荧光原位杂交 综述
荧光原位杂交技术原理
荧光原位杂交技术原理
荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）
是一种用于检测和定位靶标DNA序列的方法。
其原理是利用
荧光标记的DNA探针与靶标DNA特异性结合，通过荧光显
微镜观察细胞核内荧光信号的强度和位置，从而确定目标
DNA序列在细胞核中的位置和数量。
荧光原位杂交技术的步骤包括标记DNA探针、固定细胞样品、使细胞核开放透明化、探针与目标DNA杂交、洗涤去掉无特
异连接的探针、显微镜观察和分析。
在标记DNA探针的过程中，将目标DNA序列特异性引物和
荧光标记的核苷酸引物结合，通过聚合酶链反应使DNA探针
荧光标记。
标记DNA探针可以选择性地与目标DNA序列进
行互补结合。
固定细胞样品后，可以通过化学方法将细胞膜破裂并使细胞核透明化，使DNA探针能够更好地进入细胞核。
随后将标记好
的DNA探针加入样品中，在适当的温度下进行DNA杂交反应。
如果目标DNA序列在细胞核中存在，则DNA探针与目
标DNA序列结合，形成探针-目标DNA复合物。
在杂交反应后，需要进行洗涤步骤以去除无特异连接的DNA
探针。
这样可以提高荧光信号的特异性和强度。
最后，利用荧光显微镜观察样品中的荧光信号。
荧光探针与目标DNA序列结合后会发出特定颜色的荧光信号，可以通过观
察荧光信号的位置和强度来确定目标DNA序列在细胞核中的位置和数量。
荧光原位杂交技术可以应用于医学诊断、基因定位等领域，成为研究细胞遗传学和基因组学的重要工具。
荧光原位杂交 综述
荧光原位杂交（FISH）综述摘要本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。
关键词：荧光原位杂交;1.发展荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。
荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。
1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。
2.原理通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。
由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。
原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。
所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。
只有这样染色体DNA才能与探针杂交。
变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。
灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。
如果使用低辐射能的放射性标记物，如3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。
荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
分子病理学技术之荧光原位杂交
分子病理学技术之荧光原位杂交分子病理学技术之荧光原位杂交分子病理学是病理学的一个重要分支，其在疾病的诊断、靶向治疗及预后预测等方面的作用日益凸显。
分子病理学技术主要包括三大类：1.荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)；2.测序技术（包括Sanger测序、二代测序等）；3.基于PCR的技术（包括PCR、RT-PCR、实时定量PCR及数字PCR等）。
虽然以上每一类技术都有其特定的检测特点及范围，但作为与病理形态学联系最为紧密的FISH技术，迄今为止，在淋巴瘤、白血病、乳腺癌、胃癌等疾病的临床应用中，依然无法替代。
FISH是一种基于核酸双链互补的原则，将荧光标记的核酸探针与细胞核内靶DNA进行杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来判断靶DNA数目和结构变化的技术。
其基本原理是：核酸变性-退火-复性。
该技术有很高的敏感性和特异性，可用于检测淋巴瘤、白血病及其它各种实体瘤细胞的染色体/基因数目和结构的变化，包括染色体易位、非整倍体变化，基因缺失、扩增等分子遗传学改变，为临床病理工作中疾病的诊断、分类、靶向治疗及预后预测提供准确的分子遗传学信息。
对医院来说，FISH是分子检测领域技术和设备要求门槛最低的平台，只需一台杂交仪和一台荧光显微镜即可开展。
不像PCR需要认证的实验室，也不像二代测序需要强大的数据分析能力。
然而，'第三类体外诊断试剂管理条例'对于FISH探针的限定，曾经在一定程度上有碍这一技术的应用。
近来，国家明文发布，对于非明确诊断意义或临床指导用药的体外诊断试剂，不再按第三类体外诊断试剂进行管理，这也就意味着许多FISH探针不再需要'第三类体外试剂'的报证即可在医院病理科应用，这对临床来说绝对是巨大的好消息！目前除了HER2 及ALK等少数探针外，绝大部分探针均无需'三类证'，这对于满足临床对FISH技术的迫切需求具有重大意义。
