高效液相色谱仪测定发酵液中的氨基酸含量

17种氨基酸液相色谱法

17种氨基酸液相色谱法
液相色谱法是一种常用的分离和分析化学物质的技术。

在氨基
酸分析中，液相色谱法可以用于分离和检测氨基酸。

一般来说，液
相色谱法可以通过不同的色谱柱和检测方法来实现对氨基酸的分析。

针对17种氨基酸的液相色谱分析，首先需要准备样品，并进行
适当的前处理，如衍生化处理，以使得氨基酸能够更好地被分离和
检测。

接下来，选择合适的色谱柱和流动相，比如反相色谱柱和离
子交换色谱柱等，以实现氨基酸的分离。

此外，还需要选择合适的
检测方法，比如紫外检测器或荧光检测器等，来检测氨基酸的含量
和浓度。

在液相色谱分析过程中，需要严格控制实验条件，比如流速、
温度和pH 值等，以保证分离的准确性和重现性。

最后，通过比较
样品峰的保留时间和峰面积，可以定量分析出17种氨基酸的含量。

总的来说，液相色谱法对于17种氨基酸的分析需要精确的实验
操作和严格的条件控制，但可以实现对这些氨基酸的准确分离和定
量分析。

高效液相色谱法测定氨基酸

脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案1、仪器与试药1.1 仪器1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国）1.2 药品与试剂16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。

脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。

批号：2013、2013、2013.乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。

2、方法与结果2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。

）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。

2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表所示的混合溶液。

取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。

氨基酸的衍生与高效液相色谱分离的研究

氨基酸的衍生与高效液相色谱分离的研究江芸，林育汉（北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系，北京，100083）摘要：蛋白质是生命的基础，氨基酸是蛋白质的主要组成部分，因此氨基酸的种类和含量是测定蛋白的一项重要指标。

氨基酸的含量一般用氨基酸分析仪测定，氨基酸分析仪的工作原理是基于离子交换层析法与氨基酸分析仪的测定方法相比高效液相色谱法因其具有分离度高，选择性好等优点自20世纪70年代以来开始应用于氨基酸的分析测定中随着研究的不断深人，柱前衍生与C18柱分离法相结合已成为氨基酸分离和分析的有力工具。

以ODS-c_(18)柱(100mm×4.6mm i.d.,5μm)为色谱柱,2,4-二硝基氟苯为衍生化试剂,进行氨基酸的定性测定。

流动相A:0.05mol/L乙酸钠缓冲溶液(pH=6.5,含10mL/LN,N-二甲基甲酰胺),流动相B:乙腈-水(体积比为1:1)。

所测氨基酸组分的浓度在0.2～3.0mg/L范围内与峰面积之间具有良好的线性关系,检出限为0.120～1.225mg/L,该方法准确、重现性好，可用于氨基酸的定性和定量测定。

关键词：氨基酸衍生物；高效液相色谱；2,4-二硝基氟苯高效液相色谱法是在经典液相色谱法基础上发展起来的。

高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程,它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离[1]。

经过近30年的发展，现在高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，都达到了与气相色谱相媲美的程度，并保持了经典液相色谱法对样品适用范围广、可供选择的流动相种类多和便于制备色谱的优点。

其优点概括如下：采用高效微粒固定相使色谱分离效能大大提高；采用新型高压输液泵使分离时间大大缩短；采用高灵敏度的检测器使仪器的检测灵敏度大大提高；由于HPLC具有高柱效、流动相可以控制和改善分离过程的特点，故其选择性高。

高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中的酪氨酸和色氨酸含量-精品文档

高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中的酪氨酸和色氨酸含量复方氨基酸注射液是一种透明、无色或微黄色的澄明液体，适用于不能口服或经肠道补给营养，以及营养不能满足需要的患者。

复方氨基酸注射液具有促进人体蛋白质代谢正常，纠正负氮平衡，补充蛋白质，加快伤口愈合的作用。

氨基酸（Amino acid）是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性[1-4]。

蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酵素和酶。

酪氨酸是一种芳香族氨基酸，亦是20种用来合成蛋白质的蛋白氨基酸之一[5-11]。

色氨酸具有促进胃液及胰液产生的作用。

目前主要生产复方氨基酸注射液的厂家有上海长征富民金山制药XX公司、广东利泰制药XX公司、八峰药化宜昌有限责任公司、石家庄四药XX公司、西南药业XX 公司、湖南科伦制药XX公司、安徽丰原药业XX公司、广东科伦药业XX公司、广东利泰制药XX公司、广州百特侨光医疗用品XX公司等。

本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量。

1 仪器与试药瑞士梅特勒-托利多MS精密天平（梅特勒-托利多中国公司）；SCQ-1020超声波清洗器（上海声彦超声仪器XX公司）；UltiMate3000 高效液相色谱仪（上海仪先仪器XX公司）；E2000制冷色谱柱温箱（上海子期实验设备XX公司）；UV2800紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器XX公司）；PHS-3C酸度检测仪（深圳市卡迪亚科技XX公司）；MP-TA-10L 超纯水器（成都优越科技XX公司）。

