大鼠血管平滑肌细胞的培养

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GK大鼠主动脉平滑肌细胞培养及鉴定

严重并发症是限制其应用的重要原因。ＭＲＣＰ能比ＥＲＣＰ提供更具价值的三维图形，胆管阻塞的形态也能清晰显示，其定位准确，但是对于细微结构、狭窄病变等方面的鉴别比不上ＰＴＣ、ＥＲＣＰ。本次试验中，５种检测手段对于阻塞性黄疸的检出率、梗阻定位准确率无显著性差异，胆管癌的检出率：ＣＴ的检出率最低（４７．１％），ＥＲＣＰ的检出率最高（９４．７％）；胆管癌定位准确率：超声最低（７８．４％），ＭＲＣＰ最高（９４．７％），周围淋巴结转移检出情况：ＣＴ和超声最低（１４．３％），ＭＲＣＰ最高（４２．９％）。综上所述：各项影像学检测方法各有优势和局限，应用时综合各因素、结合使用，可提高检ｍ率。
摄片。
例行ＰＴＣ，１９例行ＥＲＣＰ，２１例行ＭＲＣＰ。详细记录肝总管、肝内胆管、胆总管、胆囊、胰管等情况，以病理和手术诊断结果为依据，判断上述５种影像学检测手段的检出率和准确率情况。１．２．１超声彩色多普勒诊断仪：ＰｈｉｌｉｐｓＩＵ２２，线阵探头，探头频率３．５～５ＭＨｚ，患者空腹８ｈ以上，取仰卧位、侧卧位、坐位进行常规扫查，必要时加压扫查或采用饮水法。１．２．２ＣＴ西门子双排螺旋ＣＴ，患者空腹６～８ｈ，取仰卧位，检查前饮用大量清水，先做层厚和间隔均为１０ａｒｍ的常规平扫，对于病变部位可加做３ａｍ的薄层扫描。ｒ１．２．３ｃ取仰卧位，患者双手抬起抱头，确认穿刺靶点，局麻后，于右腋中线第８或第９肋间隙水平进针，针尖进至１２胸椎上脊柱右侧４ｃｍ处，回抽胆汁退针，推注３０ｍｌ２５％胆影葡胺，定位

原代培养

原代培养：清洁级180-220g SD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜2~3遍，然后将血管切成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3~4小时后翻转，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置3天(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2天换液。

一般4~7天左右平滑肌细胞从组织块中爬出，2~3周出现致密细胞层。

待细胞快融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-8代细胞做实验。

细胞传代：将原代细胞培养瓶中的培养液吸出, 加D-Hanks液到瓶中清洗细胞表面2次。

弃掉清洗液，加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml, 将消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间为2~4 min。

这时在倒置显微镜下观察, 可见细胞成片皱缩变圆，细胞边缘折光增强。

在细胞未脱落前倒去消化液，立即加入血清或含血清的培养基以终止消化。

然后用滴管将细胞从培养瓶壁上轻轻反复吹打下来。

然后根据细胞密度, 以1: 2~4分瓶培养。

每2~3天换液, 待细胞生长到接近融合时(一般为7~10天)再传代。

hpsusan2006 wrote:我们培养血管平滑肌采用的也是组织块法，尝试想用消化酶消化老养不成，但组织块法从组织块爬出细胞挺费时间，要好几个礼拜，一旦细胞传代后速度就快了，方法和上面说的差不多（北国木棉）但是我们胰酶浓度用的0.2％的，可供大家参考，还用双抗液用的浓度100U/ml。

