分离纯化(1)
微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定和保藏实验方案设计 (1)
• 平板划线操作:
6、左手 将皿盖打 开一条缝 隙,右手 将沾有菌 种的接种 5、将试 环迅速伸 管口通过 火焰,并 入平板内, 塞上棉塞; 划三至五 条平行线, 盖上皿盖。 注意不要 划破培养 基。
7、灼烧接 种环,待 其冷却后, 从第一区 域划线的 末端开始 往第二区 域内划线。 重复以上 操作,在 三区域内 划线。注 意不要将 最后一区 域的划线 与第一区 相连。
?211平板涂布法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法
微生物菌群的分离纯化、培 养、鉴定及保藏
——食品1201班 第六组 陈帆、刘旸、 荣跃、龙开友
箱中37℃培养24小时
• 4.2.6 菌种保藏
• 4.2.6.1 斜面低温保藏法: 此法为最常用的一种。一般霉菌;放线菌和有芽孢 的细菌可保存2~4个月,酵母菌可保存2个月,无芽 孢的细菌最好每周移接一次。操作过程如下: a 接种:将要保藏的菌种接入斜面培养基上,试管 上贴好标签,写上菌种名称,时间。 b 培养:各类菌按其所需温度和时间进行培养。 c 保藏:选取生长健壮的菌种,于其试管带棉塞的 上半部用灭菌的塑料包扎好,以防棉塞受潮感染杂菌。 置于4℃冰箱中保藏。
实验方案内容
1、
分离纯化技术名词解释
分离纯化技术名词解释
分离纯化技术是指利用不同的物理或化学原理,将混合物中的目标成分分离出来,并纯化使其达到所需的质量标准的技术。以下是一些常见的分离纯化技术及其名词解释:
1. 蒸馏:蒸馏是一种常用的分离纯化技术,用于将混合物中的水分子和其他小分子分离出来。在蒸馏过程中,混合物被加热并蒸发,使水分子随着蒸发的气体一起逃逸,而其他分子则留在原混合物中。
2. 分选:分选是一种用于混合物分离的技术,它可以分离出不同的成分,例如通过过滤、离心、化学氧化等方式将混合物中的不同物质分离出来。
3. 萃取:萃取是一种将混合物中的目标成分从其他成分中分离出来的技术。在萃取过程中,一种溶剂被引入混合物中,将目标成分溶解在溶剂中,然后分离出溶剂,从而实现目标成分的纯化。
4. 离子交换:离子交换是一种利用离子交换树脂将不同离子交换到树脂分子中的技术。通过离子交换,可以纯化混合物中的某些成分,例如将金属离子交换到树脂分子中,将目标成分纯化出来。
5. 电化学:电化学是一种利用电场和化学反应将混合物中的目标成分分离出来的技术。在电化学过程中,可以通过施加电场将混合物中的离子分离出来,或者通过利用化学反应将目标成分转化为可纯化的组分。
这些技术可以单独使用,也可以组合使用,以纯化各种不同的物质。在分离纯化过程中,选择合适的技术取决于混合物的性质和目标成分的纯化要求。
蛋白质的分离纯化方法一
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对 极性,离子化基团数量越多,溶解度越大。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
扩散:由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散的热 力学驱动力是熵的增加。 扩散系数 D:等于当浓度梯度为一个单位时,在一秒钟 内通过1cm2面积所扩散的溶质量。 扩散系数随Mr的增加而降低,但对Mr的变化不敏感。对 球形的大分子来说,扩散系数与Mr的立方根成反比。
楚雄师范学院化学与生命科学系
沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降 的速度不同,彼此分开形成区带。再进行光学定位,针刺或冰 冻切片采样分析。
蔗糖密度梯度
聚蔗糖密度梯度
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
3.凝胶过滤
交联葡聚糖(Sephadex);聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P );琼脂糖凝胶(Sepharose,Bio-Gel A)