乙腈（济南汇丰达化工XX公司）、三乙胺（吴江市吉祥精细化工XX公司）、冰醋酸（济南汇丰达化工XX公司）、甲醇（吴江市吉祥精细化工XX公司）、醋酸钠（济南汇丰达化工XX公司）、磷酸二氢钠（吴江市吉祥精细化工XX 公司）、四氢呋喃（济南汇丰达化工XX公司）、磷酸（淄博丰仓化工XX公司）。

2 含量测定2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果[11]，确定色谱条件如下。

高效液相色谱法测定谷氨酰胺的含量

谷氨酰胺（Glutamine）是一种重要的氨基酸，它在生物体内有着广泛的生理功能。

作为一种重要的指标化合物，准确测定谷氨酰胺的含量对于生物医药领域具有重要意义。

在分析谷氨酰胺含量时，高效液相色谱法（HPLC）成为一种被广泛采用的方法，其结果准确可靠，操作简便，具有很高的敏感性和选择性。

本文将以深度和广度的方式探讨高效液相色谱法在测定谷氨酰胺含量中的应用。

一、什么是高效液相色谱法？高效液相色谱法是一种分离杂质的有效方法。

它利用液相不同成分对于固定相的相对亲和性不同，实现对混合物中各成分的分离。

高效液相色谱法在分析化学领域得到广泛应用，通过对不同成分在固定相上的吸附、分配、解吸和离子交换等过程进行控制，使得各成分被分离出来，并可以通过检测器进行检测。

二、高效液相色谱法测定谷氨酰胺含量的原理在测定谷氨酰胺含量时，一般采用离子对色谱法或手性色谱法。

离子对色谱法是指根据样品中阳离子、阴离子与离子对试剂形成离子对而产生的保留作用，用以分离成分的色谱方法。

而手性色谱法是利用手性色谱柱对立体异构体进行分离的方法。

通过高效液相色谱法，可以准确地测定谷氨酰胺的含量，并且对杂质的干扰具有很高的抵抗能力，确保分析结果的准确性。

三、高效液相色谱法测定谷氨酰胺含量的步骤1. 样品的制备：将待测样品按照规定的方法进行制备，保证样品的质量和含量。

2. 色谱条件的选择：选择适当的色谱柱、流动相和检测条件，确保样品的分离和检测。

3. 样品的进样和分离：将制备好的样品进样至色谱仪中，进行分离。

4. 谷氨酰胺含量的计算：根据峰面积和标准曲线，计算出样品中谷氨酰胺的含量。

四、高效液相色谱法测定谷氨酰胺含量的优势1. 准确可靠：高效液相色谱法在测定谷氨酰胺含量方面具有高准确性和可靠性，能够满足实际分析的需求。

2. 操作简便：相比其他分析方法，高效液相色谱法操作简便，不需要复杂的操作步骤和设备。

3. 敏感性和选择性高：高效液相色谱法可以在较低的浓度下进行分析，对于谷氨酰胺含量的测定具有很高的敏感性和选择性。

高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量

河北医科大学学报JO U RN A L OF HEBEI M ED ICA L U NI VER SI T YV o 1.17　No .3　1996高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量许彦芳　许新民　王永利药理教研室(050017) 摘　要　本文利用高效液相色谱(HP L C )柱前邻苯二甲酝酿(OP A )自动衍生、自动进样程序测定脑组织中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和r -氨基丁酸含量。

该法的最低检出限为10nmol /ml ,5种氨基酸峰面积测定值的变异系数平均为2.0±1.3%,线性相关系数平均为0.97±0.03。

关键词　HPL C;氨基酸;OP A ;自动衍生;自动进样HPLC -PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OFAMINO ACIDS BY AUTOMATIC PRECOLUMN DERIVATIZATIONXu Yan fang Xu Xinmin Wang YongliDep artment of Ph armacologyABSTRACT Glutamate,asparate,glycine,taurine and GABA in brain w ere seperated and determined by HPLC system of the autom atic processes of precolum n o -phthaldialdehydeder iv atization and injection .Average co efficient o f variatio n for peak areas of 5amino acids w as 2.0±1.3%w ith the detectio n lim it o f 50ng.Av erag e line co orelatio n coefficient w as 0.97±0.03.KEY WORDS HPLC ;o -phthaldialdehyde ;amino acids ;automatic derivatizatio n ;au-tom atic injection 生物样品中的微量氨基酸测定在医学领域中占重要地位。

