Flow Cytometry (081028)
流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪（Flow Cytometry）1 流式细胞仪的概念及其成长汗青1．1 流式细胞仪的根本概念流式细胞仪（flow cytonletry,FCM）是对高速直线流淌的细胞或生物微粒进行快速定量测定和剖析的仪器,重要包含样品的液流技巧.细胞的计数和分选技巧,盘算机对数据的收集和剖析技巧等.流式细胞仪以流式细胞术为理论基本,是流体力学.激光技巧.电子工程学.分子免疫学.细胞荧光化学和盘算机等学科常识分解应用的结晶.流式细胞术是一种主动剖析和分选细胞或亚细胞的技巧.其特色是：测量速度快.被测群体大.可进行多参数测量,即对统一个细胞做有关物理.生物化学特点的多参数测量,且在统计学上有效.1．2 流式细胞仪的成长简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年,Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管,在亮视野下用显微镜进行计数,并用光电记载装配测量的假想.1953年Crosland-Taylor依据牛顿流体在圆形管中流淌纪律设计了流淌室.厥后又经由Coulter.Parker & Horst.Kamentsky.Gohde.Fulwyler.Herzenberg等人的不竭改良,设计了光电检测装备和细胞分选装配.完成了盘算机与流式细胞仪的物理衔接及多参数数据的记载和剖析.首创了细胞的免疫荧光染色及检测技巧.推广流式细胞仪在临床上的应用.近20年来,跟着流式细胞仪及其检测技巧的日臻完美,人们越来越致力于样品制备.细胞标识表记标帜.软件开辟等方面的工作,以扩展FCM的应用范畴和应用后果.宋平根的《流式细胞术的道理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技巧阐述的最为详尽和透辟的中文著作.这本书平常具体地介绍了流式细胞术的汗青.构造.道理.技巧指标等,例举了其在医学和生物工程中的应用,平常合适从事此方面专业研讨的人.因为这本书是13年前出版的,所以根本上没有涉及植物流式细胞仪检测技巧.此外对于只须要对流式细胞仪有些根本熟悉的人士来说,这本书太庞杂太深邃.谢小梅重要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用.杨蕊归纳分解了流式细胞仪的工作道理,简略说起了流式细胞仪的应用.本文在剖析这三篇论著或文章的优缺陷后,用比较通俗的说话介绍了控制流式细胞仪检测技巧必须懂得的一些道理,并对今朝市场上的主流型号进行了客不雅的机能归纳分解.2 流式细胞仪的工作道理和技巧指标2．1 流式细胞仪工作道理除电源外,流式细胞仪重要由四部分构成：流淌室和液流体系：激光源和光学体系;光电管和检测体系;盘算机和剖析体系,个中流淌室是仪器的焦点部件.这四大部件配合完成了旌旗灯号的产生.转换和传输的义务.流淌室和液流体系流淌室由样品管.鞘液管和喷嘴等构成,经常应用光学玻璃.石英等透明.稳固的材料制造.设计和制造均很精致,是液流体系的心脏.样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力感化下从样品管射出;鞘液由鞘液管从周围流向喷孔,包抄在样品外周后从喷嘴射出.为了包管液流是稳液,一般限制液流速度υ<10m/s.因为鞘液的感化,被检测细胞被限制在液流的轴线上.流淌室上装有压电晶体,受到振荡旌旗灯号可产生振动.激光源和光学体系经特异荧光染色的细胞须要合适的光源照耀激发才干发出荧光供收集检测.经常应用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为广泛,也有配和氪离子激光器或染料激光器.光源的选择重要依据被激发物质的激发光谱而定.汞灯是最经常应用的弧光灯,其发射光谱大部分分散于300～400nm,很合适须要用紫外光激发的场合.氩离子激光器的发射光谱中,绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强,约占总光强的80%;氪离子激光器光谱多分散在可见光部分,以647nm较强.免疫学上应用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上,可应用染料激光器.将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱产生转变以顺应须要即构成染料激光器.例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm中断可调的激光,尤在590nm处转换效力最高,约可占到一半.