什么是荧光原位杂交（FISH）？
什么是荧光原位杂交（FISH）？“关于FISH实验的一些内容。
”近来，有伙伴在后台咨询了荧光原位杂交(FISH)实验的相关知识，因此小编想在今天推文简单聊一聊FISH实验，也讲点新花样。
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01—什么是FISHFISH：采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针，标记了生物素或荧光素，在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则，使得DNA-DNA原位杂交，采用荧光法显示，最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。
上一代的FISH还是采用的同位素进行标记，现在基本上都是荧光标记了。
在此，要感谢J.G.Baunlan这位大神了。
有了FISH，我们可以不再仅仅依赖分子生物学的方法来检测DNA 的表达了。
FISH技术最大的优点是可以在间期细胞核上直接观察到DNA扩增，并且荧光信号的强度直接与DNA扩增水平直接相关。
这些都大大促进了分子细胞遗传领域的科学研究，同时也是临床上诊断肿瘤的利器。
02—FISH的实验要点网上有很多关于FISH的实验步骤教程，但每个探针盒子的操作可能存在差异。
懂了原理，才能以不变应万变。
因此，本部分主要是详细讨论实验要点。
FISH的大致步骤分为探针变性、标本变性、杂交、洗脱、杂交信号放大(适用于适用生物素标记的探针)、复染、封片、荧光显微镜观察FISH结果。
要点：（1）良好的前期标本制备十分重要，这点对于采用秋水仙素刺激得到中期染色体分裂象尤为重要。
刺激时间过短或过长都会影响实验观察，因此需要耐心摸索作用时间。
（2）蛋白酶K的作用浓度。
浓度高了极易影响细胞核形态，造成模糊不清，浓度低了则探针不易进入细胞核，杂交率大大降低。
石蜡切片一般要达到10-30min，不要超过半小时，一般来说，20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min足矣。
荧光原位杂交
荧光原位杂交
• FISH技术包括下列几个步骤：
• 1）探针的制备和标记 • 2）探针及标本变性 • 3）杂交 • 4）洗脱 • 5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） • 6）封片 • 7）荧光显微镜观察FISH结果
荧光原位杂交
探针的制备和标记
• 探针是一段带有荧光色素或（半）抗原的核苷酸序列。 其长度介于15至数千个核苷酸之间，但以250~650个核 苷酸杂交效果最好
下。 （8） 取出玻片，自然干燥。 （9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻
片。
荧光原位杂交
封片 • 可采用不同类型的封片液。如果封片液中
不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作 用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发， 可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻 片标本可以在-20～-70oC的冰箱中的暗盒 中保持数月之久。
5～10min，使双链DNA探针变性。 2）标本变性 • ①将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片
2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中 退色后再烤片）。 • ②取出玻片标本，将其浸在70～75oC的体积分数70 ％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。 • ③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90 ％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然 后空气干燥。
洗脱
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。 （1） 杂交次日，将标本从37oC温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻 片揭掉。 （2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50oC的体积分数50 ％甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
（3） 在已预热42～50oC的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
荧光原位杂交
荧光原位杂交荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种分子生物学技术，可以用来检测DNA或RNA序列的存在、位置和数量。