洗脱: 低盐高pH
非离子型去污剂(triton x-100) 脂肪醇(丁醇、乙二醇)
(五)利用对配体的特异生物学亲和力的纯 化方法
配基: 酶的底物、辅酶、抑制剂、 效应物及其结构类似物, 激素与受体蛋白,抗原与 抗体,生物素与亲和素 (抗亲和素蛋白),凝集 素。 免疫亲和层析 凝集素亲和层析 金属螯和层析 染料配体层析
蛋白质的分离纯化(1)
的介电常数。
4.改变温度分离蛋白质
➢0~40oC之间:大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加,
而降低。
例外:0~25oC,人的血红蛋白溶解度随温度上升
➢40~50oC以上,大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。
一般蛋白质的分级分离操作一般都在0~4oC温度下进行。
特种多缓冲液 混和蛋白质样品
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
依
特
种
PH 降低
多 缓 冲
交
换
剂
次 收 集 不 同 的 蛋 白 组
分
收集
收集
6.离子交换层析(P310)
填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。
支持介质:
对蛋白质交换容量大
阳离子交换剂
阴离子交换剂
CM—纤维素(弱酸型) P------纤维素(中强酸型) SE---- 纤维素(强酸型) SP-----Sephadex(强酸型)
蛋白质的理化性质及分离纯化
第一节 蛋白质的理化性质 第二节 蛋白质的分离纯化 第三节 蛋白质的分子量测定 第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定
第一节 蛋白质的理化性质
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的紫外吸收性质 三、蛋白质的胶体性质和沉淀 四、蛋白质的变性和复性 五、蛋白质的呈色反应
分离纯化原理
分离纯化原理
分离纯化是指将混合物中的不同组分通过不同的物理或化学方法进行分离和纯化的过程。下面将介绍几个常见的分离纯化原理。
1. 蒸馏:利用混合物中组分的沸点差异,将液体混合物加热至其中一个成分汽化,然后将其冷凝收集,从而实现分离纯化。蒸馏广泛应用于分离液态混合物,例如分离酒精与水的混合物。
2. 结晶:利用混合物中组分的溶解度差异,在适当的溶剂中溶解混合物,然后通过调节温度或加入沉淀剂等方式使其中一种成分结晶出来,最后通过过滤或离心等方法分离纯化。结晶常用于固态混合物的分离,例如分离盐和水的混合物。
3. 萃取:基于组分在两相(通常为两种不相溶的溶剂)之间的分配系数差异,通过将混合物与适当的溶剂进行接触,使其中一种或多种组分在两相间相互传递,从而实现分离纯化。萃取广泛应用于分离有机物及某些无机物。
4. 色谱:利用混合物中组分在固定的固相或液相材料上的不同分配系数,通过在固定相上的流动相的携带下,使各组分按照其亲和性的差异进行分离纯化。色谱常用于分离和纯化有机物。
5. 电泳:基于混合物中组分的电荷差异,通过在电场的作用下,使得具有不同电荷的组分在电解质溶液或凝胶中按照其电荷性质的差异进行分离纯化。电泳常用于生物分子的分离和纯化。
以上所述仅是一些常见的分离纯化原理,实际应用中还存在很多其他的分离纯化方法,如吸附、膜分离、磁分离等。不同的混合物和要求的纯化效果可能需要选择不同的方法来实现分离和纯化。
分离纯化技术
A区(1/10)
烧接种环
B区(1/5)
D区 烧接种环
烧接种环 C区
③划其余区:将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却 一下,并使B区转至划 线位置,把接种环通过A区(菌源区
) 而移至B区,随即在B区轻巧地划上6~7条致密 的平行线, 接着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线,并使 D区的线条与A 区平行(但不能与A区或B区的线条接触!)
