如何阅读质粒图谱
☆如何阅读质粒图谱
如何阅读质粒图谱最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素#复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l＃P/E 启动子/增强子l＃Termsl 终止信号＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
表达载体的构建方法及步骤
For personal use only in study and research; not for commercial use表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
过表达载体的构建方法及步骤
过表达载体的构建⽅法及步骤⼀、载体的选择及如何阅读质粒图谱⽬前，载体主要有病毒和⾮病毒两⼤类,其中质粒 DNA 是⼀种新的⾮病毒转基因载体。
⼀个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。
原核⽣物 DNA 分⼦中只有⼀个复制起始点。
⽽真核⽣物 DNA 分⼦有多个复制起始位点。
（2）抗⽣素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因⽚段（4） P/E 启动⼦/增强⼦（5）Terms 终⽌信号（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作⽤选择载体主要依据构建的⽬的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的⽬的是要表达⼀个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建 DNA 重组体的⽬的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能⼒－据克隆⽚段⼤⼩（⼤选⼤，⼩选⼩）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动⼦及相应的受体菌，⽤于表达真核蛋⽩质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋⽩质或融合蛋⽩作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成⽅向因载体不同⽽异，适应⽬的基因与载体易于链接，不能产⽣阅读框架错位。
综上所述，选⽤质粒（最常⽤）做载体的5点要求：（1）选分⼦量⼩的质粒，即⼩载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌⾥⾯拷贝数也多（也有⼤载体）；（2）⼀般使⽤松弛型质粒在细菌⾥扩增不受约束，⼀般 10个以上的拷贝，⽽严谨型质粒<10个。
（3）必需具备⼀个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗⽣素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试⼀试）。
（5）满⾜⾃⼰的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加⼊荧光标记，是否需要加⼊标签蛋⽩，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
表达载体的构建方法及步骤
令狐采学创作表达载体的构建方法及步骤令狐采学一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：(1)复制起始位点(加即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
(2)抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,I<an+(3)多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段(4)P/E启动子/增强子(5)Terms终止信号(6)加poly (A)信号可以起到稳定mRNA作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：[1]构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：令狐采学创作令狐采学创作(1)克隆载体的克隆能力一据克隆片段大小(大选大，小选小)。
如＜n)kb选质粒。
(2)表达载体据受体细胞类型一原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
(3)对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位; 表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产主阅读框架错位。
综上所述，选用质粒(最常用)做载体的5点要求：(1)选分子量小的质粒，即小载体(l-1.5kb) 一不易损坏，在细菌里面拷贝数也多(也有大载体)；(2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般1()个以上的拷贝，而严谨型质粒＜1()个。
(3)必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；(4)必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr (试一试)。
(5)满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性(如Pur。
[定稿]如何选择质粒
![[定稿]如何选择质粒](https://img.taocdn.com/s3/m/c6c95d7a1fb91a37f111f18583d049649b660ef0.png)
一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
其作用与增强子所在的位置或方向无关。
即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
实验新人必读（七）：一文学会读懂和查找质粒图谱
实验新⼈必读（七）：⼀⽂学会读懂和查找质粒图谱作者：解螺旋.⼦⾮鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医⽣科研助⼿导语质粒图谱即为质粒DNA序列的物理图谱，包含了质粒⼤⼩、筛选标记、克隆位点、转录及翻译元件等信息。
尽管它为我们选择质粒、了解质粒特点及应⽤提供了重要依据，然⽽我们常常要为图谱中丰富信息所困扰。
那么，本⽂就为你拨云见⽇，让你快速掌握质粒图谱。
三步法看懂质粒图谱Step 1:先了解质粒的基本组成元素。
1）复制起始点Ori。
该位点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数，它是质粒中⼀段特定序列，富含AT和重复序列。
Tips：图谱上只有⼀个Ori，表⽰质粒是原核克隆表达质粒；有两个Ori，则表⽰该质粒是，穿梭质粒，即可在原核也可在真核中复制。
2）抗性筛选基因。
图谱中Kan/tet就是抗⽣素抗性基因，⽅便后续通过抗⽣素筛选阳性克隆。
特点就是单词最后会以⼤写R或上标r结束。
Tips：⼀般克隆载体只有⼀种抗性筛选标记，部分表达载体及穿梭质粒具有两种抗性筛选标记。
3）多克隆位点（MCS），即⼀系列限制性内切酶酶切位点，是外源DNA插⼊位点，⼀般可通过酶切/连接⽅式将外源DNA插⼊质粒，外源DNA⼀般⼩于10kb，⽽⽚段越长，转化效率越低。
Tips: ⼀般位于转录启动和转录终⽌信号之间；所包含的限制性内切酶位点数量和组成因载体不同会有所差异，且其中的酶切位点在质粒中为单⼀的酶切位点；同时在使⽤时需注意质粒载体与外源DNA酶切位点的兼容性问题4）荧光标记或蛋⽩标签序列。
蛋⽩纯化标签蛋⽩：His-Tag，GST-Tag等；蛋⽩检测标签蛋⽩：Myc-Tag，Flag-Tag，HA-Tag等；荧光蛋⽩表达标签：GFP，mCherry等。
Step 2:看质粒是否是表达载体，如果是，那就必定有这些原件：启动⼦－核糖体结合位点－克隆位点－转录终⽌信号。
1、启动⼦：促进DNA转录的DNA序列，可与RNApol特异性结合。
2、增强⼦/沉默⼦：前者是真核基因组中⼀种增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作⽤与增强⼦所在位置或⽅向⽆关。
质粒图谱怎么看
一、质粒（plasmid）：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
载体（Vector）：简单的来说就是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体，分为病毒类和非病毒类两种。
我们平时常说的载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而人工构建的，通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作，同时加入一些多用途的辅助序列。