该技术通常使用荧光染料标记DNA或RNA的探针来识别特定的序列。
在荧光原位杂交中，常常使用单链DNA或RNA的Oligonucleotide探针。
探针的序列与待检测样品中的特定DNA或RNA序列互相互补，使得探针和样品DNA或RNA序列可以杂交在一起。
探针可以被标记成许多不同的荧光染料，如荧光素、罗丹明等，以使得检测到的探针可根据颜色进行区分。
荧光原位杂交过程包括以下步骤：1. 选择合适的探针。
选择的探针实际上就是一个人工合成的核酸分子，其长度在20-200bp不等，可以与靶序列DNA或RNA中的任意位置相互匹配，检测的种类也包括基因、病毒、染色体等。
2. 标记探针。
标记探针是指把荧光染料等标记物与探针进行化学共价修饰，使之形成标记的探针，标记的探针使用单染色荧光或双染色荧光。
3. 处理样品。
把检测样品进行前处理、处理固定等。
4. 杂交。
把标记的探针打入处理好的样品中，如细胞、组织、染色体等，探针就会与相应的靶分子发生杂交，然后把样品用适当的盐洗。
5. 检测结果。
通过荧光显微镜进行探针的显示，可以看到细胞核内亮相区域，确定靶序列的定位和相应的染色体编号，并可以通过比较实验组和对照组的信号强度，得到目标序列的数量和比例。
荧光原位杂交在基因检测、疾病诊断、癌症诊断和治疗中都有广泛应用。
在基因诊断中，荧光原位杂交可以检测微观缺失、染色体重排列和染色体数目异常等，具有高准确度、高敏感度、高特异性和可显性等特点。
在肿瘤诊断和治疗中，荧光原位杂交是一种高效而准确的技术，可以评估患者的病情、选择合适的治疗方案，预测预后。
因此，荧光原位杂交在生命科学研究和医学诊断中的应用前景非常广阔。
荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的专家共识
荧光原位杂交技术（FISH）在产前诊断中的应用一直备受关注。
近年来，随着该技术在临床实践中的不断深入和发展，专家共识也逐渐形成。
在本文中，将从深度和广度上对荧光原位杂交技术在产前诊断中的专家共识进行全面评估，并撰写一篇有价值的文章，以便读者能更深入地理解这一领域的最新进展和专家观点。
1. 荧光原位杂交技术概述- 荧光原位杂交技术是一种基于DNA的细胞遗传学技术，能够定位和检测细胞中特定DNA序列的存在和定位。
该技术通过使用标记了荧光物质的探针，使得特定的DNA序列在细胞或组织的显微镜下呈现出荧光信号，从而实现对细胞遗传信息的定量和定位检测。
在产前诊断中，荧光原位杂交技术能够用于检测胎儿染色体异常、基因突变等遗传性疾病，具有高灵敏度和特异性的优势。
2. 专家共识的形成- 随着荧光原位杂交技术在产前诊断中的广泛应用，越来越多的专家学者参与其中，并在临床实践和科研工作中积累了大量的经验和数据。
通过学术会议、专家讨论会、文献研究等形式，专家们逐渐达成了对荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的共识。
这些共识涵盖了该技术的临床适应症、操作规范、质控要求、结果解读等方面，为该领域的规范化和标准化提供了重要指导。
3. 专家共识的内容和意义- 在产前诊断中，荧光原位杂交技术的专家共识主要包括对该技术的临床应用范围和标准化操作流程的制定。
专家们一致认为，该技术在胎儿染色体异常、染色体结构异常、基因突变等方面具有重要应用意义，可以为胎儿遗传疾病的早期筛查和诊断提供可靠依据。
专家共识还对该技术的样本采集、实验操作、结果解读等方面提出了具体要求，以确保临床应用的准确性和可重复性。
4. 个人观点和理解- 就我个人来说，我认为荧光原位杂交技术在产前诊断中的应用具有重要的临床意义和发展前景。
通过该技术，我们可以更准确地了解胎儿遗传信息，及时发现和诊断潜在的遗传疾病，为家庭和社会减少遗传疾病的发病率和负担提供了可能。
专家共识的形成也为该技术在临床实践中的标准化和规范化提供了重要支持，有助于推动该领域的进一步发展和应用。
荧光原位杂交技术的应用研究
荧光原位杂交技术的应用研究荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是现代生命科学中一种重要的分子生物学手段。
它可以帮助研究者对细胞中的DNA和RNA进行高精度检测，以获得关于基因组结构、功能和调节的深入了解。
本文将介绍荧光原位杂交技术的基本原理、发展历程以及应用研究。
一、基本原理荧光原位杂交技术是一种显微镜下的遗传分析技术，它主要基于特异性碱基互补配对的原理。
在荧光原位杂交技术中，研究者会将荧光标记的探针与待检测的细胞或组织样本中的DNA或RNA特异结合，通过观察荧光信号来获得相应序列的位置和数量信息。
荧光探针通常由DNA或RNA突出部分构成，这些突出部分可以与待检测的DNA或RNA序列中互补的碱基配对，从而形成探针/样本复合物。
探针上的荧光标记可以是染料、荧光蛋白或其他发光分子，通过荧光显微镜观察，可以直接观察到目标序列的位置和数量，实现高精度监测和检测。
二、发展历程荧光原位杂交技术的最早形式可以追溯到20世纪70年代，当时科学家们使用辐射性同位素标记的DNA探针进行了首次的原位杂交试验。
这种方法虽然可以标记目标序列，但同时也带来了核辐射的问题，因此尽快走出这种标记方法是一个亟需解决的问题。