下面是一张组织块周围爬出的细胞。

我现在的方法是组织块法，效果还是理想的。

就我的经验而言，一般5－7天细胞就可以从组织中爬出来了。

但是那些一开始取材时就游离出来的细胞倒是最快长成集落（一般3到4天）。

有几点我个人的经验：1.取材要熟练，尽量缩短时间，如果可以把从取材到铺瓶的时间缩短到15分钟以内，那么最终的成功率会比较高。

时间拖得越长，最终的细胞长出来的时间越是慢甚至最后会失败。

大鼠肺动脉平滑肌细胞原代培养及低氧对缺氧诱导因子-1α的影响

然后分离出肺动脉段，离肺动脉中膜层，分用组织块贴壁法培养，倒置相差显微镜观察细胞形态、普通免疫组织化学法（Ｐ法）Ｓ进行细胞鉴定。随后，将体外培养的大鼠ＰＳｓ设计常氧组、ＡＭＣ，低氧组Ｈ２Ｈ６Ｈ１，，，２Ｈ２，４用Ｗｅｅｌｔｇｓｒｂｏｉ法检测ＨＩ一１【ｔｎｔｎＦ的蛋白表达。结果用组织贴块法成功培养大鼠ＰＳｓ得到生０ＡＭＣ，长稳定、纯度高的ＰＳｓ且培养与纯化可以同时进行，ＡＭＣ，可获得稳定传代的细胞；Ｆ蛋白在常氧组有ＨＩ一１【ｃ少量表达，在低氧条件下，其表达明显增加。结论成功建立体外大鼠肺动脉平滑肌细胞原代培养模型；低氧条件下促进其中ＨＩ一１【Ｆ的表达；０这提示ＨＩ一１【白的表达可能是肿瘤细胞适应缺氧环境的重要原因。Ｆ蛋０关键词：平滑肌细胞；大鼠；肿瘤；缺氧诱导因子一１【０
ＨｐｘｄｃｌＦｃｒ１（Ｉ－ ∞：ｅｎｉｎｅｒｇａｅｕｄｒｙｏｉＭｅｈｄＴｅｕｇｙｏｉＩｕｉｅａｔ－ａＦ１ＡＮｗＡｔａｅｒｕｒｔｎｅｈｐｘ．ｔｏｈａｎｂｏＨｅＤＴｇａｌｎ
ｐｍａｙｃｌｕｅｄｔｒｖｄｅｅｔｔｔｒｌｒｌｔｓａｃ．ｙｃｒｎｕｌ，ｂｅｖｅｅｐｅｓｎｏｉｒｒｕｔｒ，ｐｉｅｈｓｓｍａｉｅａｄｒｅｒｈｓｎｈｏｏｓｏｓｒｅｈｒｓｉｆｌｎａｏｏｔｅｅａｓｅｅｙｔｘｏ
ｏＳｒｔｓｏｅｏｃｅｔｄｒａｅｔｏｄｔｏ．ｌｎｒｒｒｓｉｏａｅｄｐｌｎｒｔｆＤａｓＷａｇｔｎｆｍｈｓｅｐｃｃｎｉｎＰｕｍｏａｙａｔｙｗａｓｌｔｄａｕｍｏａｙａ－ｒｎｕｓｉｉｅｎｔｒｉｓｅＷａｐａｔｄｗｉｔｅａｈｒｎｍｅｏｆｔｓｅｅｌｎｓｒｅｃｌｌｒｍｏｐｏｏｙａｄｔｅｒｔｐｃｌｅｙｔｕｓｌｎｅｓｈｔｈｄｅｔｔｄｏｉｕｘａｔ．ｅｌａｅｈｓｐｎ１ｕｒｈｌｇｎｈｉｙｉａ

2种酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞生长特性的比较

2种酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞生长特性的比较王关嵩;钱桂生;杨晓静;陈维中
【期刊名称】《第三军医大学学报》
【年(卷),期】1999(21)10
【摘要】目的：应用单纯胶原酶法、复合胶原酶法培养大鼠血管平滑肌细胞，比较其生长特性。

方法：采用改良Lowry法测定了蛋白质含量，依照荧光指示剂法测定了细胞内[Ca2+］。

结果：2种方法其生长曲线类似，均于7～8d至高峰，其蛋白质含量略有差异，也是在7～8d达最大，钙含量分别为
（202．60±15．18）nmol／L和（153．20±11．34）nmol／L。

结论：单纯胶原酶法相对经济，复合胶原酶法能更好地保护细胞，可根据具体情况选用。

【总页数】3页(P765-767)
【关键词】血管平滑肌细胞;细胞培养;酶消化法
【作者】王关嵩;钱桂生;杨晓静;陈维中
【作者单位】第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R543;R329－33
【相关文献】
1.酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞 [J], 王明勇;陈枫;陈庄
2.比较单独消化法及分步消化法培养新生大鼠原代软骨细胞的生物学特性 [J], 邓林峡;余慕雪;潘思年;郭楚怡;丘小汕;曹志毓
3.比较单独消化法及分步消化法培养新生大鼠原代软骨细胞的生物学特性 [J], 邓林峡;余慕雪;潘思年;郭楚怡;丘小汕;曹志毓;;;;;;
4.酶消化法分离培养大鼠血管平滑肌细胞方法的改良 [J], 李宪伟;姜维良
5.Ⅱ型胶原酶/弹性蛋白酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞 [J], 涂永生;黄红林;朱炳阳;廖端芳
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大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。

方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。

结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。

结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。

【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed bymodified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。

