、Marc145细胞上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。
2、生长培养基DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋5－10％新生牛血清+ 1%双抗（青霉素和链霉素）的培养液。
3、冻存液生长培养基＋10% DMSO4、细胞健康生长的几项注意事项（1）细胞没有支原体等外源因子的感染。
（2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。
（3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。
（4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。
（5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。
Marc 145细胞培养和维持有关资料综述
Marc 145细胞培养和维持有关资料综述北京清大天一生物技术有限公司一、细胞及培养1．Marc145细胞上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。
2．生长培养基DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋５％～10％新生牛血清+ 1％双抗（青霉素和链霉素）的培养液。
3．冻存液生长培养基＋10％DMSO4．细胞健康生长的几项注意事项1）细胞没有支原体等外源因子的感染。
2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。
3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。
4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。
5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。
6）细胞传代时消化液用0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。
二、病毒感染、维持和收获转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。
37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3－5天。
维持液：DMEM+4～5％新生牛血清。
pH应为7.4～7.8；后期维持pH会慢慢降下来。
细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。
第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80％时收获病毒，－20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。
收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。
三、细胞病变（CPE）细胞在接种病毒后，24－48hr开始出现病变，72－96hr约达到80％病变。
病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。
图1是长成单层的marc 145细胞，图2、图3和图4均是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。
Marc-145细胞传代培养条件优化
（ １ ） 复苏温 度对 Ｍａ ｒ ｃ 一 １ ４ ５细胞传 代 培养 的影 响 。 取 ５支 冻存 种 细胞 的 冻存 管 ， 立即 放入 ２ ５ 、 ３ ０ 、 ３ ５ 、 ３ ７、 ４ ０℃的水 浴
中 至 彻 底 融 化 后 接 入 ５个 小 方 瓶 中 ， 编号为 １ ～ ５ ， 分 别加 入
ｐ Ｈ值 为 ７ ． ２、 血 清含 量 为 １ ０ ％的 Ｄ ＭＥ Ｍ 生长 液 ２ ０ ｍＬ． 置于 ３ ７ ｃ Ｃ 的 Ｃ Ｏ ： 培 养 箱 中培 养 ４ － ６ ｈ后换 掉 １ 次 生长 液 ，培 养 ４ ８ ｈ后 取 出放 置倒 置显 微镜 下观 察 。 （ ２ ） 血 清含 量 对 Ｍａ ｒ ｃ 一 １ ４ ５细 胞 传 代培 养 的影 响 。 取 一 细胞 生长 状态 良好 的大方 瓶细 胞 ， 经 消化 ， 加入 ｐ Ｈ 值为 ７ ． ２
Ａｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｕｓ ｉ ｎ ｇ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅｔ ｅ ｓ ｔ ， ｔ ｈ ｅｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｏ ｆ ｒ ｅ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｙｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ， ｇ ｒ ｏ ｗ ｔ ｈ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎｐＨ ｖ ａ ｌ ｕ ｅ ， ｉ ｎ ｃ ｕ ｂ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ， ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌｕ ｆ ｉ ｄ ａ ｎ ｄ ｐａ ｓ ｓ ａ ｇ ｅ ｒ ａ ｔ ｅ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｕｂ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｆ ｏ ｒ Ｍａ ｒ ｃ 一１ ４ ５ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗａ ｓ ｓ ｔ ｕ ｄ ｉ ｅ ｄ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｂ ｅ ｓ ｔ ｓ ｕ ｂ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕｒ ｒｃ 一 １ ４ ５ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗａ ｓｗｈ ｅ ｎｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｙｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅｗａ ｓ ３ ７℃ ， ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｗａ ｓ １ ｏ％ ， ｇ ｒ ｏ ｗｔ ｈ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎｐＨ ｖ ａ ｌ ｕｅｗａ ｓ ７ ． ２， ｉ ｎ ｃ ｕ ｂ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅｗａ ｓ ３ ７ ｏ Ｃ． ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌｕ ｆ ｉ ｄ ｗａ ｓ ０． ２ ５ ％． ａ ｎ ｄ ｐ ａ ｓ ｓ ａ ｇ ｅ ｒ ａ ｔ ｅ ｗａ ｓ １ ： ３ ．
细胞传代
细胞传代1. 仪器：生物安全柜、CO2细胞培养箱、倒置显微镜、体视显微镜（细胞计数用）、水浴锅、计时器、离心机、托盘天平（配平用）。
2. 耗材：移液枪、电动移液器、血细胞计数板；5ml无菌吸管、10ml无菌吸管、无菌枪头、无菌细胞瓶、废液缸。
3. 试剂及配置：PBS：用800ml超纯水溶解8g NaCl，0.2g KCl，3.628g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4。
用1mol/L HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。
分装后在121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
胰酶消化液：称取胰酶（1：250）2.5g，EDTA-Na 0.3g，NaCl 8.0g,KCl 0.4g,葡萄糖（Glucose）1.0g,苯酚红（Phenol Red）0.005g,用1L超纯水溶解，磁力搅拌2-3h，调pH至7.8-8.0，经0.22μm过滤后，4℃（短期贮存）或-20℃（长期贮存）保存。
台盼蓝：先制备出4%台盼蓝母液，称取4g台盼蓝加少量超纯水研磨，加水至100ml，滤纸过滤，4℃保存。
临用时，用PBS（pH 7.4）稀释母液至0.4%即可。
含10%NCS（Newborn Calf Serum，新生牛血清，GIBCO）的DMEM培养基：取DMEM 粉1袋，加入990ml超纯水溶解，加入3.7g NaHCO3，搅拌2h，加入三抗10ml，经0.22μm 过滤后，即配成1L无血清DMEM。
用900ml无血清DMEM与100ml NCS混匀后经0.22μm 过滤后，即配成含10%NCS的DMEM培养基。
4℃贮存。
4. 实验步骤：4.1 贴壁性不强的细胞（如sp2/0细胞）的传代：1）将含10%NCS的DMEM培养基置于37℃水浴锅中预热。
2）观察细胞，选取健康、长成单层的细胞进行细胞传代。
3）在生物安全柜中，用吸管吸出瓶中的旧上清液，转移到废液缸中。
4）加入等体积新的培养基。
犬瘟热病毒在MA-104Marc-145Vero三种细胞内
王朝蕾1崔卓宇吕永钢胡江锋焦铁军樊军喜王根红崔瑞宁（杨凌绿方生物工程有限公司，陕西杨凌712100）摘要：本试验比较了MA-104、Marc-145、Vero三种猴肾细胞增殖犬瘟热病毒的敏感性，按常规方法将犬瘟热病毒（CDV-XN112株）分别接种于MA-104、Marc-145、Vero三种细胞，通过观察细胞病变，确定收毒时间，比较病毒滴度。
结果表明犬瘟热病毒可在MA-104、Marc-145、Vero三种细胞内增殖，出现典型细胞病变，效价均达到105.5TCID50/mL以上，而Vero细胞增殖犬瘟热病毒更为经济高效，是增殖该病毒的理想细胞。
关键词：犬瘟热病毒细胞培养病毒含量Multiplication Effect Comparison of Canine Distemper Virus in MA-104, Marc-145, and Vero cellsWANG Zhao-lei, CUI Zhuo-yu, LV Yong-gang, HU Jiang-feng, JIAO Tie-jun, FAN Jun-xi,WANG Gen-hong, CUI Rui-ning（YanglingLvfang Bio-engineering Co. LTD, yangling, Shaanxi 712100, China）Abstract: Canine distemper virus (CDV-XN112 strain) was Inoculated into MA-104, Marc-145 and Vero cells, the sensitivity of three types of monkey kidney to CDV were compared by observation cell pathological effect after cultivation, determination time for harvesting virus, comparison of virus titers. The results showed that three cells be suitable for CDV, th titers of virus harvest fluids more than 105.5TCID50/mL, but Vero cell is amore cost-effective and ideal cell of proliferation CDV.Keywords: Canine distemper virus; cell culture; virus titer犬瘟热是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的犬和肉食目中许多动物的一种高度接触性传染病。