随着荧光分子标记的引入，20世纪80年代以来，荧光原位杂交技术得到了迅速发展。
最早的荧光分子标记是荧光酮（Fluorescein），后来逐渐出现了更为明亮和稳定的有机荧光染料和荧光蛋白标记方式。
这些标记可以分别标记不同的DNA或RNA序列，并可以在同一样本中同时检测多个目标序列。
近年来，随着图像分析技术的提升，荧光原位杂交技术得到了更为广泛的应用。
特别是在医学和生物技术领域，成为了检测癌症、罕见病、生物组织细胞变异、微小RNA的定量研究等的首选手段。
三、应用研究由于荧光原位杂交技术可以高精度、高灵敏度、高特异性地监测不同DNA或RNA序列，因此其在生命科学研究中得到了广泛的应用。
DNA荧光原位杂交（FISH）简要综述
DNA荧光原位杂交（FISH）简要综述DNA荧光原位杂交（FISH）简要综述DNA荧光原位杂交（FISH）技术是70年代末80年代初开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术，它的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记（如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP），然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。
利用FISH进行DNA序列的定位具有实验周期短、灵敏度高、分辨率高、直观可见等优点。
总的说来，FISH技术的发展沿着两条路线前进：一方面是采用不同的探针，从而衍生出许多FISH新技术，如Muticolor-FISH、CGH、GISH、CISS、BAC-FISH、Chromosome Painting、Rreverse Chromosome Painting等等；另一方面则是努力提高FISH技术的分辨率，将靶目标从中期染色体发展到DNA纤维，使其分辨率由1Mb 发展到1kb,这更进一步拓展了FISH技术的应用领域，成为分子细胞遗传学的一项代表技术。
A．不同探针的应用：1．以基因组为探针的GISH技术可以定位外源DNA片段在染色体上的位置、大小、插入点等。
Durnam（1985）首先将GISH应用于体细胞杂种的异源染色体检测。
本实验室采用GISH方法在小麦中成功定位了许多外源染色体、染色体片段以及染色体结构变异。
2．以不同的荧光素标记探针的Muticolor-FISH，可以同时定位不同探针序列的分布。
1990年Nederlof等创建了多色荧光原位杂交技术。
他们用生物素、AAF（氨基乙酰荧光素）和CP三种半抗原对不同探针作单、双、三标记，再用这三种半抗原相应的分别标记了异硫氰酸荧光素（FITC，绿色）、氨甲香豆素乙酸（AMCA，蓝色）和碱性蕊香红（TRITC，红色）的抗体来检测荧光，该技术最多可同时观察7个靶染色体。
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比荧光原位杂交法（FISH）和PCR-荧光对比（PCR-FLP）都是分子生物学中常用的技术，可以用于基因定位、染色体结构和功能等方面的研究。
本文将分别介绍这两种技术的基本原理、应用场景和优缺点。
一、荧光原位杂交法1.基本原理荧光原位杂交法是一种基于DNA序列互补碱基配对原理的技术，利用荧光探针对染色体上的特定区域进行标记，以便于观察和分析。
该技术主要包括以下几个步骤：（1）制备探针：将已知序列的DNA片段与荧光标记分子连接，生成荧光标记的DNA探针。
（2）加热解离：将待检样品中的DNA加热，使其解离成两条单链DNA。
（4）荧光显色：利用显微镜观察染色体上的荧光标记，并确定标记位置及数目。
2.应用场景荧光原位杂交法可用于以下方面的研究：（1）核型分析：检测染色体数目、大小和形态等信息。
（2）染色体重排：观察染色体间的换位、倒位等结构改变。
（3）基因定位：确定特定基因在染色体上的位置。
（4）肿瘤诊断：检测肿瘤细胞染色体的数目和结构变化。
3.优缺点（1）高灵敏度：能够检测到细胞核中的单个分子。
（2）高特异性：探针与目标序列可以实现完全互补。
（3）数据可视化：能够直观地呈现染色体结构及荧光信号大小。
而其缺点主要包括：（1）长时间实验：需要多个步骤和时间，且荧光信号非常容易被淬灭。
（2）需要DNA标记：需要荧光标记作为探针，费用较高。
二、PCR-荧光对比PCR-荧光对比（PCR-FLP）是一种应用荧光标记测量PCR产物数量的技术，能够在短时间内准确、可靠地检测和测量DNA的含量和变异。
具体操作过程如下：（1）样品制备：将待测DNA标记荧光标记，与另一非标记探针PCR反应。
（2）荧光PCR扩增：通过PCR反应增生DNA分子。
（3）荧光观察：利用荧光标记观察PCR产物。
（1）定量PCR：准确检测PCR反应中模板DNA的数目。
（2）基因表达：测量基因在不同实验条件下的表达水平。
（3）点突变检测：定性判断DNA中的单个碱基是否发生变异。
荧光原位杂交
荧光原位杂交荧光原位杂交（FluorescenceInSituHybridization，FISH）是一种非常有效的分子生物学技术，用于检测DNA或RNA位点特异性引物与目标序列的杂交，从而直接识别和定位某些具体的DNA序列或RNA序列。
它可以用于细胞内检测和定位指定片段的序列特异性，以及在细胞间，组织切片中检测特定的基因等。