知识点:分离纯化技术
王军鹏 济源市疾病预防控制中心
2020年3月30日
细菌分离、接种技术和培养法
一、原理:
自然界微生物是以混杂的状态存在的,分离和纯化 的目的是从各种样品来源混杂的微生物群体中获得纯种 微生物,既在一定的培养条件下培养、繁殖得到只有一 种微生物的培养物,也称为纯培养物。分离纯化微生物 的方法有很多种,但基本原理相似。
5、单细胞(单孢子)挑取法,
等。
6、利用选择培养基进行分离
二、方法分类:
1、大多数好氧且数量大的微生物可采用稀释倒平板法 和平板划线分离法进行分离;
2、热敏菌和严格好氧菌可采用涂布平板法;严格厌氧 菌采用稀释滚管法;
3、对于比较大而个体数少的单细胞和单孢子,可采用 单细胞(单孢子)挑取法;
4、对于那些生长慢、营养要求或生长条件特殊的微生 物,则需利用选择培养基结合其他方法进行分离。
5.注意事项
分离纯化方法
(离心过滤、离心分离、离心沉降)
第三节 纯化方法
一、分离纯化依据
❖根据分子形状和大小不同进行分离 ❖根据分子电离性的差异进行分离 ❖根据分子极性大小及溶解度不同进行分
离 ❖根据物质吸附性质的不同进行分离 ❖根据配体特异性进行分离
1.溶剂:对目的物具有最大溶解度 2.温度 3.pH:避免在目的物的等电点附近 4.盐浓度:保护及助溶作用 5.物料比、提取时间、提取次数
四、活性物质的保护措施
1.采用缓冲系统 2.添加保护剂 3.抑制水解酶作用 4.其他保护措施:避免紫外光、强烈搅拌、过
酸、过碱或高温、高频震荡、防止氧化
五、提取液的分离
•玻璃纸 •火绵纸 • 其他改型纤维素材料
半透膜袋
蛋白质溶液 透析液 磁棒
磁力搅拌器
•主要用于分离相对分子质量差别较大的物质(103)
超过滤(ultrafiltration)
利用压力、抽滤(A)或离 心力(B)等多种形式,强行使 水和其它小分子溶质通过半透 膜,而蛋白质被截留在膜上, 以达到浓缩和脱盐目的。
错 了 , 于 是 你停下 将疑问 的部分 又重新 演奏了 一遍, 面对评 委们不 耐烦的 目光, 你有勇敢
选择有效成分含量高的材料 来源丰富易得 工艺简单易行 成本低,效益好
分离技术与纯化方法
分离技术与纯化方法
分离技术与纯化方法是化学、生物、环境等领域中常用的方法,用于分离和提纯混合物中的不同组分。本文将介绍几种主要的分离技术和纯化方法,包括过滤、蒸馏、结晶、萃取和色谱等。
1. 过滤
过滤是一种常见的物质分离技术,它基于溶液中固体颗粒的大小和形态差异来实现分离。常用的过滤方法包括简单过滤和真空过滤。简单过滤通过过滤纸或滤膜筛除颗粒,真空过滤则利用负压将溶液通过过滤纸或滤膜。
2. 蒸馏
蒸馏是一种利用液体成分的不同沸点来进行分离的方法。在蒸馏过程中,混合物被加热至使之汽化,然后通过冷凝的方式将不同沸点的组分重新凝结为纯净液体。蒸馏可以分为常压蒸馏和减压蒸馏,常用于提纯液体和分离液体与固体的研究。
3. 结晶
结晶是一种利用溶液中溶质的溶解度差异来分离纯净物质的方法。通过逐渐降低溶解度环境,使溶质从溶液中析出形成固体颗粒,即结晶体。结晶方法包括慢降温结晶、溶剂蒸发结晶和溶剂结晶等。
4. 萃取
萃取是一种利用溶剂的亲和性差异将混合物中的目标成分提取出来的方法。常用的萃取方法包括液液萃取、固相萃取和腔内萃取等。液液萃取是将溶剂与混合物充分接触,使目标成分以溶液的形式从混合物中转移到溶剂中。
5. 色谱
色谱是一种利用物质在定相和流动相中的分配系数差异来分离混合物的方法。常用的色谱方法包括层析色谱、气相色谱和高效液相色谱等。色谱技术广泛应用于分子化学、有机化学和药物分析等领域。
以上是几种常见的分离技术和纯化方法,每种方法都有其独特的适用范围和操作步骤。根据需要选择合适的方法可以提高实验效率和纯化程度。在实际应用中,常常需要结合多种分离技术和纯化方法来达到理想的分离效果。随着科学技术的不断发展,分离技术和纯化方法也在不断创新和完善,为各个领域的科研和生产提供了更多的选择和可能性。
分离纯化选择题1
一.单选题
1盐析操作中,硫酸铵在什么样的情况下不能使用(B)
A、性条件
B、碱性条件
C、中性条件D和溶液酸碱度无关和溶液酸碱度有关
2盐析法沉淀蛋白质的原理是(B)
A、降低蛋白质溶液的介电常数
B、中和电荷,破坏水膜C与蛋白质结合成不溶性蛋白D、调节蛋白质溶液素性不同
3在盐析实际应用过程中,最常用的无机盐为(C)
A、硫酸镁
B、硫酸钠
C、硫酸铵
D、醋酸铵
E、碳酸氢钠
4在相同的离子强度下,不同种类的盐对蛋白质盐析的效果不同,一般离子半径(A)效果好。
A、小且带电荷较多的阴离子B.大且带电荷较多的阳离子C.小且带电荷较多的阳离子D.大且带电荷较多阳离子
5.结晶过程中,溶质过饱和度大小(A)
A、不仅会影响晶核的形成速度,而且会影响晶体的长大速度
B、只会影响晶核的形成速度,但不会影响晶体的长大速度C不会影响核的形成速度,但会影响晶体的长大速度
D、不会影响晶核的形成速度,而且不会影响晶体的长大速度
E、以上均不是
6有机溶剂沉淀法中可使用的有机溶剂为(D)
A、乙酸乙酯
B、正丁醇
C、苯
D、丙酮
E、甲醛
7有机溶剂为什么能够沉淀蛋白质(B )
A、介电常数大
B、介电常数小
C、中和电荷蛋反E、改变溶液pH
8若两性物质结合了较多阳离,则等电点pH会(A)
A、升高
B、降低C 不变D、以上均有可能E以上均不是
9在什么情况下得到粗大而有规则的晶体(A)
A、体生长速度大大超过核生成速度B晶体生长速度大大低于过晶核生成速度C、晶体生长速度等于晶核生成速度D、在稀溶液中E.以上都不是