提取大鼠平滑肌细胞——小总结

1．大鼠PASMCs的提取和原代培养(1)提取：对雄性SD大鼠用5％的水合氯醛经腹腔麻醉后，浸泡在75％的乙醇中5 rain。

将麻醉后的大鼠在超净工作台中固定好，无菌操作下迅速分离出心肺组织，置于盛有含有1％青链霉素的PBS培养皿中。

转移至无菌操作台中，漂洗心肺组织数次，眼科镊仔细剥离出肺动脉(包括肺动脉主干和左右肺动脉干)。

将已分离出的肺动脉用含1％青链霉素的HBSS冲洗数次，直至液体清亮为止，以尽量减少血细胞等的混入。

眼科剪纵向剪开肺动脉，内膜面朝上，用刀片来回轻刮2～3遍，去除内膜。

再将外膜面翻转过来，同样方法刮去外膜。

将中膜转移至盛有含20％胎牛血清的DMEM／F12的培养基中，用眼科剪反复剪成1 am×l mm×1 mm 的小组织块。

用滴管将小组织块转移至25T的培养瓶中，均匀的摆放与于瓶底，间距约0．5 cm。

加入3 mL含20％胎牛血清的DMEM／F12培养液，瓶底朝上，静置于37 oC、5％CO，的细胞培养箱巾孵育4～5 h。

待小组织块干涸后，轻翻转培养瓶，让培养液慢慢浸润瓶底上的小组织块，继续静置于培养箱中培养。

(2)原代培养：3—5 d后，有少量细胞从组织块周围游离出来；8—10 d后细胞融合成片，成峰．谷状分布，用胰酶消化传代。

一般2—3 d更换培养液，提取PASMCs 时用含20％胎牛血清的DMEM／F12，培养时用含15％胎牛血清的DMEM／F12。

采用生长状态良好的3～5代细胞进行后续实验。

取材、细胞原代及传代培养SD 大鼠肌注氯胺酮（22 mg / kg）麻醉后，作下腹部横切口，切取双侧输精管。

剥去外膜组织，小圆刀片刮除内膜，4 C PBS缓冲液（含青霉素100 U/ mI、链霉素100#g / mI）反复漂洗4 ~ 6遍，然后剪碎成1 mm3 大小的组织块。

先用0.1%的"型胶原酶消化作用10 min，倒去上清液，再加0.2% 的胰蛋白酶和0.1%的"型胶原酶消化20 min，使游离成单个细胞，600 > ! 离心5 min，收集消化的细胞，接种至25 cm2 培养瓶，加含20%胎牛血清的DMEM 培养液，置37 C含5%CO2孵箱中培养。

大鼠肺动脉平滑肌细胞培养及对不同类型激动剂刺激产生的反应

［ａｉｆＡＭＣａｅｎｉｄｃｄｂｏｈｌｔｌＩｃｃｐａｏｉａｉａｄ１ｔｌＩ５ＨＴ．ＯＮＬＣ２ＳｓｎｂｅｕｅｙｂｔＯ＊・～ｙｌｉｎｃｃｎ０ｍｏ・一一］ｏＰｃｎｍｏｏｚｄ＊ＣＣＵ．
摘要：目的分离和培养ｓＤ大鼠肺动脉平滑肌细胞（ＡＭＣ）并检测其功能状态。方法显微分离肺内小动脉，ＰＳｃ，并在含胶原酶（７０Ｕ・１５
ｍＬ１一）和木瓜蛋白酶（．ｍＬ的低钙ＨＢＳ溶液中酶解和培养ＰＭＣ，９５ｕ・）ＳＡＳｓ采用动态细胞荧光成像技术检测ＰＳｓ胞浆游离ｃ２ＡＭＣａ浓度
（Ｃ２］的变化。结果在１～２ｈ内可获得ＰＳｓ并可观察到环匹阿尼酸和５Ｈ［ａｉ）８４ＡＭＣ，－Ｔ可引起ＰＳｓＣ２ｉＡＭＣ［ａ的升高效应。结论大鼠］
ＰＭＣ一步酶消化法，法简便实用。分离的ＰＭＣＡＳｓ方所ＡＳｓ细胞形态和功能正常，用于动态细胞荧光成像技术检测实验及ＰＭＣ信号转导适ＡＳｓ
功能的研究。
关键词：肺动脉平滑肌细胞；细胞培养；胞浆游离Ｃ浓度ａ
中图分类号：９９文献标识码：文章编号：０６３６【０８．１．０００Ｒ６Ａ１０．７５２０）２０２ —３０
Ｄｅｔｃｉｎｆｉｔａｅｌｌｒｃｌｉｍｃｎｅｔａｉｎｏｐｌｏａｒａｔｙｅｔｏｏｎｒｃａａｃｕｌｕｏｃｎｒｔｎｕｍｎｙｒｅｒｏ

酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞

Ｔｅｅｐｅｓｏｆａ－ＭＡｓｄｃｅｙｉｈｘｒｓｉｎｏＳｗａｅｔｄｂｍｍｕｏｙｏｈｍｉｔ．ｓｌｓｍｍｕｏｉｃｅｓｒｅｅｌｄｔａｈｕｔｆｎｃｔｃｅｓｒＲｅｕｔ：ＩｙｎｈｓｈｍｉｔｒｖａｅｈｔｔｅｐｒｙｏｙｉＶＳＣｘｅｄｄ９％．Ｃｏｃｕｉｎ：ＶＳＣｓｃｎｂａｎｄｅｓｌｙｅｚｍｅｄｇｓｉｎｉｉｏＴｈｓｍｅｈｄｃｎｓｐｌＭｓｅｃｅｅ５ｎｌｓｏＭａｅｇｉｅａｉｂｎｙｉｅｔｎｖｔ．ｉｙｏｒｔｏａｕｐｙｌｒｅｍｏｎｓｏＭＣｓｆｒｓｉｎｉｃｒｓａｃｎｘｅｍｅｔｔｎ．ａｇｓａｕｔｆＶＳｃｅｔｅｅｒｈａｄｅｐｒｏｉｆｉｎａｉｏ
Ｃｉａｈｎ）
【ｂｔｃＯｊｃｉ：ｏｎｅｔａｅｍｔｏｆｕｕｇｄＳｒｇｅＤｗｅＳ）ａｖｓｕａｓｏｔｃｌ（ＳｓＡｓａｔｂｅｔｅＴｖｓｇｔｔｅｄｏｃｌｒａｅｐａｕ— ａｌｒ】ｖｉｉｅｈｈｔｅｙ（ｒｔａｃｌｏｅｓＶＭＣ）Ｄｒｍｈｌ
原代平滑肌细胞。方法：菌取老龄Ｓ无Ｄ大鼠主动脉，．％ Ⅱ型胶原酶消化分离细胞，用自然纯化、速贴壁纯化０２采差
平滑肌细胞，免疫组化鉴定平滑肌细胞肌动蛋白。结果：疫组化染色显示细胞纯度在９％以上。论：消化法免５结酶

大鼠腹主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

ｔｅｅｓｒｔａｅｃｎｒｓｃｏｃｐｎｉ．ｓｔ９ｏｈｍｉｔｙｗｉｈｐｈｓｏｔａｔｍｉｒｓｏｅａｄＳＰｋｔＲｅｕｌｓ０％ｉｃｌｔｄｔｓｕｉｃｓｓｒｉｅ．ｎｏｕａｅｉｓｅｐｅｅｕｖｖｄＴｈｅｃｔｅｅｈｗｅｈｕｌｄｅＵｓｓｏｄｔｅｕｒ
【ｙｗｒｓａｄｍｎｏｔ，ｏｔｍｓｌｃｌｃｌｃｌｒ，ｅｌｄｎｆａｏＫｅｏｄ】ｂｏｉａｒｓｏｈｕｃｅ，ｅｕｕｅｃｌｉｅｔｃｔｎｌａｃｌｍｏｕｃｅｓｖｓｕａｓｏｔｍｓｌｃｌ，ｒｈｅｌＶＭＣ）Ｓｓ的增殖是动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等诸多心脑血管疾病的核心病理变化。体外血管平滑肌细胞的培养和细胞株的建立是研究其生物学行为与特性，以及相关疾病发病机制及其防治手段的基础，于揭示其机制具有重要的指导作用。对因此成熟掌握ＶＭＣ培养技术，Ｓｓ以及培养纯度高、结构和功能良好的ＶＭＣ具有重要意义 ¨ 。Ｓｓ
２ＣｌｇｆＢｓｃＳｉｎｅ。ｉｚｏｄｃｌＵｉｅｓｔｏｌｅｏａｉｃｅｃｓＢｎｈｕＭｅｉａｎｖｒｉｅｙ
【ｓａｔＯｊｃｉｅＡｓｐｅｎｃｎｍｃｌａｂｉａｄｍｎｌｏｔｖｓｕａｏｔｍｓｌｃｌＶＭＣ）ｗｓｎｅｔＡｂｔｃ】ｂｅｔｉｌａｄｅｏｏｉｙｔｏｔｎｂｏｉｒａｃｌｓｏｕｃｅｓ（Ｓｓａｖｓ— ｒｖｍａｗｏａａａａｒｍｈｅｌｉｉ

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定-最新年精选文档

[1] 。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础，在高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成，外膜层由要收缩调节机体的血流和血压，其功能障碍在心血管疾病中起着非常重要的作用，因此，对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。

在VSMC 勺研究中，组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。

本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ）进行免疫细胞化学鉴定。

1 材料与方法成纤维细胞组成，中膜层由血管平滑肌细胞组成，平滑肌细胞主1.1 材料。

动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。

DM EMS 糖培养基（美国 Gibco 公司）， Hepes 索莱宝），优质胎牛血清（原代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。

