冷冻电镜技术
冷冻电镜观察蛋白颗粒
冷冻电镜，也称为冷冻电子显微镜或冷冻EM，是一种在低温下观察生物样品的技术。
它可以观察蛋白质颗粒和其他生物大分子，并提供了高分辨率的结构信息。
在冷冻电镜中，样品被迅速冷冻在低温下，以保持其自然状态。
然后，电子束被用来扫描样品，并收集散射的电子来生成图像。
由于电子束的波长比光波短得多，因此冷冻电镜可以提供更高的分辨率图像。
冷冻电镜在生物学研究中非常有用，因为它可以观察不稳定的、易变的或非常小的蛋白质颗粒。
这使得科学家能够更深入地了解蛋白质的结构和功能，进而了解生命的基本过程。
此外，冷冻电镜还可以与其他技术结合使用，例如单颗粒分析、冷冻电子断层扫描和微电子衍射等技术。
这些技术可以提供更多关于蛋白质结构和动力学的信息，有助于科学家更好地理解蛋白质的功能和作用机制。
总之，冷冻电镜是一种强大的技术，可以提供高分辨率的蛋白质结构和动力学信息，为生物学研究和药物设计提供了重要的工具。
冷冻电镜安装要求标准
冷冻电镜，全称冷冻电子显微镜，是一种在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术。
以下是冷冻电镜的安装要求标准：
低温环境：冷冻电镜需要在低温环境下工作，因此需要配备低温系统，包括低温制冷机和低温冷台等设备，以确保样品在低温下保持稳定。
防震设施：冷冻电镜对震动非常敏感，因此需要采取有效的防震措施，如安装防震脚垫等，以减少外部震动对显微镜的影响。
洁净环境：冷冻电镜需要在洁净的环境下工作，以减少尘埃对显微镜的影响。
因此需要安装空气过滤器等设备，并定期进行环境清洁。
电源和接地：冷冻电镜需要稳定的电源和良好的接地，以确保显微镜的正常运行。
其他要求：根据具体的显微镜型号和规格，可能还有其他特定的安装要求，如光学系统、真空系统等。
总之，冷冻电镜的安装要求标准需要考虑到多个方面，包括低温系统、防震设施、洁净环境、电源和接地以及其他特定的安装要求。
只有满足这些要求，才能保证冷冻电镜的正常运行和使用效果。
冷冻电镜的原理及应用
冷冻电镜的原理及应用冷冻电镜（cryo-electron microscopy，简称cryo-EM）是一种利用冷冻技术对生物样品进行成像的高分辨率电镜技术。
它的原理是将生物样品在极低温下快速冷冻，形成冰冻膜，然后在真空环境下进行成像。
冷冻电镜具有成像分辨率高、样品无需染色等优点，因此在生物医学研究领域有着广泛的应用。
首先，冷冻电镜的原理是利用样品在极低温下形成冰冻膜后，通过电子束对样品进行成像。
冷冻膜的形成可以保持生物样品的天然结构，避免了传统电镜中样品染色和固化过程可能导致的伪装效应。
同时，冷冻电镜可以获得纳米级甚至次纳米级的成像分辨率，能够观察到生物样品的细微结构和分子间相互作用，为生物学研究提供了重要的信息。
其次，冷冻电镜在生物医学领域有着广泛的应用。
在细胞生物学研究中，冷冻电镜可以用于观察细胞器的结构和功能，揭示细胞内部的生物过程。
在生物医药研发中，冷冻电镜可以用于药物与蛋白质相互作用的研究，为新药研发提供重要依据。
在病毒学领域，冷冻电镜可以用于观察病毒颗粒的结构，为病毒防治提供重要信息。
此外，冷冻电镜的发展也为生物学研究提供了新的技术手段。
随着成像分辨率的不断提高，冷冻电镜已经成为研究生物分子结构的重要工具，为科学家们解开生命奥秘提供了强有力的支持。
同时，冷冻电镜的技术进步也为药物设计和疾病治疗提供了新的思路和方法。
综上所述，冷冻电镜作为一种高分辨率电镜技术，具有成像分辨率高、样品无需染色等优点，在生物医学研究领域有着广泛的应用。
其原理是利用样品在极低温下形成冰冻膜后，通过电子束对样品进行成像。
冷冻电镜的发展为生物学研究提供了新的技术手段，为科学家们解开生命奥秘提供了强有力的支持。
相信随着技术的不断进步，冷冻电镜在生物医学领域的应用将会更加广泛，为人类健康事业做出更大的贡献。
冷冻电镜表征
冷冻电镜表征
冷冻电镜（Cryo-Electron（Microscopy）是一种生物学中常用的高分辨率电子显微镜技术，它能够以冷冻的方式观察生物样品的高分辨率结构，特别是蛋白质和生物大分子的结构。
冷冻电镜表征通常包括以下步骤：
1.（样品制备：（样品制备是冷冻电镜表征的关键步骤。
生物样品需要以特殊的方式制备，以确保在电镜中保持其原始结构。
通常，样品会在非常低的温度下迅速冷冻，以保持生物分子在其自然状态下的结构。
2.（数据采集：（冷冻电镜利用电子束来照射样品，并记录样品散射电子的图像。
这些图像被捕获并记录下来，形成一系列2D图像。
这些图像需要在不同角度和方向上采集，以获取关于生物样品三维结构的信息。
3.（三维重建：（通过收集的2D图像，使用特定的计算机程序进行图像处理和三维重建。
这些程序能够处理大量的2D图像数据，并将其转换成高分辨率的三维结构模型。
4.（结构解析与分析：（得到的三维结构模型可以进一步用于分析生物样品的结构。
这包括分析蛋白质、细胞器或其他生物分子的形状、大小、构象等信息。