反相高效液相色谱—紫外吸收法测定灵芝中氨基酸的含量

反相高效液相色谱—紫外吸收法测定灵芝中氨基酸的含量0一;{药物分析杂志反相高效液相色谱一紫外吸收法测定灵芝中氨基酸的含量商振华于亿生郭为蒋辉r——(百;;磊大连化学物理研究所l16.12)A采用本实验室自行制备的反相高技涟相色谱桂,以醋酸钠缓冲液和乙温下对常见的16种1一氟一2.4一二硝基苯(FDNB)衍生化氨基酸进行了有效的分离,用紫外吸收检测器(360nm)和外标定量法对灵芝蛋白中各种氨基酸的含量进行了测定.结果表明:FDNB衍生化氨基酸在一周内是稳定的,回收率在96～102之间,相对标准偏差小于4N一灵芝中含有人体必需的赖氨酸,苯丙氨酸和组氨酸等组分关毽词1一氟一2,4一二硝基苯预柱衙生初级和扶毁氨基酸反相拄紫外吸收检测灵芝I一一———————～～氨基酸分析报道的方法有离子交换柱分合相填料,10m,匀浆法装填.ZS0mm×离一茚三酮显色.’:,反相液相色谱分离一邻苯二甲醛,丹酰氯.,9一芴甲基氯甲酸酯”等荧光衍生测定方法近些年来又发展出了可直接采用紫外吸收检测的一些新方法.其衍生化试剂有1一氟一2.4一二硝基苯(FDNB).1一氟一2—4～二硝基一5一L一丙氨酰胺”,N,N一二乙基一2,4一二硝基一5一氟苯胺(FDNDEB).异氰酸苯酯(PITC)等.其特点是:衍生化产物在特制的反相高效柱上分离,在可变波长紫外吸收检测器上测定,大多能同时对初级和次级氨基酸进行定量.我们用国产原料制备了反相氨基酸专用分析柱,在45min内对l8种氨基酸进行有效分离.于360nm检测,最小检出量可达10pmol/L,并对灵芝蛋白中各氨基酸含量进行了测定.实验部分一,仪器与试剂GAD—LN007高效液相色谱仪(法国GiLson公司);506接口;305型高压输液泵(--台);806压力传感器;NEc—APCⅣ型微处理机,GiLson714色谱软件;811A动力学混合器;Rheodyne7125进样阀;116型可编程序紫外吸收检测器;色谱柱:AA05反相键车谋墨为国掌自妻复科学基盘贷助项目4.6ram(内径)FDNB(分析纯,Merck公司产)在棕色量瓶中配制成1乙腈(光谱纯)溶液于4C下避光保存,供衍生化用.其它试剂均为分析纯;去离子水经二次蒸馏.用超声波发生器严格脱气.L一氨基酸标准品(光谱纯,Sigma公司产)灵芝样品(山西运城市灵芝研究所提供) 二,供试品溶液的制备1.灵芝蛋白的水解取灵芝样品,用去离子水洗净.80C烘干,研成细粉(<200 目).110C烘至恒重.精密称取一定量,置于带铝箔盖的锥形水耩反应瓶中,加6mol/L盐酸lml,抽去瓶中空气.通人干燥氩气,抽去氩气?再通人氢气,盖紧瓶口.于110C水解2地.放冷至室温,取水解液离tL,sm(4000r/ rain)-过滤?滤液用2tool/L氢氧化钠溶液中和至中性.2.氨基酸标准品和样品水解液的衍生化取氨基酸标准品和样品水解蔽各lml-分别置于10ml棕色量瓶中.加0.5mol/L碳酸氢钠溶液(pH9.0)lm1.1FDNB乙腈溶液1m1.混匀.于60(避光反应lh.待反应液冷至室温,加0.01mol/I磷酸氢■钾溶液(pH 70)至刻度.摇匀.取Jml,离心f4000r/n)10min,取10,ul进样.结果和讨论一FDNB衍生化氨基酸的分离1.柱效对分离的影响为了使16种氨基酸在较短时间内获得好的分离,选用填料粒度均匀,键台量适中.又经封尾处理的高效分离柱.按表l所列实验条件,用匀浆法制备氨基酸专用色谱柱.每米柱效均接近或超过l00000塔板数.分离结果见图l由于选用的流动相含盐浓度很低(60mtool/L),又接近于中性(pH6.45),因此,既不会造成对进样阀,泵,管路等的堵塞和腐蚀,叉不会损坏仪器和色潜柱,而且操作压力适中(8～15MPa).采用增加乙腈含量的梯度洗脱模型,能保证生成的衍生化产物和填料表面键台相间的快速质量传递,从而使与固定相有较强相互作用的憎水性氨基酸(如}Ile,Let,,Phe,Lys等)也能保持峰型的对称性和较高的分离效能.少量有机改性剂N,一二甲基甲酰胺的加入,有利于减弱强憎水性氨基酸与键合相之间的相互作用提高柱效结果表明:一根柱效达20000塔板数的色谱柱(一般为20～25cm)就能使16种常见氨基酸获得满意的分离.表lFDNB衍生化氨基酸在AA05反相柱上的分离条件色谱住流量柱压降冲l;芒剂梯匪模型拉测器柱温AA05型键台相柱-10±2t,m250ram×46ram1ml_mI2～g6MPaA160mtool’L醋酸钠(pH645)1N.N一Ⅲ二甲基甲酰胺(V—V) B己睛水(1:lV/V)性;_司(mIn)0230745组成(BJ15304070】00UV6Ohm.…AUFS’室温(2a～23()-【03O∞ii1{__凹1在AA05反相桂上常见氨基酸的舟离谱图1.Axp2Olu3Set4.DNPOH5杂质6Gly.Thr8.Pro9AlajnArgIlV al12Met13liel4Leu15Trpl6.Phe】7.Hl$l8Lvs2梯度洗脱模型的选择要使16种氨基酸在较短时间内获得好的分离,除柱效外,梯度洗脱模型的选择也很重要(见图1)若流动相从100A开始,则会使Asp,Glu,Ser等强极性氨基酸出峰时间拖后,延长分离时间.若乙腈一水起始含量过高或在7～23rain问的梯度陡度过大,则会使副产物DNP～OH与Gly,Thr,Pro,Ala,Arg间的分离度变小.影响定量精度.若不适时地增加23～27rain及37 ～45rain问的梯度陡度,则会延缓中性氨基酸V al,lie,Leu及强憎水性氨基酸Phe,Trp,tys等的出峰时间,使分析时间拖长.在表1所列梯度模型下,45rain即可完成16种氨基酸的分离,一般色谱柱平衡时问只需5mir,,分离的重复性也很好,保留时间误差小于1.药物分析杂志二,FDNB衍生化氨基酸的稳定性若将FDNB衍生化产物在室温下暴嚣于空气中,结果表明:24h后大部分氨基酸含量降低5以上,3天后则降低2o以上.若在室温下避光保存,3天后其含量变化仍小于5,即使放置一周,其含量变化仍在5以内.4C下避光保存3o天,除Met,Trp,His含量变化分别为6.8,7.5,9.2外,其余氨基酸的含量变化仍小于5.