为使细胞得到平均照耀,并进步分辩率,照耀到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径邻近.是以需将激光光束经透镜会聚.光斑直径d可由下式肯定：d=4λf/πD.λ为激光波长;f为透镜焦距;D为激光束直径.色散棱镜用来选择激光的波长,调剂反射镜的角度使调谐到所须要的波长λ.为了进一步使检测的发射荧光更强,并进步荧光讯号的信噪比,在光路中还应用了多种滤片.带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或经由过程.例如应用525nm 带通滤片只许可FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光经由过程.长波经由过程二向色性反射镜只许可某一波长以上的光线经由过程而将此波长以下的另一特定波长的光线反射.在免疫剖析中常要同时探测两种以上的波长的荧光旌旗灯号,就采取二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各类荧光离开.光电管和检测体系经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是经由过程光电转换器转变成电旌旗灯号而进行测量的.光电倍增管（PMT）最为经常应用.PMT的响应时光短,仅为ns数量级;光谱响应特点好,在200～900nm的光谱区,光量子产额都比较高.光电倍增管的增益从10到10可中断调节,是以对弱光测量十分有利.光电管运行时特殊要留意稳固性问题,工作电压要十分稳固,工作电流及功率不克不及太大.一般功耗低于0.5W;最大阳极电流在几个毫安.此外要留意对光电管进行暗顺应处理,并留意优越的磁屏障.在应用中还要留意装配地位不合的PMT,因为光谱响应特点不合,不宜交换.也有效硅光电二极管的,它在强光下稳固性比PMT好.从PMT输出的电旌旗灯号仍然较弱,须要经由放大后才干输入剖析仪器.流式细胞计中一般备有两类放大器.一类是输出旌旗灯号辐度与输入旌旗灯号成线性关系,称为线性放大器.线性放大器实用于在较小规模内变更的旌旗灯号以及代表生物学线性进程的旌旗灯号,例DNA测量等.另一类是对数放大器,输出旌旗灯号和输入旌旗灯号之间成经常应用对数关系.在免疫学测量中常应用对数放大器.因为在免疫剖析时常要同时显示阴性.阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1～2个数量级;并且在多色免疫荧光测量中,用对数放大器收集数据易于说明.此外还有调节便当.细胞群体散布外形不轻易受外界工作前提影响等长处.盘算机和剖析体系经放大后的电旌旗灯号被送往盘算机剖析器.多道的道数是和电旌旗灯号的脉冲高度相对应的,也是和光旌旗灯号的强弱相干的.对应道数年纵坐标平日代表发出该旌旗灯号的细胞相对数量.多道剖析器出来的旌旗灯号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件,或存贮于盘算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备挪用.盘算机的存贮容量较大,可存贮统一细胞的6～8个参数.存贮于盘算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处理和剖析,最后给出成果.除上述四个重要部特殊,还备有电源及紧缩气体等附加装配.2．1．1 旌旗灯号的产生.转换和传输在压力感化下,鞘液管中的鞘液被中断不竭地压入流淌室,形成一股稳固地中断的液流,包管了样本液稳固地处于鞘液液流的轴线上,并以单个细胞情势直线经由过程激光照耀区.激光照耀区又称测量区,是指液流与激光束垂直订交的点.当细胞携带荧光素标识表记标帜物（每种物质携带的标识表记标帜物不合吗?）经由过程激光照耀区时,产生代表细胞内部不合物质.不合波长的荧光旌旗灯号,这些旌旗灯号以细胞为中间,向空间360°立体角发射,产生散射光和荧光旌旗灯号.散射光不依附任何细胞样品的制备技巧,是以被称为细胞的物理参数或固有参数.散射光又包含前向角散射和测向角散射.前向角散射与被测细胞直径的平方亲密相干,测向角散射光对细胞膜.胞质.核膜的折射率更迟钝,可供给有关细胞内精致构造和颗粒性质的信息.荧光旌旗灯号也有二种;一种是细胞自身在激光照耀下发出的微弱荧光旌旗灯号,另一种是经由特异荧光素标识表记标帜后的细胞受激发照耀后得到的荧光旌旗灯号.在免疫剖析中常要同时探测两种以上波长的荧光旌旗灯号,就采取二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各类荧光离开.