冷冻电镜表征因其能够在生物样品的原始状态下观察高分辨率结构而备受青睐。
它在生物医学研究、生物化学和药物研发等领域中发挥着重要作用，帮助科学家们理解生物分子的结构和功能。
1/ 1。
冷冻电镜技术
冷冻电镜技术或冷冻电子显微学(Cryo-electron microscopy) (Cryo electron microscopy)梁毅(武汉大学生命科学学院)生物分子的结构分析现代生物学仪器分析中的“四大谱”和“三大法”●传统上最有效的方法是“四大谱”：●紫外-可见光谱、红外光谱、核磁共振波谱和质谱生物大分子（蛋白质和核酸等）结构测定●的最重要和应用最广泛的三大方法：●X 射线晶体衍射分析、核磁共振波谱分析和冷冻电镜什么是电镜？电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器●电镜用于生物样品的结构研究是众所周高分辨率的电镜可以达到0.l 知的，目前0l 乃至水平，这是指在特定条件下nm3Å可分辨的两点的距离。
●虽然这已接近原子分辨水平，但由于种种原因要看到构成生物大分子的碳、氢、氧原子的三维排布仍是很困难的。
●首先，构成生物物质的碳、氢、氧、氮等元素对电子的散射能力较弱；●其次高速电子的轰击会对生物样品造成辐射损伤，后者在生物样品的高分辨率结构分析中是最严重的问题。
●损伤机制包括非弹性散射引起的化学键断裂，也包括电子轰击引起离子、自由基和分子碎片扩散，从而造成生物样品的质量损失。
●因此利用电子显微镜对生物大分子进行研究必须首先把观察对象制备成特殊的样品。
●电镜的样品制备方法有许多种，在有关生物大分子结构研究中，负染、葡萄糖包埋以及冰冻含水（正染）等方法是常用的。
电镜载网●电镜观察的样品需要在特制的金属载网上才能送入电镜镜筒中进行观察。
载网的直径通常为4mm，可以用铜、银、铂、镍等金属或铜镍、银镍合金等制成。
最常用的载网为铜制的，所以电镜载网一般又称作电镜铜网。
铜网网孔的形状多样，有圆形的、方形的、单孔形和狭缝形；网●孔的数目有50目、100目、200目、300目和400目等多种规格。
网孔越大，观察的有效面积越大，但同时对样品的支持稳定性也越差。
冷冻电镜技术
冷冻电子显微镜技术冷冻电子显微镜技术在20世纪70年代时提出，经过近10年的努力，在80年代趋于成熟，近年来已经进入了快速发展的时期。
它的研究对象非常广泛，包括病毒、蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等。
一方面，冷冻电微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的；而且对于样品的分子量没有限制。
因此，大大突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小于100KD）样品的限制。
另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克了因化服学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。
冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像,包括样品制备、图像采集、图像处理及三维重构等几个基本步骤。
一、样品制备用于冷冻电镜研究的生物样品必须非常纯净。
生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又能抗脱水、电子辐射。
现在普遍采用的方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。
冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。
若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。
此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同而导致图像产生偏差。
该方法有两个步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。
在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。
其优点在于将样品保持在接近生活状态，不会因脱水而变形，同时可以减少辐射损伤。
二、图像采集冷冻的样品通过专门的设备——冷冻输送器转移到电镜的样品室。
在照相之前，必须观察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。
由于生物样品对高能电子的辐射敏感，照相时必须使用最小曝光技术。
经过透射电子显微镜中一系列复杂的过程，最终在记录介质上会形成样品放大几千倍至几十万倍的图像。
嗯，这是一篇关于冷冻电镜的干货！