转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。

放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。

【2017年整理】平滑肌细胞原代培养、传代、冻存方法及所需试剂

01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1细胞培养1.1.1培养液配制DMEM(美国Corning Cellgro公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,上海普飞澳洲胎牛血清)。

1.1.2培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。

1.1.3大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。

动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。

每次取材2~3只大鼠。

贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。

纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。

用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。

滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。

并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。

盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。

待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。

加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。

大鼠主动脉平滑肌细胞的体外培养和观察

ｉｍｍｅｇｄｉａｅ．ｅｌａｅｃｌｖｔｄｆｒ４ｏｒｔｏｔｍｏｅｎｎｔａｃｎｉｏｆ５ｒｅＩｂｓｓＣｉｕｔａｅ８ｈｕｓｗｉｕｖｍｅｔｉｈｏｄｔｎｏ％Ｃ０ｔ３ ℃ ．ｓｒｉｏｈｉ２ａ７
ＴｏａｉｏｔｆＷｉｔｒｒｔｉｂｔｉｅｂｓｎｐｃａｌｄｒｃｅｏｋ，ｔｅａｒａｉｖｒｔｒｅｔｅｈｒｃｃａｒｏｓａｓｏａｎｄ，ｙｕｉｇａｓｅｉｌｍａｅｃｏｈｔｈｏａａｙｈｏｔｓｏｅｕｄ，ｎｎｈｌｇｔｄｔｅｔｎｓｔｅｖｃｌｎｏｅｉｌｃｌｅｗｉｅｆｗｉ１ｃｌａｅｎｙｏ５ｍｉｕｔｓ．ｉａｅｈｗｏｅｄ．ａｕａｅｄｔｌｅｌａｐｄｏｈｓｒｈａｓｒｈｔ０．％ｏｌｇｎＩｅｚｍｅｆｒ１ｎｅｈｏｔＳｄｖｄｄｉｔｏｉｔｐｒｔｔｉｖｎｕｌｙｐｖｄｏｏｔｏｕｔｔｓｔＤＭＥＭＴｅａｒａｉｉｉｅｎｏｓｍｅｌｔｌａｔｈａＳｅｅｔａｌａｅｎｔｅｂｔｍｆｃｌｉａｉｎｆａｋｗｉｅｓｈｏｖｏｌｈ
维普资讯
２４０
第３６卷第３９ｊｊ２Ｏ０２年６月
哈尔滨医科大学学报
ＪＵＲＯＮＡＬＯＦＨＡＲＢＩＭＥＤＣＡＮＩＥＲＳＮ１ＬＵＶｎＹ
Ｖｏ．６．１３Ｎｏ．３Ｊｎ．２Ｏｕ，Ｏ２

大鼠阻力性肺动脉平滑肌细胞培养

性脑脊髓炎大鼠发病期穹窿下器室管膜细胞表面的巨噬细胞样细胞，Ｅ观察．００ＳＭ ×４０
大鼠阻力性肺动脉平滑肌细胞培养
姚小鹏王皓倪灿荣李强。刘忠令。
巴比妥麻醉后剖胸，０肝素右心室注入，５０ｕ整体摘出
心肺置于平皿中以无钙Ｈｎｓ液清洗两遍，ａｋ体视显微镜下自肺动脉主干逐级追人肺实质，３级以下分支取（直径＜３０舯１，钙Ｉｎｓ清洗２遍。加入含胶０）无－ｋ液ｈ原酵２ｒ／的无钙Ｈａｋ液３村，氧化碳孵箱ｇｍ［ａｔｒｓ＝３℃消化９ｎ广口巴斯德吸管轻轻吹打，下见细７０ｍｉ，镜胞分散成单个，ＢＦＳ清洗２遍。１３ｖ培养经消化的细胞加入含１％Ｈ０的ＲＭ６０养液（Ｐ１４培含青霉素１０ｌ，０Ｕ链霉素０１ｇｍ）ａｒ／］配戚１０ ×１细胞／ｌｒ浓度并以每孔１ｒｌａ接ａ种于６孔板第一排孔中，＂％二氧化碳孵箱中贴壁３Ｃ５Ｆ２５小时，．轻轻摇动培养板，清连同未贴壁细胞吸出上加入第二排孔中，原孔加入含１％Ｈ的ＲＭＬ１４０Ｐ６０培养液１ｒｌ置于二氧化碳孵箱内培养：每３天更换ａ，培养液一次。１４Ｒ蟠Ｍ传代第二排孔中细胞长满后均为梭形，吸去培养液，加入含００％胰酵（ｒｓ）００％５Ｔｉｉ和．２ｐｎＥＴＤＡ的Ｈａｋ液消化，ｎｓ５分钟后细胞游离呈圆形，加入含１％小牛血清的１４０６０培养液，１３的比例传以：代，每三天传代一次。１５ＰＳｓ．ＡＭＣ鉴定（免疫组化法）原代第二排孔细