这说明FDNB衍生化氨基酸只要严格避光保存,是相当稳定的.三,灵芝中氨基酸含量测定灵芝含有丰富的有机酸,有机锗,多糖体,氨基酸等.图2是灵芝样品蛋白经水解后,采用FDNB衍生化法所生成的氨基酸在AA05 反相色谱柱上的分离结果.若将水解反应温度提高到150C.则水解反应在8h内即可完成,1,/l\LE05D…图2灵芝中各种氨基酸在反相拄上的升离结果色谱蜂号同图1本实验采用外标法,将16种氨基酸分成两组,配置不同浓度标样,衍生化后再经色谱分离,测定不同浓度下各氨基酸的峰面积,计算出响应因子,根据响应因子直接算出灵芝样品中相应氨基酸的含量,结果见表2.各氨基酸的回收率和相对标准偏差(n=5)也汇总在表2中.回收率实验采用标准加样的方法,在灵芝水解前将经过准确称量的标准氨基酸加人样品中,根据分离后的峰面积与未加标准样的结果计算回收率.除Trp外,其它氨基酸的回收率均在96～102之间,相对标准偏差均小于4.表2结果表明:灵芝中氨基酸的含量大约为总重量的3.4,尤其富含人体所必需的His,Phe和Lys,这3种氨基酸含量约占85,远高于其它氨基酸含量.图2的分离结果未发现胱氨酸和半胱氨酸,是否在强酸水解过程中被降解破坏掉了,有待进一步研究.裹2曼芝中各种氯基蘸吉■的舅定结果参考文献1MooreS.SpackmanDHandSteinWHChromatography Dfaminoaektsonsulfonatedpolystyrene~sinsAnal Chem,1958.30(7)I1185～11902UheAM,colllerGR,McLermmnEA,eta1.Quandta. tionoftryptophaaandotherD1Ⅱsmaaminoacidsbyauto- matedpre?colmno?Phthaldialdehydedefivat~atmn HPLC:improvedsamplep~paratlonJChromatogr,1991, 564(1):81～913BaeysnsW,BruggemanJandLinB.EnhancedchemUuml一一detectionof$omedansylaminoacidsinliquid ehromatograp.Chromatograph/a,1989.27(5--6):191～1944BlankenshipDT.KfivanekMA.AckermaanBL,eta1.High-sensltivltyaminoacidsanalysisbydefivat~atmn14(4).1994?33?with…phth1a[dehydeand9fluorenylraethylchlorofor—mateusingu.rescencedetection:applicationinprotein structuredete~ination.AhalBiochem,1989,178(2):227～2325陈亚兰.付宜和,王国林等十八种氨基酸注射液的HPLC 2,4一二硝基氟苯柱前衍生化法音量测定.药物分析杂志?1990-10(9):149～1516KochharSandChristenP.AmlaoacidanalysishyHPLC afterderivatizationwith1Iluoro2.4一dinitropheny[一51一alanineamide.AhalBiochem.1989,178:17～217Fem帕I,RubinoFM,BolzaceiniE,eta1.Pre—column deri…tiationofaminoacidswithN,N—diethy]一2,4一dinitro一5一fluoroanlhaeandreversed—phaseliquidrD-raatngraphicseparation.JChromatogr,1988’433:53～628徐康森.郝苏丽.孙桂英等.高教液相一pico?TagTM量快速分析氨基酸药物分析杂志,1988t8(5):船3～287(本文于1992年9月20日收刊) TheSeparationofAminoAcidsinGlossyGanodermaon ReversedPhaseColumnandQuantitativeDetermination wihtUVAbsorptionDetectorShangZhenhua?YuYinian-GuoWei?JiangHuiandWangJunde (Datianlnsfftla~ofChemicalPhsicsAcademiaSinicaDatian116012) Theprimaryandsecondaryaminoacidsproducedinpreeolumnderivatizatio nwith1--fluo—m一2.4--dinitrobenzene(FDNB)havebeenefficientlyseparatedonthereversedph asecolumn preparedinourlaboratoryatambienttemperature.Asimplelineargradientelu tionwithacetate bufferandaeetonitrilesolutionisusedformobilephaseduringtheseparation. Themethodhas beensuccessfullyappliedtothequantitativedeterminationofaminoacidsofh ydrolysedprotein.fglossyganoderma.The.FDNBderivativesofaminoacidsaremorestableth anthoseintradi—tionalmethods.Themethodhashighrecoveryandgoodaccuracy. Keywords:pre—columnderivatizationwith1--fluoro一2,4--dinitrobenzene:primaryandsecondaryaminoacids:reversedphasecolumn;UVabsorptiondetection:glo ssyganoderma。