嗯，这是⼀篇关于冷冻电镜的⼲货！1、什么是冷冻电镜冷冻电⼦显微镜技术（cryo-electron microscopy）简称冷冻电镜。
冷冻电镜，是⽤于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM)，可实现直接观察液体、半液体及对电⼦束敏感的样品，如⽣物、⾼分⼦材料等。
样品经过超低温冷冻、断裂、镀膜制样（喷⾦/喷碳）等处理后，通过冷冻传输系统放⼊电镜内的冷台（温度可⾄-185℃）即可进⾏观察。
冷冻电镜中的冷冻技术可以瞬间冷冻样品，并在冷冻状态下保持和转移，使样品最⼤限度保持原来性状，得出的数据更准确，实验成功率才更⾼。
2、冷冻电镜的分类⽬前我们讨论的冷冻电镜基本上指的是冷冻透射电⼦显微镜，但是如果我们可以使⽤冷冻技术的⾓度定义冷冻电镜的话，冷冻电镜主要可以分为冷冻透射电⼦显微镜、冷冻扫描电⼦显微镜、冷冻刻蚀电⼦显微镜。
2.1冷冻透射电⼦显微镜冷冻透射电镜（Cryo-TEM）通常在普通透射电镜上加装样品冷冻台，将样品冷却到液氮温度（77K）。
⽤于观测蛋⽩、⽣物切⽚等对温度敏感的样品。
通过对样品的冷冻，可以降低电⼦束对样品的损伤，减⼩样品的形变，从⽽得到真实的样品形貌。
⼀台冷冻透射电镜的价格在600万美元左右，价格及其昂贵，它的优点主要体现在以下⼏个⽅⾯：第⼀是加速电压⾼，电⼦穿透厚样品；第⼆是透镜多，光学性能好；第三是样品台稳定；第四是全⾃动，⾃动换液氮，⾃动换样品，⾃动维持清洁。
2.2冷冻扫描电⼦显微镜扫描电镜⼯作者都⾯临着⼀个不能回避的事实，就是所有⽣命科学以及许多材料科学的样品都含有液体成分。
很多动植物组织的含⽔量达到98%，这是扫描电镜⼯作者最难对付的样品问题。
冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）技术是克服样品含⽔问题的⼀个快速、可靠和有效的⽅法。
这种技术还被⼴泛地⽤于观察⼀些“困难”样品，如那些对电⼦束敏感的具有不稳定性的样品。
各种⾼压模式如VP、LV和ESEM的出现，已允许扫描电镜观察未经冷冻和⼲燥的样品。
冷冻电镜技术速冻到液氮的原理
冷冻电镜技术速冻到液氮的原理
冷冻电镜技术中，速冻到液氮的原理涉及到样品的快速冷冻以及其后续的处理过程。
在冷冻电镜技术中，样品通常是生物组织或细胞，需要在其自然状态下进行观察。
因此，为了保持样品的原貌并避免伪形态的产生，需要将样品迅速冷冻以固定其结构。
首先，样品通常被置于一种称为冷冻固化剂的物质中，这种物质可以迅速将样品冷冻并固化。
常用的冷冻固化剂包括液氮和乙烷等。
以液氮为例，液氮的温度极低，约为-196摄氏度，能够迅速将样品冷冻至极低温度，从而防止样品内部结构的变化。
在冷冻过程中，样品会迅速形成冰晶，这有助于保持其原始形态。
其次，冷冻后的样品需要进行进一步的处理，以便在电子显微镜中观察。
通常，冷冻固化的样品会被转移到真空中，并通过升温和脱水等步骤，使其逐渐从冷冻状态转变为可观察的状态。
在这个过程中，样品会被逐渐加热并脱除水分，最终形成适合在电子显微镜中观察的样品。
总的来说，冷冻电镜技术中，速冻到液氮的原理是利用极低温度的液氮迅速将样品冷冻固化，以保持样品的原始结构，然后通过
逐渐升温和脱水等处理，将样品转变为适合在电子显微镜中观察的状态。
这一过程确保了样品在电子显微镜中的观察结果准确性和可靠性。
冷冻电镜技术PPT课件
1 冷冻电镜技术的概述
什么是Cryo-EM
冷冻电镜即冷冻电子显微镜 (cryo-electron microscopy，cryo-EM)，是将生物大分子快速冷 冻后，在低温环境下利用透射电子显微镜对样 品进行成像，再经图像处理和重构计算获得样 品的三维结构。
4
1 冷冻电镜技术的概述
看清楚分子级别的结构必须用电子显微镜
蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的
膜蛋白结构。
13
冷冻电镜技术的发展 2
细菌视紫红质3D结构
1975年，Richard Henderson（理查德·亨德森）利用电子显微三 维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。 这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。
冷冻电镜技术 Cryo-EM
1
1 冷冻电镜技术的概述
什么是Cryo-EM、冷冻电镜的分类
目
C
O录
N T E N T S
2 冷冻电镜技术的发展
1968—→Now
3 冷冻电镜技术的原理
样品冷冻、冷冻成像、三维重构
4 冷冻电镜技术的应用
结构生物学、医疗、具体应用场景
2
1
PA R T
冷冻电镜技术的概述
3
形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品
2013
冷冻电镜三维重构技术确 定蛋白质TRPV1结构，标 志着冷冻电镜跨入“原子
分辨率”时代
1974