FISH技术最初由美国科学家Edward T. Krick在1980年发展出来，之后又发展出多种改良的技术，如碱基特异性FISH（DNA-FISH）、RNA固定FISH（RNA-FISH）、组织芯片FISH（Tissue Chip FISH）、荧光原位杂交芯片技术（FISH Chip）及基于ROMA的荧光原位杂交（ROMA-FISH）等。
荧光原位杂交技术可以用于研究和检测多种特定的基因或序列，这些基因或序列可能具有调节多种生物过程的功能，如细胞分化、细胞扩增、细胞凋亡、表达特定基因、或影响基因组稳定性，如癌症和其他遗传性疾病等。
FISH技术主要用于检测和定位染色体位点、染色体重组、非特异性和特异性的序列变异，还可以用于诊断疾病、研究发育分化等生物学过程。
荧光原位杂交技术的基本原理是：荧光探针的核酸碱基特异性与目标序列中的碱基结合形成杂交结合物，然后荧光探针发出特定的荧光信号，从而识别和定位目标序列。
FISH技术可以用不同的荧光探针显示出各种不同的颜色，从而检测不同的特定序列。
由于它的高灵敏度和特异性，FISH技术在临床诊断、癌症研究、多基因组学研究和其他生物学研究中得到了广泛应用。
荧光原位杂交技术的具体实施方法包括：（1）设计荧光探针，将其碱基特异性的序列选择性地与目标序列结合；（2）改变荧光探针的位置，使其较为精确地和目标序列结合；（3）观察荧光探针和目标序列结合后所产生的特征荧光信号；（4）对荧光信号进行识别和定位，以及与荧光探针的结合强度等进行估计。
荧光原位杂交技术的应用已经扩展到更多领域，如Karyotyping、FACS Analysis、Flow Cytometry、Chromatin Immunoprecipitation （ChIP）、分子影像学（Molecular Imaging）和系统生物学（Systems Biology）等，它们都是用于研究疾病，以及有助于对疾病的诊断和治疗提供依据的技术。
【高中生物】荧光原位杂交(FISH)技术详解
【高中生物】荧光原位杂交(FISH)技术详解荧光原位杂交方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。
1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。
20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。
1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。
20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。
原理FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。
它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。
将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
实验流程FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→(染色体显带)→荧光显微镜检测→结果分析。
特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。
用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。
缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。
采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。
FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点。
六大优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用_理论说明
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用理论说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ Hybridization，简称FISH）是一种广泛应用于生物学研究的重要技术。
它通过在细胞或组织水平上定位和检测特定DNA或RNA序列的分布情况，可以提供关于基因组结构、功能和表达的有价值信息。
该技术最早于20世纪80年代被开发出来，并且经过不断改进与扩展，如今已成为分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
1.2 文章结构本文将首先介绍荧光原位杂交技术的基本原理，包括DNA探针的选择与设计、杂交反应条件的优化以及检测与可视化方法。
然后，我们将深入探讨荧光原位杂交技术在生物医学研究领域、植物遗传研究领域和动物进化研究领域的应用实例。
接下来，我们将评述荧光原位杂交技术的优势与局限性，包括其高灵敏度、高分辨率等优势以及对样本处理要求高、无法确定基因功能等局限性。
最后，我们将给出结论并展望荧光原位杂交技术的未来发展方向。