高效液相色谱仪测定发酵液中的氨基酸含量

高效液相色谱仪测定氨基酸的含量1 L--色氨酸含量的测定1.1实验仪器与试剂色氨酸样品，甲醇，高效液相色谱仪，0.03%KH2PO4溶液1.2 HPLC色谱分析条件流动相为0.03%KH2PO4溶液（A）-甲醇（B），线性梯度淋洗，流速1.0mL/min，柱温35℃，检测波长276nm。

1.2标准溶液的配制精密称取色氨酸标准标准品50mg，置100ml容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。

1.3标准直线的制作精密称取色氨酸标准样品适量,分别稀释制成每1ml 中含色氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色谱仪，以色氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。

1.4发酵液中样品中色氨酸含量的测定取发酵液，稀释配制成约500μg/ ml 的溶液，摇匀，过滤，取25μl进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。

2L-精氨酸含量的测定2.1实验仪器与试剂L-精氨酸标准样品，乙腈，高效液相色谱仪，磷酸二氢铵。

PH计，磷酸，2.2HPLC色谱分析条件流动相: 以磷酸二氢铵溶液( 称取磷酸二氢铵1.15g, 加水800m 溶解后, 用磷酸调节pH 值至2.0±0.1, 加水稀释至1000ml ) - 乙腈为流动相，线性梯度淋洗; 柱温为30℃检测波长为206nm；进样量：25μl。

2.2标准直线的制作精密称取精氨酸标准标准品50mg，置100ml 容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。

精密称取精氨酸标准样品适量,分别稀释制成每1ml 中含精氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色谱仪，以精氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。

2.3发酵液中样品中精氨酸含量的测定取发酵液，稀释配制成约500μg/ ml 的溶液，摇匀，过滤，取25μl 进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。

柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸

ＤｎｙＣ法检测极限与ＯＡ和ＦＣ法相ａｓｌｌ－ＰＭＯ
［］．ｅｇＧＪｕｈ，．ａＷｉｉｅ，．．ｉ２ＣＤＪ，．ＨｇｅＥＶｎｒｇＫＪＷｌｏｎ．ｓｅｎｎ－
ｓｎＪＣｒｍｔｇ．２１３５１８）ｏ，ｈｏａｒ，４，４（９２．．ｏ［］．．ｉｉｓａ，ＡｖｎｅｉＣｒｍｔｒｐｙ，３ＪＣＧｄｎｅｌｄｇｔ．ｄａｃｎｏａｏａｈｓｈｇ
氨基酸不稳定，特别是甘氨酸、赖氨酸衍生物的信号衰减很快，此法多用于全自动的在线衍生（ｎｌｅ。ｏ－ｎ）ｉ４ＯＡ法分析配合饲料氨基酸回收率较低，．Ｐ这可能是配合饲料中的盐分影响了衍生（）０ｌ。
一、邻苯二甲醛ＯＡ）Ｐ法
邻苯二甲醛（Ｐ衍生法，ＯＡ）早在１７年就由９１Ｒｔ提出，ｏｈ由于其灵敏度比茚三酮法高出十倍，故
Ａ－Ｈ＋ＤｎｙＣＡＮ－ａｓ－ｌＣＡＮ２ａｓｌｌＡＨＤｎｙＣ＋Ｈｌｌ
从仪器设备上讲，均采用两元梯度淋洗，需要两台高压液相色谱泵，紫外或荧光检测器等。分析柱多采用反相Ｃ８ＦＣ法以反相Ｃ柱居多。１ＭＯ柱，８从仪器生产厂家看，惠普公司和吉尔森公司采用ＯＡ与ＰＦＣ结合法（，ｔｓＭＯ２Ｗａｒ公司则建议采用ＰＴ５）ｅＩＣ法，并推出了专用的氨基酸分析柱Ｐｃ－ａ及衍生ｉＴｇｏ工作站，ＫＬＢ公司则认为ＯＡＦＣ和ＰＴＰＭＯＩＣ三法均可使用。在实际应用中，ＰＯＡ和ＦＣ在生理ＭＯ体液中应用较多，而在食品和饲料工业中ＰＴＩＣ法占主导地位。据Ｆｒ统计结果表明，ｓｔ每年采用ＯＡＰ法大约分析８０个生理体液样品，ＭＯＩＣ和００ＦＣＰＴ