10在重结晶溶剂的选择原则中,不正确的是(A)
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化
摘要:90年代以来基因重组技术得到很大的发展,基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%~80%,因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用,旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词:重组蛋白质;分离;纯化;沉淀;液液萃取;层析;包涵体
随着基因重组技术的发展,出现了很多基因工程产品,而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%~80%[1]。由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步,也是比较困难的一步,它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统,因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白,而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质,通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。但是重组蛋白有几种不同的表达形式,如细胞外的分泌表达;细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在,因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同,采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似,重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异,即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法,层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中,必须维持一定的浓度和生物活性形式,以及防止被降解。因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法,并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
分离纯化的工艺流程
分离纯化的工艺流程
分离纯化(Separation and Purification)是一种常见的化学工艺,用于分离混合物的组分并纯化所需物质。这种工艺广泛应用于化工、制药、食品等行业,在不同的工业领域有着各自特定的分离纯化工艺流程。
分离纯化工艺流程通常包括以下几个关键步骤:预处理、分离、纯化和收集。下面以制药工业中的分离纯化工艺为例,介绍一下整个过程。
首先是预处理阶段。在这个阶段,需要对原始混合物进行预处理,以去除其中的杂质和不需要的组分。这通常包括筛选、过滤、沉淀、酸碱中和等步骤。比如,在制药工业中,药物的原料中可能含有一些不溶于水的杂质,这时可以通过过滤或沉淀的方法去除。
接下来是分离阶段。在这个阶段,需要将混合物中的不同组分分离出来。常见的分离方法包括蒸馏、萃取、结晶、离心等。选择何种分离方法取决于混合物的性质和所需组分的特性。以制药工业为例,如果需要从混合物中提取溶于有机溶剂的药物成分,可以通过萃取方法实现。
然后是纯化阶段。在这个阶段,已经分离出的组分需要进一步纯化,以满足所需的纯度要求。常见的纯化方法包括结晶、溶剂沉淀、柱层析等。以制药工业为例,如果所需药物成分存在结晶性质,可以通过结晶和再结晶的过程来纯化。
最后是收集阶段。在这个阶段,纯化后的组分需要进行收集和储存。收集的方式通常根据实际需要选择,可以是固体收集、液体收集或气体收集等。在制药工业中,纯化后的药物成分可以通过水洗、干燥等步骤进行收集。
需要注意的是,分离纯化的工艺流程并不是一成不变的,它根据不同的混合物、所需组分以及工业领域的不同而有所差异。因此,在应用分离纯化工艺之前,需要对混合物的性质和所需组分的特性进行分析和评估,以确定最适合的工艺流程。
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解
层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成:一是固定相,它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分;另一是流动相,即可以流动的物质,如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒(流动相)通过固定相时,由于各组份的理化性质存在差异,与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同,在两相中的分配(含量对比)不同,而且随溶媒向前移动,各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份,随流动相移动时受到的阻滞作用小,向前移动的速度快。反之,与固定相相互作用越强的组份,向前移动速度越慢。分部收集流出液,可得到样品中所含的各单一组份,从而达到将各组份分离的目的。按层析原理可将层析分为以下9种:
1、亲和层析
利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力,从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂,当含混合组分的样品通过此固定相时,只有和固定相分子有特异亲和力的物质,才能被固定相吸附结合,性无关组分随流动相流出。改变流动相组分,可将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质,与基质共价连接的化合物称配基。具有专一亲和力的生物分子对主要有:抗原与抗体,DNA与互补DNA或RNA,酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理
特点:亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点,在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯,实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
分离纯化的基本步骤
蛋白质分离纯化的基本步骤
蛋白质分离纯化分为四个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎(二)蛋白质的抽提(三)蛋白质粗制品的获得(四)样品的进一步分离纯化。蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
(一)材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有:1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3.反复冻融法生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。
(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法:1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。
分离纯化
DNA的洗涤
70% -75%的乙醇洗涤
甲酰胺解聚法:
➢ 破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白 质与DNA的结合,再透析获得DNA。高浓度 甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物,可以 使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤
主要试剂的作用:
EDTA:1 二价金属螯合剂,抑制DNase 的活性
2 降低细胞膜的稳定性
SDS的作用:
1 溶解细胞膜、核膜 2 乳化脂质、膜蛋白及胞内蛋白,并
将组蛋白和非组蛋白从DNA分子上 拉开,释放DNA 3 变性DNase
无DNase的RNase
高效水解RNA而避免DNA的消化。
蛋白酶K
1. 紫外分光光度法:
原理:紫外吸收特性 换算关系:
1.000A260 = 50g/ml双链DNA 1.000A260 = 40g/ml单链RNA 1.000A260 = 33g/ml单链DNA 灵敏度:0.25g/ml
2. 荧光光度法:
原理:荧光染料溴化乙锭(ethidium bromide EB)嵌入碱基平面,本身无荧光的核酸在紫外 光的激发下产生橙红色荧光,且荧光的强度的 积分与溶液中核酸的含量成正比。
碱裂解法
在 强 碱 ( pH12.0 ~ 12.6 ) 条 件 下 , 用SDS破坏细胞壁和裂解细胞,并使细胞 的 蛋 白 质 与 DNA 发 生 变 性 , 释 放 出 质 粒 DNA。
1.1.3 分离与纯化技术基本原理.pptx
溶解度、 结晶 挥发性 蒸馏
氨基酸、有机酸、抗生素、蛋白质 乙醇、香精
等电点沉淀 蛋白质、氨基酸
有机溶剂沉淀 蛋白质、核酸
第2课时(1)-第1章节 生物分离纯化基本原理
原理 分离纯化技术
产物举例
电泳
蛋白质、核酸、氨基酸
带电 离子交换色谱 氨基酸、有机酸、抗生素、蛋白质、核酸
性 等电点沉淀 蛋白质、氨基酸
电渗析
氨基酸、有机酸、盐、水
化学 离子交换色谱 氨基酸、有机酸、抗生素、蛋白质、核酸
性质 亲和色谱
蛋白质、核酸
生物 亲和色谱 功能 疏水色谱 特性
蛋白质、核酸 蛋白质、核酸
感谢聆听
Thanks for listening
第2课时(1)-第1章节 生物分离纯化基本原理
原理 分离纯化技术
产物举例
离心
菌体、细胞碎片、蛋白质
分子大 小、形 状
超滤 微滤 透析
蛋白质、多醣、抗生素 菌体、细胞 尿素、盐、蛋白质
电渗析
氨基酸、有机酸、盐、水
凝胶色谱
盐、分子大小不同的蛋白质
萃取
氨基酸、有机酸、抗生素、蛋白质、香料
盐析
蛋白质、核酸
药物分离纯化技术课程
第2课时(1)-第1章节
1.1 分离与纯化技术基本知识
1.1.3 分离与纯化技术基本原理
课件十二酶的提纯和分离纯化的方法(一).