1.3 目的本文的目的是系统地介绍荧光原位杂交技术的基本原理和应用领域，以帮助读者深入了解这一重要技术。
通过阅读本文，读者将能够全面了解荧光原位杂交技术在生物学研究中的作用和意义，并对该技术的优势与局限性有所了解。
此外，本文也将探讨该技术未来可能的发展方向，为读者提供展望与思考。
2. 荧光原位杂交技术基本原理:2.1 DNA探针的选择与设计:荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用DNA或RNA分子作为探针，通过特异性互补配对识别和定位目标序列的方法。
在进行FISH实验时，首先需要选择合适的DNA探针。
DNA探针通常由由人工合成的寡聚核苷酸（oligonucleotide）或从天然来源提取得到的全长DNA片段构建而成。
选择DNA探针时，需要考虑以下因素：首先是目标序列的特异性，即该序列在待检测样品中是否具有较高的丰度，并且只存在于感兴趣的目标区域中。
其次是探针长度和两个主要互补区域之间核苷酸序列的碱基组成比例。
荧光原位杂交-更新
荧光原位杂交-更新荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种基于DNA分子杂交技术，可以用于研究细胞核内DNA序列的空间分布，基因表达与功能等问题的一种重要方法。
相比于传统的DNA杂交方法，荧光原位杂交具有高灵敏度、高特异度、高分辨率、无需PCR扩增等优点，被广泛应用于在形态学及遗传水平对真核生物的相关研究。
本文将介绍荧光原位杂交的原理、方法和应用。
一、原理荧光原位杂交的原理是利用标记有荧光染料（如荧光素、rhodamine等）的DNA探针与待检测样品（常为细胞核、染色体、tissue或者section等）中的目标DNA特异性结合，形成稳定的探针-靶DNA杂交物，通过检测荧光发射信号的方法来确定目标DNA序列的位置和数量。
探针的设计是荧光原位杂交成功的关键，因为它们必须具有真确的互补性，绑定到目标DNA的特定区域上。
如何选择探针的特异性，通常取决于所要研究的问题，例如检测某一基因的副本数，探测非编码RNA，或发现肿瘤细胞中的染色体异常等。
二、方法1. 获取样品荧光原位杂交技术所需的样品通常以细胞核或组织切片的形式存在，依据所要研究的问题，通过相应方法处理，如：细胞核的分离、组织的固定剂的处理、剪切不同的组织块、制备Paraffin等经典样品处理方法。
2. 样品前处理对于切片和细胞各种杂质如化学物质、染料、蛋白质等的影响，靠的是样本的处理方法。
主要有以下几种：1) 催化游离的核酸：这一步的主要目的是去除待测样品中的核酸，包括double-stranded 的DNA和single-stranded的RNA。
当使用非常规杂交试剂或非常规探针（如bacterial artificial chromosome、cosmid probe）时，可能需要使用一些高效的去掉毛糙杂质的试剂。
2) 前处理（预处理）：固定、脱水、变性、去除RNA、去除单链DNA（ssDNA）、吉姆萨染色、荧光染色、脱色剂去除等多项操作。
荧光原位杂交技术在生物学研究中的应用
荧光原位杂交技术在生物学研究中的应用在生物学研究中，荧光原位杂交技术是一种常见的分子生物学方法。
通过荧光标记探针，该技术可以在细胞、组织、器官、甚至整个生物体上可视化特定的DNA、RNA序列。
这使得生物学家可以研究细胞内基因表达和基因组组织，这对研究生物学和人类健康问题非常重要。
一、荧光原位杂交技术的概述荧光原位杂交技术利用生物分子之间的互补性进行研究。
DNA和RNA是生命体系中最为重要的分子之一，它们内在的互补性使它们能够识别彼此。
在荧光原位杂交技术中，荧光标记的核酸探针与需要研究的特定序列互补杂交。
这使得荧光探针可以准确地在细胞或组织中可视化。
这种荧光信号可以通过显微镜观察。
二、荧光原位杂交技术的种类荧光原位杂交技术有两种主要的类型:核酸杂交和免疫荧光染色。
1. 核酸杂交核酸杂交是在无细胞和细胞水平上进行的。
在细胞水平上，荧光原位杂交技术通常用于识别和定位细胞中的mRNA分子。
通过将可靠的延伸探针标记附着到mRNA序列上来实现它。
可靠的延伸探针是通过逆转录、克隆和序列分析来获得的，它们是荧光标记的短DNA序列或RNA分子。
在无细胞级别上，荧光原位杂交技术可用于检测细胞和组织中特定的DNA序列。
这是通过采用荧光标记的探针来实现的，这些探针可以杂交到要检测的DNA序列上并显示出荧光标记的颜色。
2. 免疫荧光染色免疫荧光染色是另一种荧光原位杂交技术。
这种方法利用荧光标记抗体来识别和定位特定的蛋白质分子。
准确的荧光探针可以准确地将抗体与依靠特定抗原结构的细胞或组织相结合，显示出特定的荧光标记。
这种方法能够用于检测特定受体、细胞结构或定点蛋白质位置。
三、荧光原位杂交技术的应用本节将介绍荧光原位杂交在生物学研究中的一些应用。
1. 基因表达和调控荧光原位杂交技术是了解该基因在细胞中表达的位置、发展和分化状态所必需的，无论是在发育过程中还是在成人身体中。
例如，基因1在胚胎发育中的表达模式可以通过荧光原位杂交技术来确定，并验证其在造血干细胞、软骨和骨中的表达模式。
荧光原位杂交1
原理：荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。