Robert Glaeser首次提出并进行 了冷冻含水生物样品的电镜成像。
1981
Joachim Frank完成了单颗粒
三维重构算法及软件Spider。
1990 Ric年hard Henderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质
低温冷冻电镜技术解析结构
低温冷冻电镜技术解析结构低温冷冻电镜技术是一种用于解析生物大分子结构的先进技术。
它的原理是将样品在极低温下快速冷冻，然后在冷冻状态下观察和拍摄样品的电子显微镜图像。
通过这种技术，科学家们能够研究生物分子的三维结构，从而揭示生物分子在细胞功能中的作用。
低温冷冻电镜技术的发展使得我们能够观察到更接近生物体内情况的样品结构。
传统的电镜技术需要对样品进行固化和染色处理，这往往会引入人为的变形和伪装，导致样品的结构信息受到影响。
而低温冷冻电镜技术能够在样品自然状态下进行观察，避免了这些问题。
在低温冷冻电镜技术中，最关键的一步是样品的冷冻过程。
样品需要在极短的时间内被迅速冷冻到液氮温度以下，以避免水分子形成冰晶，从而导致样品的结构变形。
为了实现快速冷冻，科学家们通常使用液氮喷射或液氮浸泡的方法，将样品迅速冷却到液氮温度以下。
冷冻后的样品需要被转移到电镜的真空室中进行观察。
为了保持样品的低温状态，科学家们通常使用液氮来维持样品的温度。
在观察过程中，电子束通过样品并被检测器接收，形成电子显微镜图像。
这些图像经过处理和分析后，科学家们可以重建出样品的三维结构。
低温冷冻电镜技术在生物科学研究中有着广泛的应用。
它可以被用来研究蛋白质、核酸、细胞器和细胞膜等生物分子的结构。
通过观察这些分子的结构，科学家们可以了解它们在细胞功能中的具体作用。
这对于揭示生物分子的功能和疾病机制非常重要。
除了生物科学研究，低温冷冻电镜技术还在药物研发和材料科学领域有着重要的应用。
在药物研发中，科学家们可以利用这种技术来观察药物与靶标分子的相互作用，从而优化药物的设计。
在材料科学中，低温冷冻电镜技术可以帮助科学家们研究材料的微观结构，从而改进材料的性能。
低温冷冻电镜技术是一种非常重要的生物大分子结构解析技术。
它通过快速冷冻样品并在低温下观察样品的电子显微镜图像，揭示了生物分子的三维结构。
这种技术在生物科学、药物研发和材料科学等领域有着广泛的应用前景，将为我们揭示生物体内的奥秘和推动相关领域的发展做出重要贡献。
冷冻电镜制样流程
冷冻电镜制样流程冷冻电镜（cryo-electron microscopy）是一种用于观察生物分子的高分辨率电镜技术，它可以在冷冻的状态下直接观察生物分子的结构。
相比传统的电镜技术，冷冻电镜能够提供更高的分辨率和更真实的结构信息，因此在生物科学研究中得到了广泛的应用。
1.选择适当的样品：首先，要选择适合进行冷冻电镜观察的样品，通常是蛋白质、蛋白质复合物、病毒或细胞等生物分子。
样品应具有较高的纯度和稳定性，并且能够在低温条件下适当冻结。
2.制备冷冻电镜网格：使用特殊的电子显微镜网格制备样品载体，通常是由碳或氧化硅等材料制成。
这些网格是非常薄的，样品可以被直接放置在其表面。
3.调整制样参数：根据样品的特性和所需要的分辨率，调整各种制样参数。
这些参数包括冷冻速率、冻结液的成分和温度等。
冷冻速率是制样的关键参数之一，它能影响样品的冷冻效果和结构质量。
4.加载样品：将样品溶液滴在电镜网格上，然后迅速从反面用纸吸干多余的液体。
样品的浓度应适当，以避免结构中的过度吸收或散射。
5.冷冻样品：将已加载的样品网格迅速放置在冷冻压制机中，通过控制温度和压力来冷冻样品。
冷冻的目的是快速冻结样品，以保持其原始结构。
6.保存和传输样品：冷冻后的样品应立即封存，通常使用液氮来保存。
在传输或搬运时，需要采取适当的保护措施，确保样品不受到损坏。
7.电镜观察：将冷冻的样品网格放置在冷冻电镜中，然后使用高分辨率电子束来观察样品的结构。
观察过程中需要避免样品的加热和辐射。
8.取得图像和数据处理：通过电子镜的成像系统获得样品图像，然后使用图像处理软件对图像进行修正和重建。
这些步骤包括噪声过滤、对齐和三维重构等。
冷冻电镜的原理及分类
冷冻电镜的原理及分类冷冻电镜（Cryo-EM）是一种用于生物样品的高分辨率电子显微镜技术。
它允许研究人员在生物冷冻状态下研究细胞和蛋白质的结构，而无需对样品进行固定、染色或晶化。
冷冻电镜的原理是将样品冷冻在液氮温度下（约-196），以减少辐射损伤和质子晃动，然后使用电子束照射样品，最后通过记录电子束传导，获得样品的二维或三维影像。
冷冻电镜的分类可以基于使用的技术和设备。
以下是几种常见的冷冻电镜分类：1. 传统冷冻电镜：传统冷冻电镜采用冷冻固化和真空干燥技术对样品进行制备。
样品通常需要固定、切片、冷冻，并通过真空干燥以降低样品的温度和压力，最后使用电子束对样品进行成像。
由于使用了真空干燥技术，这种冷冻电镜不能适应水性样品。
2. 高压冷冻电镜：高压冷冻电镜通过在高压下以固态冷却样品，然后通过电子束成像样品。
