核酸类药物

（二）发酵法生产核苷酸
1．发酵法生产肌苷酸（IMP） 2、发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸
（三）半合成法制备核苷酸
由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸 三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷， 进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。 例一：肌苷 2mmol ／ L 悬浮于 5ml 磷酸三乙酯中，温 度控制0℃，添加氯化氧磷 6mmol／L，水2mmol／L， 反应2h，5＇-IMP摩尔产率达91％。 例二：鸟苷 2mmol ／ L 悬浮于 5ml 磷酸三甲酯中，温 度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L， 反应6h，5＇-GMP摩尔产率达90%。
稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA 沉淀出来。上法的缺点是制得的 RNA M r 较 低 ,( 磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解 RNA ， 90 ℃保持 3~4h破坏酶)。 浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同 时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内 释放出来。 要避免分子降解，可采用苯酚法制备 RNA 。用苯 酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。
三、核苷的制备
本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。 （－）RNA化学水解法制备核苷 1．核苷生产工艺流程 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷
（－）RNA化学水解法制备核苷
1．核苷生产工艺流程（图14· 8）
（二）发酵法生产核苷
发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果， 产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种 核苷的菌株有着许多共同特点： ①它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小 芽抱杆菌为诱变出发菌株； ②它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性 状上具有特定标记的诱变菌；
2、具有生物活性DNA的制备
动物内脏（肝、脾、胸腺）加 4 倍重量生理盐水 经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分 钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤 3 次，每次洗后 离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣 碎 3 分钟，加入 2 倍量 5 ％的（用 45% 乙醇作溶剂）十 二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离 心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可 得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温 干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5 ％ 十 二 烷 基 磺 酸 钠 达 1 ／ 1 0 体 积 ，搅 拌 1 小 时 ，经 5000r／pm离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L， 再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗 涤，真空干燥得具有生物活性的 DNA （活性 DNA 制 备需在0～3℃操作）。
在菌体内 RNA 含量的变化受培养基组成影响，其中 关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率 高，易于提取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。 （2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到 RNA 含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量。
（二）DNA的提取与制备
1．工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精 20kg ，用绞肉机粉碎 2 次成浆状， 加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌， 升温至 100 ℃，保温 15 分钟，迅速冷却至 20 ～ 25 ℃， 离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性 DNA 的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生产脱氧核苷酸。如要制成固体状 DNA ，在热变性 DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤 维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得 DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。
3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）
呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺 。
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4．菌体自溶法生产核苷酸
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的 RNA 可产生 5 ′ - 核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法 生产5‘-核苷酸。 （1）菌体自溶法生产核莆酸工艺流程：
二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸
（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸 1、酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生5`-磷酸二脂酶 红酵母产生3`-磷酸二脂酶
2、酶解法制备戊糖核苷酸
我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产 单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。 酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程
脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。
（ 4 ） RNA 的提取实例：啤酒酵母是提取 RNA 的 很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份 70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓 慢搅拌30分钟。用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15 分钟，离心得清液255m1 。冷至10 ℃以下， 6mol ／ L HCl 调 pH2.5 ，置冷过夜，离心得 RNA l.8g （纯度80％）。
5．碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA 结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成 2＇，3 ＇ -混合核苷酸。 取 RNA 配成 3 ％ ～ 3.5% 的水溶液 ，加氢氧化钠达 0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用 6mol ／ L盐酸中和至 pH7.0 ，从RNA 水解成 2 ′ ， 3 ＇ 核苷酸的降解率达 95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸 制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特 异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和 放疗后的升白血球均有较好疗效。