高效液相色谱法测定氨基酸含量的优化及应用

高效液相色谱法测定氨基酸含量的优化及应用一、前言氨基酸是构成生物体蛋白质的基本单元，具有重要的生物学功能，如构建细胞结构、参与免疫反应以及转运、储存等多种生命活动。

而测定氨基酸含量的方法有很多种，其中，高效液相色谱法（HPLC）具有高灵敏度、高分辨率、快速分离、定量准确、重现性好等特点，因此被广泛应用于氨基酸分析领域。

本文重点介绍了高效液相色谱法测定氨基酸含量的原理、优化及应用。

二、方法原理高效液相色谱法是利用固体相、液相以及流动相间相互作用的分离技术，它通过改变固体相和液相的化学性质和物理性质，通过不同流动相的渗透能力与氨基酸分子的分子量、极性、结构特征等因素的相互作用，实现对氨基酸化合物分离、检测和定量的目的。

三、优化方案1.色谱柱的选择色谱柱的选择直接影响着 HPLC 法测定氨基酸含量的敏感度和分离效果。

常用的色谱柱有离子交换柱、反相柱、手性柱。

2.氨基酸样品的制备氨基酸的提取方法主要有：硫酸-氯化氢法、热酸解法和酶切法。

其中前两种方法操作简单，容易控制，常用于高精度测定。

3.流动相的优化流动相中添加适量的酸或碱，有利于提高分离度和氨基酸的稳定性。

同时加入有机物质类的前处理，在未来进行样品的提取、清洗等操作，有助于减少基础样品产生。

4.色谱条件的优化尽量缩短柱温度，降低流速，减少相互扰动，提高分辨率。

通常，正向向柱洗液的浓度可逐渐提高，也可采用反向洗液以加速洗脱。

四、实验结果分析实验结果显示，优化后的 HPLC 法测定氨基酸含量其灵敏度、准确度、重现性等指标均有了明显的提高，特别是样品前处理及流动相的优化方案都有利于提高样品的稳定性和可检出性。

五、应用展望高效液相色谱法测定氨基酸含量的优化方案在氨基酸分析领域具有广泛的应用前景。

在临床医学、食品安全、环境污染等领域，测定氨基酸含量对于人类健康与生产活动具有重要意义，因此优化后的 HPLC 法测定氨基酸含量将被广泛应用于相关领域。

总之，高效液相色谱法测定氨基酸含量的优化方案既有理论指导又有实验可行性，为实现准确测定氨基酸含量提供了新思路和新途径。

氨基酸检测方法

氨基酸检测方法1. 氨基酸色谱法氨基酸色谱法是一种常用的氨基酸检测方法。

该方法是利用氨基酸的特性，在具有特定氨基酸浓度梯度的柱子中流动时，各种氨基酸会按照一定的顺序在柱子中被分离出来。

利用这种分离技术加上不同的检测方法，可以精确地测量样品中各种氨基酸的含量。

该方法准确度高，响应灵敏，但需要高昂的仪器和耗材。

2. 离子交换色谱法离子交换色谱法也是一种常用的氨基酸检测方法。

该方法是在离子交换柱中，将混合的氨基酸样品与柱内的离子交换树脂进行交换，实现各种氨基酸的分离和测量。

该方法测量精度高，但某些疏水性氨基酸分离效果不佳。

3. 毛细管电泳法毛细管电泳法是一种高效而准确的氨基酸检测方法。

其基本原理是将氨基酸样品在带电的毛细管中进行分离，利用质量分析仪器对氨基酸进行检测。

毛细管电泳法能够在非常短的时间内对混合氨基酸进行快速、准确的测量。

4. 气相色谱法气相色谱法是一种相对快速而精确的氨基酸检测方法。

在气相色谱法中，氨基酸样品首先通过氨基酸衍生化反应使其变得易于气相分析，然后在气相色谱仪中将氨基酸进行分离和测量。

该方法准确度较高，同时也提供了氨基酸的结构信息。

5. 氢化技术法氢化技术法是一种经典的氨基酸检测方法。

该方法是将氨基酸样品加入到盛有氢气的高压釜中，加热反应，利用氢化反应将氨基酸转化为氨基酸替代物，然后对替代物进行定量测量。

该方法简单易行，但需要高压釜及氢气供应等耗材。

6. 高效液相色谱法高效液相色谱法是一种可靠的氨基酸检测方法。

其基本原理是使混合样品在高效液相色谱柱中分离，使各种氨基酸有序地流过柱中吸附剂，并使用各种检测方法获得氨基酸含量的定量信息。

该方法测量范围广，准确度高，但仍需要较昂贵的仪器和耗材。

7. 红外光谱法红外光谱法是一种非常方便和易行的氨基酸检测方法。

该方法利用分子中各个化学键的振动所导致特定波长的吸收光谱来区分各种氨基酸。

虽然红外光谱法不能直接定量测量氨基酸，但是可以通过特定的计算和数据分析方法来获得氨基酸的含量和结构信息。

高效液相色谱法测定氨基酸含量操作流程

高效液相色谱法测定氨基酸含量操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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反相高效液相法测定发酵豆粕中的17种氨基酸含量