这种技术可以更好地保持样品的原始结构和水性环境，避免固定和干燥过程中可能引起的伪像。
3. Cryo-FIB（冷冻聚焦离子束）电镜：Cryo-FIB电镜通过将样品的冷冻微切片与聚焦离子束成像技术相结合，实现冷冻样品的切片和成像。
这种技术可以用于获得冷冻样品的三维结构信息。
4. Cryo-ET（冷冻电子断层术）电镜：Cryo-ET电镜将冷冻样品的序列二维图像重建成三维图像。
这种技术通过拍摄样品的序列图像，然后利用计算机算法将这些二维图像组合成三维模型。
冷冻电镜作为一种高分辨率的电子显微镜技术，具有很多应用领域。
它可以被广泛应用于生物学、生物医学、药物研发等领域，用于研究和理解蛋白质的结构和功能。
冷冻电镜可以帮助科学家揭示生物分子及其复合物的大量结构信息，为药物设计和疾病研究提供重要的参考和依据。
冷冻电镜名词解释细胞生物学
冷冻电镜名词解释细胞生物学冷冻电镜（Cryo-electron microscopy）是一种在细胞生物学中广泛应用的技术，它通过将生物样品冷冻到极低温度，并使用电子束来观察样品的高分辨率图像。
冷冻电镜技术的发展为科学家们提供了一种研究生物体内部结构和功能的强大工具。
在传统的电子显微镜中，样品需要进行化学固定和切片处理，这可能导致样品的形态和结构发生变化。
而冷冻电镜技术则能够在无需进行这些处理的情况下，直接观察样品的原始状态。
这使得科学家们能够更准确地研究细胞和生物分子的结构和功能。
冷冻电镜技术的核心是将生物样品快速冷冻到液氮温度（约-196℃），以防止样品中的水分子形成冰晶，从而保持样品的原始结构。
冷冻过程中，样品通常会被浸泡在含有保护剂的溶液中，以保护样品免受冷冻过程中的损伤。
冷冻完成后，样品被转移到冷冻电镜中进行观察。
在冷冻电镜中，电子束通过样品并与之相互作用，形成电子透射图像。
这些图像被记录下来，并通过计算机处理和重建来生成高分辨率的三维结构模型。
通过观察这些模型，科学家们可以了解细胞和生物分子的内部结构和组织方式。
冷冻电镜技术在细胞生物学中的应用非常广泛。
它可以用来研究细胞器、蛋白质复合物、病毒等生物分子的结构和功能。
例如，科学家们利用冷冻电镜技术成功地解析了许多重要生物分子的结构，如核糖体、ATP合成酶等。
这些研究对于理解生命的基本过程和疾病的发生机制具有重要意义。
除了在细胞生物学领域的应用，冷冻电镜技术还被广泛应用于药物研发和生物医学研究中。
通过观察药物与靶分子之间的相互作用，科学家们可以设计出更有效的药物，并了解药物如何在细胞内起作用。
此外，冷冻电镜技术还可以用于研究蛋白质聚集和与疾病相关的蛋白质异常聚集现象，如阿尔茨海默病、帕金森病等。
尽管冷冻电镜技术在细胞生物学研究中具有重要作用，但它也存在一些挑战和限制。
首先，由于电子束与样品相互作用的方式不同于光束与样品相互作用的方式，因此冷冻电镜技术无法直接观察活体细胞的动态过程。
冷冻电镜的原理及应用实验报告
冷冻电镜的原理及应用实验报告1. 引言冷冻电镜（Cryo-EM）是一种利用电子显微镜技术进行生物大分子结构研究的重要手段。
与传统的电子显微镜不同，冷冻电镜采用冷冻样品的方法，在低温条件下观察样品的结构，并可以获取高分辨率的图像。
本实验报告将介绍冷冻电镜的原理及其在生物科学领域的应用。
2. 冷冻电镜的原理冷冻电镜的原理基于两个关键概念：冷冻样品制备和电子显微镜成像。
2.1 冷冻样品制备在冷冻电镜中，样品制备是非常关键的一步。
通常，生物大分子（如蛋白质、核酸等）需要被固定、冻结和切片，以确保在电镜下观察时不会失去其原始结构。
2.1.1 固定样品通常采用化学交联或冷冻固定的方法，将生物大分子在其活性状态下进行固定，以保持其原始结构。
2.1.2 冻结样品将固定的样品快速冷冻至液氮温度以下，通常使用液氮或液氮中的乙烷来冻结样品。
快速冻结的过程可以防止样品的晶体结构形成，从而保持其生物活性。
2.1.3 切片样品将冻结的样品切片成非常薄的层片，常见的切片工具有超声切片仪和离心切片仪。
切片过程会产生稀薄的样品片层，便于电子显微镜的成像。
2.2 电子显微镜成像冷冻电镜利用电子束对冻结的样品进行成像。
电子束经过样品后被聚焦在感光底片或电子探测器上，从而获得样品的显微图像。
2.2.1 电子源冷冻电镜中使用的电子源通常为高能电子束，通常需要电子枪产生高能电子。
2.2.2 电磁透镜系统电子束通过电磁透镜系统进行聚焦。
电子束经过减薄样品后被聚焦在感光底片上，形成显微图像。
3. 冷冻电镜的应用冷冻电镜在生物科学领域有着广泛的应用，尤其在生物大分子的结构研究方面表现出色。
3.1 生物大分子结构研究冷冻电镜可以用于高分辨率的生物大分子结构研究，包括蛋白质、DNA、RNA 等生物分子的结构分析。
通过冷冻电镜的成像技术，可以观察到这些生物分子的微观结构，从而深入了解它们的功能和作用机制。
3.2 药物研发冷冻电镜在药物研发领域也发挥了重要作用。
冷冻电镜的基本原理与应用
冷冻电镜的基本原理与应用引言冷冻电镜（cryo-electron microscopy）是一种重要的结构生物学技术，可以用于研究生物大分子的三维结构。