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的：改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)的培养方法，了解其生长特性，为研究气道疾病提供体外研究模型。

方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树，去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后，采用改良组织贴块法培养ASMCS，应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。

结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d，细胞开始从组织块周围长出，5～8 d在组织块附近出现“谷-峰”结构，9～12 d可融合。

传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。

结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点，为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。

【关键词】气道;平滑肌;细胞培养;组织贴块法;大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)是气道的重要结构细胞之一，具有重要的生理作用。

ASMCS的异常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键[1]。

Hirst等[2]认为应将平滑肌细胞作为研究哮喘的标靶。

体外培养ASMCS是研究细胞生物学行为、疾病发病机制及其防治手段的基础。

本研究采用改良组织贴块法培养出ASMCS，报告如下。

1 材料和方法1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠购自上海实验动物中心，体重250～350 g。

饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。

1.2 主要仪器和试剂倒置显微镜(NIKON TS100 日本尼康公司);5% CO2培养箱(美国Thermo);25 mL无菌培养瓶(美国Corning公司);RPMI 1640培养基(美国HyClone公司);优级胎牛血清(杭州四季青公司);0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液(美国GIBCO公司);青链霉素(北京索来宝生物科技有限公司);D-Hanks液(上海捷瑞生物有限公司);I型胶原酶(美国Sigma公司);SMα-actin单克隆抗体(美国Sigma公司);小鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

肌细胞纯度达９％以上。８镜下可见培养细胞呈典型的“ 峰一谷” 生长，状免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。
结论组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞操作简单、结果稳定、纯度较高、存活率高。
关键词：平滑肌细பைடு நூலகம் ；织块贴壁法；组原代培养中图分类号：４１Ｃ．＿３￣２文献标识码：Ｂ文章编号：６ｌ１４（００）３－９ — ２１７一２６２１０－０７００
清均购自ＨＣｏｅ司。小鼠抗大鼠Ｓａｔ单克隆抗体、ｙｌｎ公Ｍ— ｃｎｉ即
滑肌细胞生长、增殖有关的疾病发病机理及药物作用机制的研
究，动脉粥样硬化、如经皮腔内血管成形术（ＴＡ）ＰＣ术后再狭窄、药物的钙通道开放（拮抗）作用、血管损伤引起钙稳态失衡
在病原生物学实验中接触到的大多是致病菌或条件5开展与生活和人体健康相关的实验致病菌有感染人体的危险故要求学生在实验过程中除按规在课外时间引导学生做一些病原生物学与生活和人体健范严格操作外还要在实验前后用消毒液洗手实验室内不乱康相关的实验增强学生对实验的兴趣
组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定
用型ＳＢＡＣ免疫组化染色试剂盒、ＡＤＢ显色试剂盒均购自武汉
博士德生物工程有限公司（中国）。青霉素钠、硫酸链霉素（华北
制药厂）２，４孔板，０ｍｘ０１ｍｌｍｍ盖玻片，５ｍ塑料培养瓶２ｃ２
等。本研究在参照国内外经验ＩＩ１的基础上，建立了一种简便、易
我校注重学生技能的培养，在病原生物学考核中，大了加

大鼠血管平滑肌细胞的贴块法培养

培养基购自ＧＢＯ公司；新生牛血清（号：链霉素１０￣／Ｌ的ＤＭ培养液，转湿润瓶ＩＣ批０ｇｍＭＥ翻
００１）自６５３购杭州四季青生物公司；青霉素钠（批
号：０１１０６、霉素（号：５４８购自华北Ａ５２２０）链批０００）
１．主要仪器．２１超净工作台（ＩＥＨ）Ｃ温培养箱ＡＲＴＣ，Ｏ恒
１．传代培养．２２待原代培养的细胞从组织块长出，数量增加
（ＵＣＩＮＬＮ）１１ＰＮＴＯＩＥ，型干燥箱，ＭＪ５０型至细胞长满瓶壁或占瓶壁６％～８％时，０ＴＱ．４２００即可进
维层和外膜。更换培养皿，眼科剪沿纵行剖开，用内膜面向上，眼科弯剪自上而下轻刮２３，用～遍以去除内皮细胞。然后再换培养皿，１ＤＭ，加滴ＭＥ反复剪切成１ｍ。块（切１ｉｍ小剪０ｍｎ左右）。每只大鼠血管组织块可接种３个２Ｌ培养瓶，瓶内５ｍ加入３ｍＬ含２０％新生牛血清、青霉素１０ＵｌＬ０／、ｍ
ｔｐｎｂｕ（ｒａｌｅ台盼蓝）ＳＳ十二烷基磺酸钠）于ｅ、Ｄ（购兰州鹏程生物公司；Ｂ（酸盐缓冲液）ＰＳ磷由实验室配制。培养瓶，令瓶底向下，培养液慢慢覆盖于瓶底上让的组织小块，置培养箱中静置培养，换１培３ｄ次养 ” 。
底，然后瓶底向上，用尖吸管从培养皿粘吸出小组