发酵豆粕是代替鱼粉的较好物质。氨基酸含量是发酵豆粕营养成分的重要指标，也是饲料等产品
品质监控的重要指标，因此需要建立快速准确的定
２，４－二硝基氟苯和６一氨基奎啉一Ｎ一羟基琥珀酰亚胺碳酸盐［。等。在Ｋｏｏｐ等和ＢｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒＬ４］证明
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＧｕｏＺｉｈａｏ，ＦａｎｇＨｕａ，ＸｉａＺｈｉｓｈｅｎｇ，ＬｉＷａｎｇｊｕｎ，ＺｈｕＪｉａｏｓｈｉ，ＳｕｎＺｈｏｎｇｃｈａｏ，ＹｕＨａｎｌｉ，ＸｉａＪｉａｊｉ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ１７ｋｉｎｄｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｂｙｒｅｖｅｒｓｅｄ－。ｐｈａｓｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏ ‘ ＿
之间的线性关系较好，加标回收率较高。试验结果表明本方法操作简单、灵敏度高，适用于豆粕和发酵豆粕中氨
基酸的测定。
关键词：豆粕；发酵豆粕；氨基酸；液相色谱；柱前衍生中图分类号：￥８１６．１７文献标志码：Ａ文章编号：１００３ —６２０２（２Ｏ１３）１２ —００５９ —０４

氨基酸分析指导原则

附件：氨基酸分析指导原则草案公示稿氨基酸分析指导原则氨基酸分析系指采用适宜的方法测定蛋白质、多肽或其他药物制剂中氨基酸组成和/或含量。

药品中氨基酸分析通常采用基于高效液相色谱法分离的衍生化法，涉及样品的水解、衍生化反应、分离检测和数据处理等操作。

本指导原则概述了药品中氨基酸分析的基本要求、蛋白质和多肽样品的水解、常用测定方法及其数据分析，为药品中氨基酸的分析提供指导。

1 基本要求1.1仪器氨基酸分析使用的仪器通常是高效液相色谱仪或氨基酸分析仪。

高效液相色谱仪适用于柱前衍生化产物的分离检测；对于柱后衍生化法，由于离子交换分离过程的复杂性和对柱后衍生化反应装置的特殊要求等，一般使用商品化的氨基酸分析仪。

1.2内标物氨基酸分析常采用内标法，内标物应是非天然存在的一级氨基酸，易于获取且价格便宜，在水解过程保持稳定，其色谱响应应与浓度成线性关系，具有独特的保留时间且与待测氨基酸能有效分离。

常用的内标物包括正亮氨酸、α-氨基丁酸、正缬氨酸、肌氨酸和硝基酪氨酸等。

内标物应在水解前或衍生化反应前添加到氨基酸混合物中，以消除由于水解、衍生化、取样、进样、溶液稳定性和色谱条件变化所导致的差异。

1. 3方法验证用于品种项下的氨基酸分析方法，包括样品水解，应参照分析方法验证指导原则（通则9101）进行方法学验证。

1.4水解管的清洗与要求为避免如手套粉末和指纹残留物等对分析结果的影响，水解管应清洗干净。

或使用一次性的水解管。

清洗方法：将水解管用1mol/L盐酸溶液中煮沸1小时，或将其浸泡在浓硝酸或浓盐酸-浓硝酸（1：1）混合液中1小时，再依次用高纯水、HPLC级甲醇冲洗，烘干并密封保存，以免再次污染。

2 蛋白质和多肽样品的水解蛋白质或多肽样品中的氨基酸是以结合形式存在，必须经过水解处理，形成游离氨基酸后才能进行氨基酸分析。

水解方法主要有酸水解，同时辅以碱水解。

酸水解中使用最广泛的是盐酸水解，所得氨基酸不消旋，但该方法引起一些氨基酸的破坏或部分破坏，如色氨酸被破坏，丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸被部分破坏，门冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺分别转化为门冬氨酸和谷氨酸。

HPLC测定发酵液中氨基酸的含量doc资料

HPLC测定发酵液中氨基酸的含量一、主要试剂及配置方法衍生试剂溶液：0.5％2,4－二硝基氟苯（DNFB）乙醇溶液衍生缓冲溶液的配制：称取衍生缓冲溶液固体组分（NaHCO3）4.2g加入至100mL 容量瓶中，定容并摇匀后备用。

定容缓冲溶液的配制：称取定容缓冲溶液固体组分（磷酸二氢钾）3.4g，加入至500mL容量瓶中，加入0.1mol/LNaOH145.5mL定容。

流动相A的配制：乙腈－水（1：1）：相同体积的乙腈与水混合，超声波脱气10-15min。

流动相B的配制：流动相B固体成分（NaAc）8.2g加水至2000mL，超声波脱气10-15min。

氨基酸标样：每种色谱纯氨基酸标品秤取0.5g，用水溶解后，定容至100mL，配成5g/L的氨基酸标准溶液。

发酵液预处理：用可调微量移液器吸取1.0mL发酵液于1.5mL小离心管中，高速离心（10000r/min，2min）沉淀菌体等固形物。

二、衍生方法准确量取发酵液原液2微升，加入装有0.2mL衍生缓冲溶液的5mL塑料离心管中，然后加入0.1mL衍生试剂溶液，摇匀，注意不要漏液，将塑料离心管置于60℃水浴中暗处恒温加热60min后取出，注意不要让水进入离心管，放置待溶液冷至室温后，加入定容缓冲液0.7mL并摇匀，放置15min后可以开始进行色谱分离。