它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。
将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞．间期细胞可以是冰冻切片，也可以是细胞滴片或印片。
生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），dinitrophenyl(DNP)，aminoacetyl fluorine(AAF)等均可用于探针标记。
前两者较为常用，通常采用切口平移法（Nick translation）或随机引物法(Random Primer)对探针标记。
在已知探针DNA结构及序列情况下也可采用PCR或RNA逆转录法标探针。
通常用于Biotin 标记的探针应大于1000bp以下的探针，不易标记成功。
对PCR技术来标记。
近年来，Vysis 公司成功的生产些大片段的DNA探针（100-400kb）。
由于控针较长故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化，而且杂交信号更强。
如探针是具有重复序列的DNA或粘粒、YAC探针，在杂交液中加上用超声断碎的人体胎盘组织DNA或Cot DNA,以阴断探针和染色质之间非特异性的结合。
荧光信号在高压汞灯产生的短波激发光下常引起荧光信号淬灭的发生，可将DAPI或PI稀释于P-phenlenediomine的甘油缓冲液中。
任何荧光显微镜均可用于观察FISH信号，但对单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。
如采用双色或多色滤光片可以同时观察FITC、Texas-Red等多种颜色的FISH信号，不论是染色体还是单拷贝基因的FISH信号均可用高度敏感和高分辨率的彩色胶片摄取，也可通过CCD(charge coupled device)的照相系统或Laser Scanning Confocal Imaging System（激光扫描共焦成像系统）将摄取的信号储存在计算机内，经软件处理后，将信事情显示在荧光屏上。
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荧光原位杂交（FISH）综述
摘要
本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。
关键词：荧光原位杂交;
1.发展
荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。
荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。
1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。
2.原理
通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。
由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。
原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。
所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。
只有这样染色体DNA才能与探针杂交。
变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展
早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。
灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。
如果使用低辐射能的放射性标记物，如
3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。
20世纪80年代后期，非放射性DNA荧光标记技术的发展解决了上述问题，这些标记将高灵敏度与高分辨率结合起来，适用于原位杂交。
现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，因此有可能将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每种杂交信号，从而测定出各探针序列的相对位置。
为了得到最高的灵敏度，探针的标记需要尽可能大一些。
在过去这就意味着探针必须是相当长的DNA分子，通常是至少40kb的克隆片段。
现在已发展出将较短的DNA分子进行标记的技术，对长度的要求已不那么重要。
构建物理学图谱时，克隆的DNA片段可被简单地看作另一种类型的标记物，但在实际应用，由于克隆的DNA片段确定了DNA序列，将其作为标记应用则具有另一层含义。
因此，克隆间位置关系的确定提供了基因组图谱与其DNA序列间的直接联系。
如果探针是长的DNA片段，至少对于高等真核生物，就可能产生这样一个问题：探针中可能含有一些重复的DNA序列，因此探针可能与染色体上多个位点杂交，探针在使用前要与来自被研究组织的未标记DNA混合。
这种DNA可以是总的核DNA（即代表了全基因组），但如果使用富集重复序列的片段更好。