大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定

大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【摘要】目的：建立一种可行的原代血管平滑肌细胞（VSMC）培养方法。

方法：严格无菌操作环境下取大鼠胸主动脉及腹主动脉中层组织，通过组织块贴壁法进行原代培养，胰酶消化法进行传代，应用倒置相差显微镜对不同培养时间的细胞进行形态学观察，使用免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。

结果：原代培养第4~6天时，组织块周围开始有长梭形细胞爬出；第7~9天时，细胞爬出较少的呈网状生长，组织块周围细胞爬出较多的呈漩涡状生长，致密排列呈束状；第10~14天时，细胞呈典型的“峰—谷”样结构，相互融合达80%，此时传代细胞生长速度增快，细胞变大，折光性减弱，免疫荧光染色鉴定可见VSMC特异性的α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）表达，表达的阳性细胞在95%以上。

结论：成功建立一种可行的原代VSMC培养方法。

%Objective:To establish a convenient and efficient method for culturing primary generation of aortic vascular smooth muscle cells( VSMC)of rat. Methods:The aorta was isolated from SD rats under strict sterile conditions. The primary culture and subculture were obtained by tissue-piece inocu-lation and trypsin respectively. The cellular morphology was observed with inverted phase contrast mi-croscope and identified by immunofluorescence. Results:The VSMC grew out on days 4~6 and showed fusiform;On days 7~9,some cells grew to form mesh,and more cells grew in whorled pattern and form compact sarciniform;On days 10~14,cells appeared typical ″peak-valley″ structure,and became nearly 80% integrated. At this time,passage cells grew faster,and cells becamelarger,and their refractivity weakened. The typical α-Smooth muscleactin(α-SM-actin)in SMCS could be found by immunofluorescent staining,and the positive rate of α-SM-actin in SMCS was more than 95%. Conclusion:A reliable and feasible culture method for primary generationof VSMC has been estab-lished successfully.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2017(042)002【总页数】5页(P125-129)【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;组织块贴壁法;免疫荧光;大鼠,Sprague-Dawley【作者】刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【作者单位】贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002; 贵州省人民医院心内科，贵州贵阳 550002;贵州医科大学，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R363.1目前，心血管疾病已成为我国城乡居民总死亡原因之首，这类疾病发病的病理生理基础为血管损伤及损伤后的修复不良，主要有冠心病和高血压，但其发病机制至今仍不清楚[1]。

改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养

ＰＧＢ培养，获得纯度高、ＤＦ— 可活性好的血管平滑肌细胞，缩短了培养周期。并关键词血管平滑肌细胞细胞培养
ＩｒｖｍｅｔｆａａｃｌｒＳｏｈＭｕｃｌｒｍａｙＣｌｒＤｉｇＨｏｇｅ，Ｈｕｎｈｎｃａ，Ｌｉｎｎ，Ｃｅｉｏｏｇ，ｍｐｏｅｎｔＶｓｕａｍｏｔｓｌＣｅｓｉＰｉｒｕｔｅｏＲｅｌｎｕｎｎｆｉａｇＳｅｇｈｏｉａｗｅＪｈｎＸａｄｎＣｅｏｉｇ，ＷｕＰｎ．ｆｌｔｄＨｏｐｔｌｆＧａｇｏｇＭｅｉｌＣｌｇ，Ｇａｇｏｇ５４０ｈｎＢａｙｎｉｇＡｉｅｓｉｕｎｄｎｄｃｏｌｅｕｎｄｎ２０１，ＣｉａｉｆａａｏａｅｈｎＡｂｔａｔ０ｂｅｔｅＴｘｌｒｒｆｃｅｔａｉｐｉｒｕｔｒｆａａｃｌｒｓｏｈｍｕｃｅｃｌ（ＭＣ）ｓｒｃｊｃｉｏｅｐｏｅａｍｏｅｅｆｉｎｙＯｌｒｙｃｌｅｏｔｓｕａｍｏｔｓｌｅｌＶＳｓ．Ｍｅｈｄｖｉｗｍａｕｒｖｓｔｏｓ
医研杂２１月学究志０年１第４卷第１１Ｏ期
・论
善・
改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养
丁洪飞黄胜超李建文陈小东陈宝英吴平
摘要目的探讨提高大鼠血管平滑肌细胞原代培养效率的方法。方法采取组织块贴壁法进行原代培养，糖ＤＥ高ＭＭ