沉淀分离
优点:硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小, 不影响酶的活性,分离效果好,而且价廉易得。
盐 析 沉 淀
缺点:硫酸铵进行盐析时,缓冲能力较差,而且铵 离子的存在会干扰蛋白质的测定,所以有时也用 其它中性盐进行盐析。 盐浓度的表示:硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。
加入饱和硫酸铵的体积 饱和度 = 溶液的总体积
过 滤 分 离
粗滤
微滤 超滤 反渗 透
0.2~2μ m 20Å~0.2μ m < 20Å
工作任务(二)酶的分离纯化方法
过滤与膜分离
定义:借助于一定孔径的高分子薄膜,将不同大小、 不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离
的技术称为膜分离技术。
膜 分 离
薄膜类型:主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢 以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时 也可以采用动物膜等。 薄膜的作用:选择性地让小于其孔径的物质颗粒或 分子通过,而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔 径有多种规格可供使用时选择。
常速离心机又称为低速离心机, 最大转速在8000 r/min以内,相对离心力(RCF) 在1×104 g 以下,在酶的分离纯化过程中,主要 用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。 也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
工作任务(二)酶的分离纯化方法
离心分离
高速离心机
最大转速为(1~2.5)×104 r/min ,相对离
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1.生物药物:是利用生物体、生物组织或其成分,综合应用生物化学、微生物免疫学、和药
学等的原理与方法制造的一大类用于预防、治疗、诊断的制品。
2.生物制品:主要指菌苗、毒素、应变原与血液制品等。
3.合成与部分合成生物药物:以天然药物为分子母体,经化学或生物学方法修饰改造合成
的生物药物。
4.基因药物:以基因物质(RNA或DNA及其衍生物)作为治疗的药物基础,包括基因治
疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。
5.反义药物:以人工合成的十至几十个反义寡核苷酸序列与模板DNA或mRNA互补形成
稳定的双键结构,抑制靶基因的转录和mRNA的翻译,从而起到抗肿瘤和抗病毒的作用。
6.疫苗:使用病毒或立克次氏体,接种于动物、鸡胚或组织培养后,加以处理制成,可分
为弱毒疫苗和死毒疫苗。
7.类毒素:使用细菌产生的外毒素加入甲醛处理后,使之变为无毒性但仍旧有免疫原性的
制剂。
8.细胞破碎:采用一定的方法,在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜,设法使胞内产物最大
程度的释放到液相当中,破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后,再采用不同的分离手段进一步纯化。
9.过滤:在外力的作用下,悬浮液中的液体通过多孔介质的孔道而固体颗粒被截留下来,
从而实现固液分离的操作。
10.料液:在溶剂萃取中,被提取的溶液被称为料液。
溶质:在溶剂萃取中,欲提取的物质被称为溶质。
萃取剂:用以进行萃取的溶剂。
11.反萃取:将萃取液与反萃取剂(一般为水溶液)相接触,使某种被萃取的有机相溶质转
入水相的过程。
12.萃取液:含溶质的萃取剂溶液。
萃余液:被萃取出溶质以后的溶液。
13.双水相萃取:又称水溶液两相分配技术,它利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的
差异来进行萃取的方法。
14.临界胶束浓度(CMC):是胶束形成时所需表现活性剂的最低浓度。
15.正常胶束:将表面活性剂溶于水中,当其浓度超过临界胶束浓度时,表面活性剂就会在
水溶液中聚集在一起而形成聚集体,通常情况下,这种聚集体是水溶液中的胶束,被称为正常胶束。
16.反胶束:将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中,并使其浓度超过临界胶束浓度,便会
在有机溶剂内形成聚集体,这种聚集体被称为反胶束。
17.超临界流体:在临界温度和临界压力以上的流体,高于临界温度和临界压力而接近临界
点的状态。
18.超临界流体萃取技术:是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有(特
异增加物质溶解能力)来进行分离纯化的技术。
19.固相析出技术:通过加入某种试剂或改变溶液条件,使生化产物以固体形式(沉淀和结
晶)从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析出技术。