加入未标记DNA的目的在于与探针中的重复序列结合并将其封闭，使随后的原位杂交完全由单一序列驱动（Lichter et al.，1990）。
这样非特异性杂交即可被减少或完全消除[1]。
4.荧光染料
常用的荧光染料的DAPI(在UV 光激发下发出蓝色荧光)、FITC和荧光素(蓝光
下发出绿色荧光)以及罗丹明和德克萨斯红(绿光激发下产生红色荧光)。
由于FISH 的信号空间分辨率高。
不同的DNA 探针可以用不同的半抗原标。
再用不
同的荧光染料进行同时检测(复色FIAH, Multico lor FISH, Mc-FISH ) 。
而常用的荧
光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素（TET）、六氯-6-甲基荧光素（HEX）、四甲基异硫氰酸盐罗丹明（TRITC）、吲哚
二羧氰（Cy3,Cy5）等，这些荧光素具有不同的激发和吸收波长。
需要选择两种以上的探针同时杂交时，要对几种探针分别标记不同的荧光素[3]。
5.实验过程
5.1 核酸探针的设计和标记
根据来源和性质将核算分子探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针以及人工合成的寡核苷酸探针等。
其中人工合成的寡核苷酸探针具有特异性强、容易获得、杂交迅速等优点，故被广泛采用。
寡核苷酸探针是根据已知靶序列设计的，一般应遵循如下设计原则：1)探针长度一般为10-50 bp，越短则特异性越弱，太长则延长杂交时间；2) （G十C）百分比应在40 %-60线，否则减弱特异性；3)探针内部不要有互补序列，以免形成“发夹”结构；4)避免同一碱基连续重复出现；5)与非靶序列区域同源性<70%。
设计或选定的寡核苷酸探针可以用DNA合成仪合成，然后用荧光素进行标记。
5.2杂交样品的制备
对收集的样品进行固定和预处理（变性），使细胞形态基本不变，并且强细胞壁的通透性，保证探针顺利进人细胞与DNA或RNA杂交。
主要过程是将组织玻片在变性液内加热浸泡，然后乙醇梯度脱水（依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各3分钟进行梯度脱水，自然干燥），46℃烤片2-5分钟，使组织内细胞染色体变性解开双链。
5.3探针变性
FISH探针需要经过高温变性才能与变性后的染色体杂交并显现荧光，这是由于高温解链后的DNA探针才具备结合相应染色体的特性。
探针混合物充分变性，双链完全解开，对于FISH实验的成功非常重要。
5.4探针复性
探针变性后还需要复性，是指在低于变性温度但高于常温的环境中使解链的DNA双链稳定的反应过程。
复性是关系FISH实验成败的重要步骤，不完全
复性或过度复性均可能会导致变性无效从而使探针失去作用。
*所有设计到探针的操作步骤均需要避光操作。
*关于探针的变性和复性的温度及时间，应该更具探针的长度及性质选取，我查阅的不同文章选用的温度时间都不太相同。
一般探针变性温度73±1℃5分钟，复性45-50℃杂交前取出。
5.5 探针于样本的杂交
将变性后的探针混合物滴于玻片杂交区，立即加盖玻片，避免气泡，橡胶封边。
玻片置于预热湿盒内，42℃保温箱过夜杂交。
5.6 玻片洗涤
室温下将50%甲酞胺/2 X SSC溶液倒入三个分别标记为”1"、”2”、"3”的考普林瓶中。
使用前将盛有溶液的考普林瓶置于46±1℃水浴箱中至少30分钟，使溶液达到所需温度。
分别将50ml 2 X SSC溶液和2 X SSC /0. 1 %NP-40洗液倒入考普林瓶中，使用前将盛有溶液的考普林瓶置于46±1℃水浴箱中至少30分钟，使溶液达到所需温度。
*具体溶液配方我查到的许多文章上都有配方，以及一些实验细节，此处就未一一列出。
5.7观察
暗处自然干燥；DAPI需要加复染液，置于荧光显微镜下观察摄像，保留结果。
6.认知
随着标记技术和信号检测设备的不断改进及相关的细胞遗传学和分子生物学技术的发展，FISH技术得到迅速的发展。
FISH技术逐渐形成了从单色到多色、从中期染色体到粗线期染色体再向DNA纤维的发展趋势，灵敏度和分辨率正在由mb向kb、百分距离向碱基对、多拷贝向单拷贝、大片段向小片段再向BAC/YAC等方向不断提高。
FISH技术与PCR ,Southern blotting ,RFLP ,AFLP等生物技术相结合，产生了新的技术和方法，我认为也会在今后的各项科研领域展现其优越的性能。
参考文献
[1] 维基百科，/wiki/%E8%8D%A7%E5%85%89%E5%8E%9F% E4%BD%8D%E6%9D%82%E4%BA%A4
[2] 王继华，杨茹冰，李晶.荧光原位杂交在微生物学中的应用及进展. 哈尔滨
师范大学自然科学学报. Vol22, No.5,2006
[3] 夏铁骑.荧光原位杂交技术及其在微生物生态学中的应用.新乡学院报（自然
科学版）.第26卷第2期2009年4月
[4] 丁小波. 荧光原位杂交技术检测膀胱肿瘤组织中染色体的表达及意义.安徽
医科大学第一附属医院泌尿科.硕士研究生论文
[5] 江长琴. 荧光原位杂交技术在膀胱肿瘤诊断中的应用. 安徽医科大学第一附
属医院泌尿科.硕士研究生论文
[6] 陈敏丰. 荧光原位杂交技术在尿路上皮癌及前列腺癌的临床研究.中南大学
湘雅医院.博士学位论文
[7] 丁香园众多关于FISH的实验操作过程、试剂配方以及注意事项。