经荧光染色的细胞受到合适的光激发后产生的荧光是经由过程光电转换器转变成电旌旗灯号而进行测量的.最经常应用的光电转换器是光电倍增管（PMT）.从PMT输出的电旌旗灯号须要经由放大后才干输入剖析仪器.流式细胞仪中一般备有两类放大器.一类是线性放大器,其输出旌旗灯号与输入旌旗灯号成线性关系.线性放大器实用于在较小规模内变更的旌旗灯号以及代表生物学线性进程的旌旗灯号,如DNA测量等.另一类是对数放大器,其输出旌旗灯号和输入旌旗灯号之间成经常应用对数关系.在免疫学测量中常应用对数放大器.放大后的电旌旗灯号被传送到盘算机,再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件,保管在盘算机上.保管在盘算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和剖析.参数（例如：细胞的大小.形态.质膜和细胞内部构造）测量道理流式细胞仪可同时进行多参数测量,信息重要来自特异性荧光旌旗灯号及非荧光散射旌旗灯号.测量是在测量区进行的,所谓测量区就是照耀激光束和喷出喷孔的液流束垂直订交点.液流中心的单个细胞经由过程测量区时,受到激光照耀会向立体角为2π（360°）的全部空间散射光线,散射光的波长和入射光的波长雷同.散射光的强度及其空间散布与细胞的大小.形态.质膜和细胞内部构造亲密相干,因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射.折射等光学特点有关.未遭遇任何破坏的细胞对光线都具有特点性的散射,是以可应用不合的散射光旌旗灯号对不经染色活细胞进行剖析和分选.经由固定的和染色处理的细胞因为光学性质的转变,其散射光旌旗灯号当然不合于活细胞.散射光不但与作为散射中间的细胞的参数相干,还跟散射角.及收集散射光线的立体角等非生物身分有关.在流式细胞术测量中,经常应用的是两种散射偏向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）;②侧向散射（SSC）,又称90角散射.这时所说的角度指的是激光束照耀偏向与收集散射光旌旗灯号的光电倍增管轴向偏向之间大致所成的角度.一般说来,前向角散射光的强度与细胞的大小有关,对同种细胞群体跟着细胞截面积的增大而增大;对球形活细胞经试验标明在小立体角规模内根本上和截面积大小成线性关系;对于外形庞杂具有取向性的细胞则可能差别很大,尤其须要留意.侧向散射光的测量重要用来获取有关细胞内部精致构造的颗粒性质的有关信息.侧向散射光固然也与细胞的外形和大小有关,但它对细胞膜.胞质.核膜的折射率更为迟钝,也能对细胞质内较大颗粒给出敏锐反应.在现实应用中,仪器起首要对光散射旌旗灯号进行测量.当光散射剖析与荧光探针结合应用时,可辨别出样品中被染色和未被染色细胞.光散射测量最有效的用处是从非均一的群体中辨别出某些亚群.荧光旌旗灯号重要包含两部分：①自觉荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照耀后所发出的荧光;②特点荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照耀激光不合.自觉荧光旌旗灯号为噪声旌旗灯号,在多半情形下会干扰对特异荧光旌旗灯号的分辩和测量.在免疫细胞化学等测量中,对于结合程度不高的荧光抗体来说,若何进步信噪比是个症结.一般说来,细胞成分中可以或许产生的自觉荧光的分子（例核黄素.细胞色素等）的含量越高,自觉荧光越强;造就细胞中逝世细胞/活细胞比例越高,自觉荧光越强;细胞样品中所含亮细胞的比例越高,自觉荧光越强.削减自觉荧光干扰.进步信噪比的重要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料;②选用合适的激光和滤片光学体系;③采取电子抵偿电路,将自觉荧光的本底进献予以抵偿.2．1．2 流式细胞仪分选道理其实不是所有的流式细胞仪都具有分选功效.流式细胞仪的分选功效是由细胞分选器来完成的.由喷嘴射出的液流柱在电旌旗灯号感化下产生振动,断裂形成平均的小液滴.依据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,尔后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞经由过程静电场而产生偏转,落入收集器中.应用不合孔径的喷孔及转变液流速度,可能会转变分选后果.从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电须要一段延迟时光.精确测定延迟时光是决议分选质量的症结,可依据具体请求进行恰当调剂.2．1．3 数据的显示和剖析数据处理重要包含数据的显示和剖析.