20.盐析法;是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异,通过向溶液中引入一定数量的
中性盐,使目的物或杂蛋白以沉淀析出,达到纯化目的的方法。
21.有机溶剂沉淀:向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂,降低溶质的溶解度,使其沉
淀析出的分离纯化方法。
22.凝胶层析:又称分子筛层析,是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相,由于各组分
流经体积的差异,使不同分子量的祖坟的一份力的层析方法。
23.类分离(组分离):将分子量极为悬殊的两类物质分开的方法。
24.分级分离:将分子量相差不大的大分子物质加一分离的方法。
25.离子交换法:利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作
方法。
26.有效粒径:指筛分树脂时,10%体积的树脂颗粒通过,而90%体积的树脂颗粒保留的筛
孔直径。
27.均一系数:指能通过60%体积(筛上体积40%)树脂的筛孔直径与能通过10%体积(筛
上体积90%)的树脂的筛孔直径之比。均一系数越接近1,表明树脂颗粒越均匀,在文献上常常见到用筛目数表示树脂粒度。
28.树脂再生:使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。
29.转型:树脂去除后,为了发挥其交换能力,按照使用要求人为地赋予平衡离子的过程。
30.毒化:指树脂失去交换性能后,不能用一般的再生手段重获交换能力的现象。
31.洗脱:离子交换完成后,将树脂所吸附的物质释放出来重新转入溶液的过程。
32.亲和纯化技术:利用生物分子间的特异性结合作用的原理,进行生物物质分离纯化的技
术。
33.亲和层析:利用生物体中多数大分子物质具有于某些相应的分子专一性可逆结合的特性
而建立的分离纯化技术。(利用生物大分子特异亲和力而设计的层析技术)
34.沉降作用:悬浮液静置时,在重力作用下,密度大于周围液体的固体颗粒逐渐下沉。
35.离心技术:利用旋转产生的离心力代替重力,加速固体沉降速度的一中分离法方式。
36.离心力:在一定角度速度下,做圆周运动的任何物体都受到的向外的力。
37.相对离心力:实际离心场转化为重力加速度的倍数。。
38.沉降速度:在离心作用下,物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。
39.沉降系数:在单位离心力场中,颗粒的沉降速度称为沉降系数,即通过单位离心力场所
需的时间。
40.角度转子:又名角度头或定角转子,离心管中心线与转轴呈14-40度角。常见角度:20、
28、34、40.
41.差分离心法(差速离心法):是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不
同进行离心分离的一项技术。
42.速度区带离心法:离心操作时,将样品液置于连续或不连续的密度梯度液上,控制离心
时间,是具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,从而达到彼此分离的目的。
43.等密度离心法:离心作用下,不同密度的多组分颗粒在梯度介质中向上或向下移动,当
移动至其密度与介质密度相等时的位置便不再移动,形成静止区带,即达到离心平衡,各组分按照密度不同处于区带的不同位置。
44.膜分离:借助于膜而实现各种分离过程。
45.透析:在常压下依靠小分子物质的扩散运动来完成。
46.超过滤:分子级膜分离手段,以压力差为推动力将不同分子量的物质进行选择性分离。
47.浓差极化现象:外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜,大分子被截留于膜表面,并
逐渐形成浓度梯度。
48.吸附法:利用吸附作用,将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上,利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异,使目的物和其他杂质分离,达到浓缩和提纯目的的方法。
简24.影响内扩散速度的因素
(1)离子浓度:离子浓度越高,内扩散速度越大
(2)温度升高一度,内扩散速度增加4--8%
(3)离子半径与电荷:阳离子每增加一个电荷,内扩散速度降低10倍,阴离子每增加一个电荷,内扩散速度降低7--8倍
(4)树脂颗粒越小,速度越快
(5)交联度:交联度增加,速度降低,交联度降低,内扩散速度增加
(6)交换容量:内扩散速度随其增加而降低
25. 影响外散速度的因素
(1)离子浓度:离子浓度越高,外扩散速度越大(2)温度升高一度,外扩散速度增加3--5% (3)搅拌速度越快,外扩散速度越快(4)树脂颗粒越小,外扩散速度越快
26.离子交换对树脂的基本要求:
(1)有尽可能大的交换容量(2)有良好的交换选择性(3)化学性质稳定
(4)化学动力学性能好(如反应速率问题)(5)物理性能好
27.载体活化方法:
①溴化氰活化法②高碘酸氧化法③环氧化法④甲苯磺酰氯法⑤双功能试剂法
28.离心机分类:
·普通离心机------小于6000r/min
·高速离心机------8000-25000rpm具有水冻和冷冻装置
·超速离心机------25000-80000rpm具有冷冻装置