二、如何阅读质粒图谱看懂一个质粒图谱我们需要关注以下几点：1）弄清楚质粒的方向看质粒图谱的时候我们会发现大多数质粒都会有顺时针和逆时针两个方向的箭头，箭头的方向：一个方向是复制起始位点的方向，即该质粒在细菌或真菌中DNA复制的一个方向，有时图谱中还会有f1 ori，这个代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA，但是可以用来测序。
另一个就是转录方向（一般是正向），主要是从启动子开始，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。
2）复制子复制子又称复制起始区，它控制着质粒DNA的复制，并决定了质粒的宿主和拷贝数。
复制子可分为严谨型复制子与松弛型复制子，分别对应低拷贝数的严紧型质粒和高拷贝数的松弛型质粒。
3）筛选标记：了解筛选标记类型（如抗生素抗性标记），方便后续确定筛选重组质粒载体。
常见抗菌素抗性标记有氨苄青霉素抗性（Amp）、卡那霉素抗性（Kan）、四环素抗性（Tet）、链霉素抗性（Str）、氯霉素（Cmr, 某些酵母表达质粒）、潮霉素（Hyg, 农杆菌里常用的）。
4）多克隆位点MCS区：既外源基因的插入位点。
具有多个限制酶酶切位点，外源性的DNA一般可通过酶切/连接的方式插入质粒。
）其他元件，如表达系统元件和蛋白标签等常见的启动子有：CMV、EF1（常规表达，一般启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），CAMV35S、Ubi（植物表达常用），T7（常用原核系统表达启动子）。
如何阅读质粒图谱
如何阅读质粒图谱？●第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。
复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子通常有多个复制起始位点。
ColE1ori只需要1个。
慢病毒、逆转录病毒属于RNA病毒，只有1个复制起点。
腺病毒也只有1个复制起点。
举例：●第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记：原核筛选标记：Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
Camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
Kanr：氨基糖苷磷酸转移酶，卡那霉素失活。
真核筛选标记：Puro：puro筛选Neo：G418筛选hygr：使潮霉素β失活原核和真核都可以的筛选标记：Zeocin可选择Sh ble基因表达的细胞Blasticidin：通过干扰核糖体中肽键的形成来特异性抑制原核和真核生物的蛋白质合成●第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点，决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
Invitrogen的Gateway系统质粒是不需要多克隆位点的两个Att位点用于同源重组，构建的过程就是目的基因通过同源重组取代Cm和ccdB基因。
CmR 是氯霉素抗性。
ccdB（Control of cell death）基因表达的蛋白，会破坏细菌的DNA gyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。
如果重组上，则ccdB 基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。
第四步：看功能元件。
载体类型、何种启动子、是否携带荧光等pDC316-mCMV-EGFP5885 bpampITRITRloxPAdEGFPCMVSV40 polyABGH pABGH reverse primer CMV forward primerT7 primermCMVT7 promoteroriNot I (2683)Nhe I (2651)如何选择合适的载体？影响载体选择的因素：▪原核表达or真核表达？▪细胞实验（过表达or干扰、瞬时表达or稳转株、基因大小、荧光、药筛）▪动物实验（过表达or干扰、注射部位、基因大小、观察周期）。
puc57 图谱简图
PUC57有氨苄抗性，MCS在lacZ基因里面插入基因后可通过蓝白筛选挑选阳性克隆。
如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA 片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
λ增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
其作用与增强子所在的位置或方向无关。
即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
/沉默子－负增强子，负调控序列。
λ核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。
λ转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
实验五 酶切
多功能
异源三聚体 ATP、 Mg2+ 、SAM
单功能
同源三聚体 Mg2+
双功能
异源二聚体 ATP、 Mg2+
识别序列
距识别序列1kb处
4~6bp回文序列
距识别序列下游 24~26bp处
随机性切割
切割位点
随机性切割
识别序列内或附近 特异切割 常用
应 用
不常用
数量很少，无实际 作用
4) 基本特性及用途
② DNA样品甲基化程度
限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应，则该 DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一， DNA甲基化现象广泛的存在于原核和真核生物中。 如：
AccⅠ识别序列 能切割 AccⅠ 不能切割 T CCGG T ×CCGG AGA
6mATC
注意此处的区别
限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：
GATATC CTATAG
产生平末端：
GAT CTA
ATC TAG
则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为：1600bp、 2624bp和6325bp的三条DNA 片段
Eco RV (10442)
35S promoter UTR pUC18 MCS lacZ promoter 35S promoter
① DNA样品纯度
A）样品杂有RNA 虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生 非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段 电泳观察。 B）少量的蛋白质污染 对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染 时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。 C）样品中杂有其他DNA 如质粒DNA中杂有染色体DNA，虽不影响 酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 D）其他杂质 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响 酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。
质粒图谱的阅读PPT课件
CHENLI
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2021/3/7
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53
2021/3/7
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免疫法筛选
• 外源基因在细胞内表达出的蛋白质，可 与特异性的抗体结合。
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利用抗体筛选
原理 目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异
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氨苄青霉素 抗性基因
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复制起点
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2.利用颜色筛选
插入失活现象
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
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多 克 隆 位 点
CHENLI
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一.目的基因与载体的连接
Link of cohesive end
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粘末端连接
CHENLI