本文将介绍冷冻电镜的基本原理和应用。
基本原理1.冷冻技术：冷冻电镜技术利用低温将生物样品快速冷冻到液氮温度下，以防止样品在电镜真空环境下的脱水和离解。
常用的冷冻方法包括液氮浸泡法和喷射法。
2.电子显微镜：冷冻电镜采用电子束取代光束，通过控制电子束的聚焦、透射、散射和干涉等特性来观察和分析样品的结构。
电子显微镜通常由光源、准直系统、透射系统、检测器和成像系统等组成。
3.图像重建：冷冻电镜通过收集样品在不同角度下的二维投影图像，并通过图像处理和三维重建算法，得到样品的三维结构信息。
应用领域冷冻电镜技术在以下领域得到了广泛应用： - 生物分子结构研究：冷冻电镜可用于解析蛋白质、核酸和病毒等生物大分子的三维结构，帮助研究人员理解生物分子的功能和机制。
- 药物开发：冷冻电镜可以提供药物设计和优化的结构信息，帮助药物开发人员进行药物筛选和设计。
- 疾病研究：冷冻电镜可以用于研究疾病相关蛋白的结构变化以及疾病的发生机制，为疾病的诊断和治疗提供科学依据。
- 纳米技术：冷冻电镜可以用于研究纳米粒子和纳米材料的形态和结构，有助于纳米技术在材料科学和能源领域的应用。
冷冻电镜的优势与传统的X射线晶体学和核磁共振等技术相比，冷冻电镜具有以下优势： - 无需晶体：冷冻电镜可以直接观察非结晶生物样品的结构，无需进行晶体生长，可以观察到更多的生物分子。
- 高分辨率：冷冻电镜可以达到亚纳米甚至亚埃级的高分辨率，可以揭示出更细致的生物分子结构信息。
- 快速：冷冻电镜可以在短时间内获取大量样品的结构信息，加快了研究进程。
- 样品准备简单：相比于其他结构生物学技术，冷冻电镜样品的制备相对简单，只需要进行冷冻处理即可。
结论冷冻电镜是一种重要的结构生物学技术，能够提供生物大分子的高分辨率三维结构信息。
冷冻电镜技术知识分享
冷冻扫描电镜技术一般是在普通扫描电镜上加装低温冷冻传输系统和冷冻样品台装置，它是在扫描电镜 的基础上发展起来的一种技术，可以直接观察液体、半液体的样品，不需要对样品进行干燥处理，最大
程度地减少了常规的干燥过程对高度含水样品的影响。
冷冻蚀刻电子显微镜（ F r e e z e - e t c h i n g ）
冷冻电镜单颗粒三维重构算法
1981年，Joachim Frank（约阿希姆·弗兰克）完成了单颗粒三维重 构算法及软件Spider，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集 起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式 将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一 种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像。 单颗粒三维重构算法对于实现无需结晶的蛋白质三维结构解析至关重要， 弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基石。
形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品
2013
冷冻电镜三维重构技术确 定蛋白质TRPV1结构，标 志着冷冻电镜跨入“原子
分辨率”时代
1974
Robert Glaeser首次提出并进行 了冷冻含水生物样品的电镜成像。
1981
Joachim Frank完成了单颗粒 三维重构算法及软件Spider。
1990 Ric年hard Henderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质
蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的 膜蛋白结构。
冷冻电镜技术的发展 2
细菌视紫红质3D结构
1975年，Richard Henderson（理查德·亨德森）利用电子显微三 维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。 这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。
冷冻电镜在生命科学中的应用
冷冻电镜在生命科学中的应用冷冻电镜是现代生命科学研究中的重要手段之一。
它结合了冻脱水和电子显微镜技术，能够在高分辨率下观察生物大分子结构，鉴定生物分子的构型以及生物大分子的结构与功能关系。
冷冻电镜可以探究生物大分子复杂化的相关问题，对于现代生物学、医学和生物制药产业的发展都有着重大的意义。
一、冷冻电镜的基本原理冷冻电镜是冷冻电镜制冷器的一种扩展和改进。
在原理上，冷冻电镜和传统的电镜技术基本一致。
不同的是，在这个过程中，底片与样品之间添加的是冷冻水，而不是化学固定剂。
这种方法使得底片上的样品能够以其天然状态在高真空条件下保持稳定，从而获得结构上更加真实的高质量图像。