QKI对血管平滑肌细胞增殖的抑制功能

QKI对血管平滑肌细胞增殖的抑制功能贺锋伟;郑强荪;卢兹凡【摘要】观察QKI蛋白对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响,进一步完善血管平滑肌细胞增殖的相关机制.以大鼠的原代主动脉平滑肌细胞为研究对象,观察分别过表达QKI5、QKI6对血清促增殖作用的影响.细胞增殖采用MTT法和Western blot测定.结果血清可促进大鼠的原代主动脉平滑肌细胞增殖,过表达QKI可抑制血清刺激的血管平滑肌细胞的增殖.说明过表达QKI对血清刺激的血管平滑肌细胞增殖具有抑制作用,该作用有可能在一定程度上能够抑制高血压等病伴发的血管平滑肌增殖.%To investgate the effects of QKI on the proliferation of vascular smooth muscle cells ( VSMCs) and to improve the mechanisms of VSMCs proliferating, in primary rat aortic smooth muscle cells for the study, observed that overexpression of QKI5, QKI6 effects of VSMCs proliferation that is induced by serum. Serum can advance primary rat aortic smooth muscle cells proliferating and QKI overexpression can inhibit VSMCs proliferation induced by serum. It is conclused that QKI overexpression can inhibit the proliferation of VSMCs that is induced by serum and may inhibit VSMCs proliferation of hypertention to some extent.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2012(012)003【总页数】3页(P497-499)【关键词】过表达QKI;血清;血管平滑肌细胞;增殖【作者】贺锋伟;郑强荪;卢兹凡【作者单位】第四军医大学,西安7100038;第四军医大学,西安7100038;第四军医大学,西安7100038【正文语种】中文【中图分类】R541.3目前心血管疾病已经成为危害人们健康的一类严重性疾病，血管平滑肌细胞异常增殖在各种心血管疾病中普遍存在，尤其是冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压病、支架植入后再狭窄等病的基本病理变化，抑制VSMC增殖是心血管疾病防治的一个重要靶点［1］。

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定

ａａｙｃｌｇｏｔｎｉｌｇｃｌｃａａｔｒｓｉｓａｄｔｒｖｄｅｔｍａｅｉｌｆｒｔｅｒｓａｃｆｔｅｐｏｉｒｔｎｏｈａｃｌｉｅｓｓｎ￣ｅｌｒｗｈａｄｂｏｏｉａｈｒｃｅｔｎｏｐｏｉｅｔｓｔｒａｏｈｅｅｒｈｏｒｌｅａｉｆｔｅｖｓｕａｄｓａｅ．ｌｉｃｈｆｏｒ
ＱＵＺｂｎ，ＵＨａ．ＤｐｒｅｔｆＣｒｉｈｒｃｕｇｒ，哪ｔｇＦｒｏｉｌｆｌｔｌ —ｉｇＸｕｎｅａｔｎｏａｄｔｏａｉＳｒｅＮｎｉｔｓｔｆｉｅｔＮｍｏｃｙｓＨｐａＡａｄｏｉ
【关键词】大鼠；血管平滑肌细胞；原代培养；组织贴块法
ＰｒｍａｒｕｌｕｒｎｄｄｅｉｃｉｎｆｒｈｏａｉｒａａｃｌｒｓｏｏｈｕｓｌｅｌＤＵＡＮｉｙｃｔｅａｌｎｔｆａｔｏｏａｔｔｒｃｃａｏｔｖｓｕａｍｉｔｍｃｅｃｌｓＣｈａｃＨＥＮｏＸ
培养的血管平滑肌细胞呈典型的 “ 峰状 ” 长，疫组化染色显示胞浆内 “平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论谷生免正确地利用组织贴块法可以简单、济、效地培养出血管平滑肌细胞，经高为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。
ＭｅｈｄＴｅｃｌｕｅｏａｈｒｃｃａｒａｖｃｌｒｓｏｈｍｕｌｅｌｓｄｎｙｔｓｅｐｅｅｉｏｕａｉｎ１１ｕｔｒｄｃｌｒｂｔｏｓｈｕｔｒｆｒｔｔｏａｉｏｔａｕａｍｏｔｃｅｃｌｗａｏｅｂｉｕ — ｉｃｎｃｌｔ．１ｅｃｌｅｅｌｗｅｏ．ｓｓｓｏｕｓｅ