猪繁殖呼吸综合征的实验室诊断及防控措施
收稿日期：２０２４ ０１ ２９基金项目：杭州市桐庐县５１１中青年人才培养工程第一作者：袁伟琴（１９８８－），女，汉，浙江桐庐，本科，主要从事动物检疫工作通讯作者：陈云蕾（１９９１－），男，汉，河南鄢陵，硕士，兽医师，主要从事兽医技术服务和兽医实验室检测技术工作猪繁殖呼吸综合征的实验室诊断及防控措施袁伟琴１，张泽林１，彭长凌２，陈云蕾１，张 鲲１，丁林玲１，刘 璐１（１．杭州市桐庐县无规定马属动物疫病区管理中心，浙江桐庐３１１５００；２．杭州市桐庐县农业产业化发展服务中心）中图分类号：Ｓ８５２．６５ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００５－７３０７（２０２４）０２－００３３－００３ 猪繁殖呼吸综合征（ＰＲＲＳ）是由猪繁殖呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）感染导致以母猪繁殖障碍及仔猪和育肥猪呼吸道症状为主的一种高度接触性传染病。
因出现耳部发绀特征症状，又得名“猪蓝耳病”。
按照最新分类可分为ＰＲＲＳＶ １型和ＰＲＲＳＶ ２型两种，ＰＲＲＳＶ １型（欧美型）仅限于欧美传播，ＰＲＲＳＶ ２型（北美型）仅限于北美传播，目前在全球广泛流行。
无论各种日龄、品种的生猪均受到ＰＲＲＳＶ的威胁，其中仔猪和妊娠母猪最易感。
临床特征为母猪不孕、晚期胎儿木乃伊、流产、死胎和弱胎，仔猪产出后常因呼吸道疾病和继发感染而很快死亡。
年龄较大的猪可能出现轻度呼吸道症状，有时因继发感染而使病情复杂，严重影响我国养猪业的健康发展。
本文总结了其病原学特征、流行病学及临床症状、近年来ＰＲＲＳ的实验室诊断方法，提出了相关的防控措施，以期为ＰＲＲＳ的防控提供参考。
１ ＰＲＲＳＶ的病原学特征ＰＲＲＳＶ是一种单链正向ＲＮＡ病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，全长约１５ｋｂ。
通常分为ＰＲＲＳＶ １型和ＰＲＲＳＶ ２型两种类型。
ＰＲＲＳＶ １型仅限于欧美传播，ＰＲＲＳＶ ２型仅限于北美传播，现已在全球范围内广泛传播。
其基因组与冠状病毒在基因组结构和表达上极为相似。
猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗
猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗（CH-1R株）1、高度安全性疫苗弱毒株，毒力不返强，安全，稳定可用于普免安全性试验：从2个方面检测该疫苗所用的PRRSCH-1R毒株的安全性：第一：毒力返强试验：选择对兰耳病毒最敏感的85-93胎龄的重胎母猪做试验，经猪继代3~4次后就很难在血清、鼻拭子检测到病毒核酸，试验母猪没有发生繁殖障碍等临床表现，说明PRRSCH-1R毒株的遗传性状是稳定的。
第二：对疫苗不同免疫剂量的安全性进行了检测，分别以单剂量重复免疫、10倍量大剂量免疫，对怀孕母猪和断奶仔猪的免疫结果观察，各批次疫苗免疫仔猪的临床症状和母猪的产仔情况均正常。
证明该疫苗对猪是安全。
2、超强免疫效力疫苗毒株为国内分离的美洲株。
与2006年“无名高热综合征”中兰耳病分离株同源性达98%以上。
更快启动保护，产生有效保护力。
免疫1周产生抗体，2周产生保护力，可用于紧急免疫。
疫苗效价高于105.0TCID50/头份。
免疫期可达4个月。
免疫保护试验：免疫后血清抗体的检测：免疫28~35日龄仔猪，免疫后7天将能检测到PRRSV 的IFA抗体，免疫后2周，80%以上的猪就可以获得保护。
最小免疫剂量和使用剂量：疫苗滴度达到104.0TCID50/头份的免疫剂量，即可完全保护仔猪和母猪抵抗强毒的攻击，为了确保疫苗的使用效果，我们将疫苗的使用剂量定为105.0TCID50/头份，而实际上我们的出厂标准定为106.0TCID50/头份，相当于100倍的最小免疫剂量。
免疫持续期：通过分别用3个以上批次的疫苗，分别免疫28~35日龄的仔猪和怀孕母猪1次，免疫后5个月，强毒攻毒，保护率为100%。
出于安全的考虑，我们将免疫保护期定为4个月。
3、低免疫应激性免疫健康猪群无体温升高、采食下降和影响增重现象。
猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(Ch-1a株)安全性好由于繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的本身性质决定了该苗具有良好的安全性，该苗选用国内分离毒株（CH-1a株）,该毒株是经Marc-145细胞系传代、多次克隆纯化，筛选出嗜Marc-145细胞生长的PRRSV毒株，该毒株的细胞培养液经化学试剂灭活后，配以医用油佐剂，制成了繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。
犬瘟热病毒在MA-104Marc-145Vero三种细胞内
《畜牧与饲料科学》2012年第10期王朝蕾1崔卓宇吕永钢胡江锋焦铁军樊军喜王根红崔瑞宁（杨凌绿方生物工程有限公司，陕西杨凌712100）摘要：本试验比较了MA-104、Marc-145、Vero三种猴肾细胞增殖犬瘟热病毒的敏感性，按常规方法将犬瘟热病毒（CDV-XN112株）分别接种于MA-104、Marc-145、Vero三种细胞，通过观察细胞病变，确定收毒时间，比较病毒滴度。