二、1.生物分子的高分辨率成像。
由于冷冻电镜具有快速冻结样品的能力，它可以在不破坏样品的情况下直接观察细胞内的精细结构。
这样的解析度能够显示出仅仅几个原子的空间结构，从而确定复杂的生物分子和生物细胞的形态和构造。
冷冻电镜技术的应用范围非常广泛，例如：DNA 分子、蛋白质分子的结构、细胞膜片的稳定性，以及细胞内的细胞器亚单元等等。
2.生物分子的识别和鉴定。
通过冷冻电镜技术获得的复杂分子结果可以执行三维数字化的建模。
这对于生物大分子结构的鉴定具有很大的意义，特别是对于复杂蛋白质、肝细胞和其他重要的生物大分子的研究。
冷冻电镜也可以用于探究生物分子的区分，这在生物科学的精准研究中将发挥重要作用。
3.研究生物分子和细胞的复杂化进程。
冷冻电镜技术让生物分子研究者有了越来越全面的采样和分析方法。
这种方法可用于观测细胞内各种分子的运动和交互作用，帮助生物学家发现生命科学中很多问题的答案。
这种方法还可以描绘生物分子在不同构型中的互动，进而研究复杂生物分子对环境变化的响应，误代尔的化学反应或生命进化。
三、冷冻电镜技术的局限性尽管冷冻电镜的应用范围非常广泛，但它仍然存在许多局限性。
首先，它无法直接获得生物分子的动力学信息，不能直接探测生物分子和细胞内的动态变化；其次，这种技术需要高质量的样品和优秀的技术，一旦出现问题，将会造成获得的数据信号的严重缺陷，甚至无法正确处理；最后，其成像的分辨率要取决于底片的厚度，对较大或较厚的样品则不适用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实用标准文案
冷冻电镜技术课程学习报告一、课程所讲基础知识回顾
1、电子显微镜成像技术的发展历史
（1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）：
该技术的原理为重金属燃料与H结合，特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。
但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。
此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。
（2）上世纪60年代的三维重构技术
三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。
因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维结构。
显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。
在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。
（3）上世纪70年代的电子晶体学
即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。
被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。
该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。
在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。
（4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm）
主要原理为将样品快速冷冻在玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液精彩文档．
实用标准文案
中相同，呈天然状态。
因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。
2、冷冻电镜技术介绍
（1）关于玻璃态冰：
冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。
若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟10摄氏度。
4此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。
（2）操作步骤概要：
冷冻包埋——转移至液氮或液氦中——观测，图像采集——三维重构（3）图像采集的质量要求：
应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。
此外，特别应注意的是，该方法对电子剂量很敏感，最适为10e/A，明显超过最适剂2量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。
因此，必须采用低剂量技术（≤20e/A），用1k~3k倍的低倍镜寻找，在目