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Link of blunt end
平末端连接
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CHENLI
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平末端连接
vector
1
T4 DNA ligase
Recombinant DNA
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CHENLI
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CHENLI
表示外源 基因插入 编码半乳 糖苷酶的 基因区段
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Target gene
质粒载体分类及阅读
质粒载体分类及阅读一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19R DNApUC57 DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescript II KS (+)L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET Dsb Fusion Systems 39b and 40bProtein Expression » Prokaryotic Expression » pET Expression System 33b Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET Expression Systems Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET Expression Systems plus Competent CellsProtein Expression » Prokaryotic Expression » pET GST Fusion Systems 41 and 42Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET NusA Fusion Sy stems 43.1 and 44Protein Expression » Prokaryotic Expression » pET Vector DNAProtein Purification » Purification Systems » Strep•Tactin Resins and Purification Kits四.PGEX系列表达载体T EcoR pGEX-1 I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYB systemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1(+)pPICZ alpha ApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
p C A M B IA 1 3 0 2
10549 bp
Kan
Eco RV (6218)
大p肠BR杆3菌22复or制i 起始位点
pVS1-REP 农杆菌复制起始位点
二、限制性内切酶
1) 概念 2) 命名原则 3) 类型 4) 基本特性及用途 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 6)Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
实验原理
• 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为 限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附 近的特异位点上，并切割双链DNA。
限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：
GATATC CTATAG
产生平末端：
GAT ATC CTA TAG
则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为：1600bp、 2624bp和6325bp的三条DNA 片段
属名
种名 株系
Haemophilus influenzae d
流感嗜血杆菌d株
HindⅡ HindⅢ
同一菌株中所含的多个不同的限制性核割特性、催化条件及是否具有修饰酶活 性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。
4) 基本特性及用途
Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切 方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′ 端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复 顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切 酶切割双链DNA产生3种不同的切口。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源 基因的插入。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
SnapGene中文使用教程
SnapGene使用教程一、SnapGene中的几个View介绍View1:Map1.打开一个质粒图谱文件，在Topol ogy option处选择ci rcula r。
得如下界面：显示质粒图谱的酶切位点。
右侧箭头可显示不同厂家出售的酶。
显示质粒图谱的开放阅读框及转录方向。
点击其显示的箭头可显示该ORF的片段大小、G C%值等一些信息。
显示片段名称。
△给非编码序列命名：如多克隆位点。
先找到质粒图谱中的多克隆位点的第一个酶切位点和最后一个酶切位点。
点击左侧se quenc e，找到两个酶切位点之间的序列。
View2:Sequen ce点击Sequ ence，得到如下界面：显示编码的氨基酸序列，有缩写和全写两种。
View3：Enzyme s点击Enzy mes，得到如下界面：View4：Featur es点击Features，得到如下界面：显示各个已命名片段的一些特点。
二、对片段进行注释1.给编码序列命名：点击其中一个箭头，按Featu re→Add Transl atedFeatur e，弹出以下窗口：Featur e：给该片段命名。
Type：选择该片段的类型，右侧箭头代表阅读方向。
Color：选择颜色。
2.给非编码序列命名：如多克隆位点。
先找到质粒图谱中的多克隆位点的第一个酶切位点和最后一个酶切位点。
点击左侧se quenc e，找到两个酶切位点之间的序列。
3.给质粒图谱增加引物序列：按Edit→Find，输入引物序列，找到质粒序列对应位置，点击Primers→Add primer，弹出该界面：按上下游引物选择Top Strand还是Bot tom Strand，在Prime r处可给该引物命名，随后即可显示该引物在图谱Map中的位置。
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如何阅读质粒图谱
第一步：首先看Ori的位置，
了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标
志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的
基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要
以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号
a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子
编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转
录的部位，但启动子本身不被转录。
b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有
增强邻近基因转录过程的调控顺序。
其作用与增强子所在的位置或方向
无关。
即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
/沉默子－负增强子，
负调控序列。
c核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体
d 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显
子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的
箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的
启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.。