结果表明犬瘟热病毒可在MA-104、Marc-145、Vero三种细胞内增殖，出现典型细胞病变，效价均达到105.5TCID50/mL以上，而Vero细胞增殖犬瘟热病毒更为经济高效，是增殖该病毒的理想细胞。
关键词：犬瘟热病毒细胞培养病毒含量Multiplication Effect Comparison of Canine Distemper Virus in MA-104, Marc-145, and Vero cellsWANG Zhao-lei, CUI Zhuo-yu, LV Yong-gang, HU Jiang-feng, JIAO Tie-jun, FAN Jun-xi,WANG Gen-hong, CUI Rui-ning（YanglingLvfang Bio-engineering Co. LTD, yangling, Shaanxi 712100, China）Abstract: Canine distemper virus (CDV-XN112 strain) was Inoculated into MA-104, Marc-145 and Vero cells, the sensitivity of three types of monkey kidney to CDV were compared by observation cell pathological effect after cultivation, determination time for harvesting virus, comparison of virus titers. The results showed that three cells be suitable for CDV, th titers of virus harvest fluids more than 105.5TCID50/mL, but Vero cell is amore cost-effective and ideal cell of proliferation CDV.Keywords: Canine distemper virus; cell culture; virus titer犬瘟热是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的犬和肉食目中许多动物的一种高度接触性传染病。
(整理)传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养.
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清1）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。
用前56℃灭活30min。
3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
猪蓝耳病活疫苗生产工艺探索
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称“蓝耳病”，自2006年的夏秋季节，我国陆续暴发一种以高热为典型症状的综合症，给全国养猪业带来巨大浩劫。
2007年1月，确定变异猪蓝耳病病毒是猪“高热病”主要病原，并定名为高致病性猪蓝耳病 (Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)。
该病是由 HP-PRRS 病毒(HP-PRRSV)引起的一种急性高致病性疫病。
该病仔猪发病率可达 100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡是其特征。
HP-PRRS同其他病毒性疾病一样，目前尚没有较为有效的治疗药物，除按传统的隔离、消毒、控制人员活动对该病进行控制外，重中之重就是要有安全、稳定、高效的疫苗进行正确的免疫接种。
因此, 研制出安全、高效、生产工艺简单、成本较低而又适应市场需求的高致病性猪蓝耳病疫苗成为生产企业努力的方向。
本研究对高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HuN4-F112株）的生产工艺关键环节进行探索。
从细。
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Marc—145细胞传代培养条件优化
摘要采用单因素法研究在细胞传代培养过程中复苏温度、血清浓度、生长液pH值、培养温度、消化液浓度、传代比例等因素对Marc-145细胞传代培养的影响。
结果表明：复苏温度37 ℃、血清浓度10%、生长液pH值7.2、培养温度37 ℃、消化液浓度0.25%、传代比例1∶3时Marc-145细胞传代培养效果最佳。
Abstract Using single test，the effect of recovery temperature serum concentration，growth solution pH value，incubation temperature，concentration of digestive fluid and passage rate on the subculture for Marc-145 cells was studied.The results showed that the best subculture conditions for Marc-145 cells was when the recovery temperature was 37 ℃，the serum concentration was 10%，growth solution pH value was 7.2，incubation temperature was 37 ℃，concentration of digestive fluid was 0.25%，and passage rate was 1∶3.