2标域的临近区聚焦，使记录区域仅在拍摄时（1s左右）受到电子辐射，保证样品不被损坏。
二、课外补充学习：冷冻电镜技术难点的扩展阅读
1、冰晶污染
冰晶污染是冷冻电镜的主要问题和最重要的难点，可发生在冷冻电镜的各个步骤。
在每个步骤中，冰晶污染的形成的主要原因不同。
精彩文档．
实用标准文案
在冷冻制样阶段，冰晶污染形成的原因主要有三点：
（1）冷冻速率不够；
（2）冷却剂的温度未接近凝点；
（3）容器边缘的小冰晶坠入液氮中．黏附在样品上，或在样品转移过程，空气中的水分子凝结在样品表面。
2、电子辐射损伤
电子辐射损伤的原因几乎均可归结为热效应，被辐照区域的损伤大致可分为晶化、升华、起泡和漂移4种类型。
（1）晶化——与电子束的加速电压和电子剂量有关，一般发生在样品表面，玻璃态的冰晶化形成立方晶相，失去各向同性。
（2）升华——也发生在样品表面，本身现象与电子剂量无关，但是升华速率与电子剂量有关．电子辐射会增加样品表面分子的动能，从而增加样品表面分子脱离样品表面的几率。
（3）起泡——对于较厚的含水样品。
非弹性散射将造成能量沉积，大部分发生在接近样品表面的内层，此外，水是热的不良导体，因此会出现起泡现象。
随电子剂量的增加，起泡的范围和形态也会有所不同。
（4）漂移——样品的物理漂移来自于样品本身的形变，而样品的象漂移原因为电子在样品内的沉积，对电子束的偏转方向产生影响。
一般来说，使用尽可能低的电子剂量和尽可能小的照明光斑是避免上述四种辐射损伤的最佳方法。
精彩文档．
实用标准文案
3、图像去噪
由于冷冻电镜特殊的低电子剂量和低衬度成像技术，使得图像反差弱，信噪比低，不易提取有效的结构信息。
而滤波是图像去噪的主要方法。
其原理为将信号和噪声都视为随机信号，利用它们不同的统计特征，通过最小方差估计某点的最似信号类型，若为噪点则予以除去。
此外，图像增强和图像复原也可相对地减轻噪点对信号图像的影响，其中图像增强是将人们主观感兴趣的部分亮度提高，而图像复原则是针对图像中客观存在，但受到了噪点干扰（称为退化）的样品信号，将它们的结构性信息予以恢复。
对于图像增强，一般会综合采用滤波、掩模、灰度变换、直方图均衡化等方法对感兴趣区域的信息进行增强；而图像复原的典型方法是根据先前的样品经验，建立一个退化模型，以此模型为基础采用滤波等手段处理，使得复原后的图像符合一定的准则，达到改善图像质量的目的。
其中信嗓比是评价图像复原程度的主要标准之一。
三、我国冷冻电镜技术的新应用
2011年1月，中科院生物物理所利用冷冻电镜平台，获得了呼肠孤病毒科的质型多角体病毒近原子分辨率的三维结构，并独立构建了全原子模型。
这是我国首次利用冷冻电镜技术解析生物大分子原子结构模型，也是世界上首次利用冷冻电镜图像获得的生物大分子复合体的全原子模型。
该研究确认了呼肠孤病毒mRNA的流出通道，定位了该病毒的两个甲基转移酶，并揭示了该流出通道是如何引导mRNA依次经过这两个甲基转移酶以完成“加帽”过程的。
在论文《Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structure 精彩文档．
实用标准文案
provides insight into the mechanism of mRNA capping》中，研究人员通过冷冻电镜技术，得出以下结论：（1）CPV与其他呼肠孤病毒科相比，其主要衣壳蛋白缺乏特异的氨基酸序列，但它具有结构保守的酶蛋白VP3和衣壳蛋白VP1，表明具turret蛋白的呼肠孤病毒科的mRNA转录机制和衣壳组装机制有共性。
（2）CPV五聚体turret蛋白顶部独特的结构组织区是其指导mRNA完成“加帽”过程的关键区域。
（3）CPV的VP5蛋白由RNA第7节段编码，是由P50蛋白在转译后分裂产生的。
四、冷冻电镜技术的应用前景
随生物成像技术的发展，电镜技术已不再限于单纯的形态结构研究，而发展为不同水平上的显微学技术综合应用。
同时，显微学技术与细胞生物学、分子生物学等其他生命科学技术的结合应用正在成为研究热点。
例如，免疫细胞化学与电镜技术相结合，使原位杂交技术已从理论走向实际，得到相当普遍的应用。
因
此，冷冻电镜技术在对物质细微结构与功能的分析上必将极大地推动生物医学的发展。
参考资料：
[1] 尹长城老师《现代生物医学成像技术》选修课内容
冷冻电镜技术与冷冻电镜图像去噪研究[D].中山大学.2005
[2] 李鲲鹏
Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structure
[3] Cheng L, Sun J. et al.
provides insight into the mechanism of mRNA capping. Proc Natl Acad Sci USA.
精彩文档．
实用标准文案
2011 Jan 25;108(4):1373-8.
电子显微技术的发展趋势及应用特点，现代科学仪器. 2008.1 刘安生，[4] 张德添，朱衍勇：6-11
精彩文档．。