三、色谱分离条件色谱柱为依利特公司氨基酸分析专用ODS柱或C18柱；检测系统为：紫外检测器，柱温：33℃；采用二元梯度分析，梯度程序如表所示；波长360nm检测；流动相总流量为1mL/min。

流动相梯度时间表序号流量/mL/min 时间/min流动相A/%流动相B/%线性设定备注1 1 0 16 84 Line 初始状态2 1 0.3 16 84 Line3 14 30 70 Line4 1 7 34 66 Line5 1 12 43 57 Line6 1 22 55 45 Line7 1 25 55 45 Line8 1 34 98 2 Line9 10 11384016168484Line 系统开始重新平衡，恢复到初始状态四、计算方法定性和定量方法(1)根据保留时间和紫外吸收谱进行定性分析。

HPLC法检测发酵液中苏氨酸含量

次，。进样
２３谱条色柱：Ａ・色件谱ＡＡ氮荃柱（ｏ４６；ｍ，１ｘ・，５）５卜
流动相：流动相Ａ与流动相Ｂ按如下程序进行梯度洗脱：
时间（）丽．Ｂ％）（００１９．０１，８１５７１．８６１００２．２３１０２．３２０２６０
提供）。
２２。样品的衍生用高效液相色谱仪自动进样系统进行柱前衍生，设ｔ进样程序为：取翻酸缓冲液２５Ｌ取样品溶液．产，
。５Ｌ在空气中混合３以最大速率进行２等待 ‘科．汕，次，。５，．而ｎ用水洗进样针外壁１取ＯＡ试剂。５Ｌ在空次，Ｐ．拜，气中混合３Ｌ以拌，最大速率进行６用水洗进样针外壁１次，次，３．科，取水２。Ｌ在空气中混合１产，８Ｌ以最大速率进行２
ＫＹＷＯＩＨＬ，ｈｉＡａｓ，ｔｅＲ，：ＰＣＴｒｎｏｎｌｉＦｌｔＥ５ｏｅｅｎｙｓｉｒａ
苏氛酸一般由直接发醉法、蛋白水解法、化学合成法生产，发酵法是采用葡萄糖和淀粉为原料，经发酵后再精制提取得到成品。本文利用ＯＡ试荆对苏氨酸进行柱前衍生化Ｐ后在特定的紫外波长下产生吸收而进行侧定。１仪器和试药Ａｌｌ。高效液相色谱仪，Ｐ。ｌｔｇｎｌｅＯＡ衍生化试剂（１勺－ｅｌ公司提供；６￣３３）翻酸缓冲液试荆（ｎｔｔｎ５１３５，０掩ｅ公司ｎ提供，６￣３３）磷酸二氢钠和氮氧化钠（５１３，ｏ９分析纯，天津市永大化学试剂公司提供）色谱纯甲醉和乙睛（，天津四友公司提供）苏氛酸纯品（，生化试剂，中国惠兴生化试剂有限公司

高效液相色谱法测定氨基酸

脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案1、仪器与试药1.1 仪器1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国）1.2 药品与试剂16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。

脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。

批号：2013、2013、2013.乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。

2、方法与结果2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。

）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。

2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表所示的混合溶液。

取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。

高效液相色谱法测定氨基酸的研究进展

高效液相色谱法测定氨基酸的研究进展赫欣睿;武中庸;叶永丽;高旭东;陈士恩;马忠仁【摘要】氨基酸是构成生物体的基础物质,氨基酸分析是生命科学研究中最重要的领域之一.高效液相色谱法因分析速度快、操作简便、检测灵敏、适用范围广等优点而广泛应用于食品工业、制药工业、生命科学研究等领域.该文综述了高效液相色谱分析氨基酸的方法,包括柱后衍生法、柱前衍生法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法和高效液相色谱-蒸发光散射检测法.并对上述方法进行了比较,为日常的氨基酸分析提供了参考.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2016(035)007【总页数】7页(P922-928)【关键词】氨基酸;高效液相色谱法(HPLC);柱前衍生;柱后衍生;综述;研究进展【作者】赫欣睿;武中庸;叶永丽;高旭东;陈士恩;马忠仁【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124【正文语种】中文【中图分类】O657.72;O629.7氨基酸是构成蛋白质大分子的基础物质，与生命活动息息相关。

目前，自然界中发现的氨基酸约有300种，而组成生物体蛋白质的氨基酸约有20种。

氨基酸分析在生物化学、食品科学、临床医学、饲料科学、化工等领域具有重要作用，因此改进和发展氨基酸的分析方法对于人类具有重要意义。

高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展的新型分离分析技术，具有分离效能高、速度快、操作简便、检测灵敏度好、对样品适用范围广等特点，已广泛应用于各领域。

高旭东等[1]建立了黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的高效液相色谱检测方法。