Key words Marc-145 cells；subculture；single test；condition optimization
Marc-145细胞为上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续传代培养[1]。
Marc-145细胞作为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的受体细胞，近年来已被得到广泛应用。
当前，为了获得生长良好的Marc-145细胞，以便在细胞上获得更高滴度的PRRSV，则必须优化细胞传代培养条件[2]。
细胞传代培养条件包括细胞的复苏条件、传代培养中细胞培养温度、血清浓度、细胞消化时间、消化液浓度、细胞传代比例等。
本文就关于Marc-145细胞传代培养的几个影响因素进行了探讨，为优化Marc-145细胞传代培养提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试细胞为Marc-145细胞（来自中国动物疫病预防控制中心）。
供试培养基为DMEM培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 Marc-145细胞传代培养。
取生长良好的转瓶或方瓶细胞，倒掉培养液，加入少量PBS洗液，沿瓶壁转动，清洗带出细胞代谢废物[3]，倒掉PBS洗液，倒入适量预热好的消化液，沿瓶壁转动，使其充分接触长有细胞的瓶壁，静置，待瓶壁变的模糊，像起雾状即可（若是转瓶细胞需待瓶壁上出现透亮细线状方可）。
加入事先准备好的已经加好血清、双抗、泰勒、调好pH值的DMEM适量，摇瓶，然后将瓶内的液体分装到各子瓶中，上架，培养48 h后挑选生长状态良好的细胞继续传代[4]。
1.2.2 影响Marc-145细胞传代培养的各单因素试验。
影响细胞传代培养的因素主要包括复苏温度、血清浓度、生长液pH值、培养温度、消化液浓度、传代比例等。
针对这几个因素，分别在保持其他因素相同的条件下进行单因素试验，考察各因素对Marc-145细胞的生长状态的影响，选择最佳的细胞传代条件。
（1）复苏温度对Marc-145细胞传代培养的影响。
取5支冻存种细胞的冻存管，立即放入25、30、35、37、40 ℃的水浴中至彻底融化后接入5个小方瓶中，编号为1～5，分别加入pH值为7.2、血清含量为10%的DMEM生长液20 mL，置于37 ℃的CO2培养箱中培养4～6 h后换掉1次生长液，培养48 h后取出放置倒置显微镜下观察。
（2）血清含量对Marc-145细胞传代培养的影响。
取一细胞生长状态良好的大方瓶细胞，经消化，加入pH值为7.2的DMEM液100 mL，摇匀，平均分装到5个小方瓶里，编号1～5，向其中各加入2%～10%的新生牛血清后，置于37 ℃的CO2培养箱中，培养48 h后观察细胞生长情况。
（3）生长液pH值对Marc-145细胞传代培养的影响。
取1个细胞生长状态良好的大方瓶，经消化，加入血清含量为10%的DMEM生长液50 mL摇匀，分装到5个小方瓶中，调节pH值分别为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6，置于37 ℃的CO2培养箱中培养48 h后观察，。
（4）培养温度对Marc-145细胞传代培养的影响。
选取培养48 h，细胞生长状态良好的母瓶细胞，经消化，加入pH值为7.2、血清含量为10%的DMEM生长液20 mL摇匀，分装到5个小方瓶中，放置温度分别为25、30、35、37、40 ℃的CO2培养箱中，培养48 h后观察。
（5）消化液浓度对Marc-145细胞传代培养的影响。
选取培养48 h，细胞生长状态良好的中瓶细胞5瓶，经37 ℃预热浓度分别为0.10%、0.20%、0.25%、0.40%、0.50%的消化液消化时间2 min后，加入pH值为7.2、血清含量为10%的DMEM生长液20 mL，摇匀，分别倒入10 mL至5个小方瓶，放入37 ℃的CO2培养箱中，培养48 h后观察。