单参数直方图是应用最多的图形显示情势,既可用于定性剖析,又可用于定量剖析.单参数直方图是由X.Y二偏向构成的二维平面图.横座标X是所测的荧光或散射光的强度,用“道数”（Channel No．）来暗示.选择的放大器类型不合,标度不合.纵座标Y平日暗示被测细胞的绝对数量.正常情形下,数据剖析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图.对曲线图的说明应当具体问题具体剖析.除直方图外,数据显示方法还包含二维点图.二维等高图.假三维图和列表模式等.二维点图也是比较经常应用的数据显示类型.它显示两个自力参数与细胞相对数之间的关系,也是二维平面图,横纵坐标可以依据本身选定的被测参数自行决议,点的地位标清晰明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值.二维点图所供给的信息量要大于单参数直方图.数据剖析的办法大体可分为参数法和非参数法两大类.当被检测的生物学体系可以或许用某种数学模子时则多应用参数办法.非参数剖析法不必对显示的图像做任何假设,也不采取数学模子,剖析程序可以很简略,也可能很庞杂.临床医学较常应用非参数剖析法. 2．2 流式细胞仪机能的技巧指标流式细胞仪机能的技巧指标重要有荧光分辩率.荧光敏锐度.实用样品浓度.分选纯度等.荧光分辩率是指分辩两个相邻峰的最小距离,通经常应用变异系数（CV 值）来暗示.如今市场上主流型号出厂时的荧光分辩率应当小于2.0%.荧光敏锐度反应了仪器探测最小荧光光强的才能.一般用荧光微球上可测出的FITC的起码分子数来暗示.今朝仪器均可达到1000阁下.仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml.剖析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可剖析或分选的颗粒数量.一般剖析速度为5000～10000,分选速度控制在1000以下.流式细胞仪测量的数据是相对值,是以须要在应用前对体系进行校准或标定.流式细胞仪的校准有二个目标,即仪器的准直调剂和定量标度.平日应用尺度微球作为非生物学尺度样品,鸡血红细胞做为生物学尺度样品.3 主流流式细胞仪型号及其特点介绍今朝失去市场较大份额的公司是美国的BD（Becton-Dickinson）公司.Beckman-Coulter公司（原名称Coulter）和德国的Partec 公司.3．1 BD公司流式细胞仪介绍BD公司临盆的流式细胞仪都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter）,即荧光激活细胞分选器.其型号种类比较齐备,如早期的FACSort.FACS Canto.FACSean.如今市场上供给的型号有五种：FACSCount（小型流式细胞仪）.FACS CAlibur（流式细胞仪）.FACSA ria（流式细胞分选仪）.FACSV antage SETM（多色剖析和高速分选流式细胞仪）.LSR II（数字化剖析型流式细胞仪）.FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3,CD4,CD8绝对数而设计的.FACSCalibur是全主动多色流式体系,侧重于临床,其整体设计帮忙临床大夫快速实现通例免疫表型.CD4T细胞计数.DNA.网织红细胞.血小板等临床剖析,兼具分选功效.配备有二根激光管,可同时检测4个荧光参数.可辨认粘联细胞.BD FACSA ria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪,获取速度达70,000细胞/s,剖析速度达50,000/s.应用石英杯流淌检测池固定光路校准技巧.应用三种激光,多色剖析,剖析参数可达15色.两管或四管分选,可以应用多种规格的收集管.液流监测体系白动监测液流断点,检讨堵塞,实现了细胞分选的无人操纵.配件BDACDU装配,可以在微孔板或载波片上定量分选细胞.FACSV antage SETM是在FACSV antage的细胞分选功效基本上推出的分选加强型流式细胞仪.六色荧光剖析体系,点对点分选,设置装备摆设FACS Diva数字化体系,供给周全的配套试剂.速度和功效优于FACSV antage.BD LSR II是LSR的数字化进级版,其机能介于FACSV antage SE 和FACS Calibur之间,是专为性命科学研讨设计的台式机.配备固定校准的紫外激光,四种激光立体空间激发.十色荧光同时剖析.电子体系数字化.比较易学易用.3．2 Beckman-Coulter公司流式细胞仪介绍Beckman- Coulter 公司临盆的流式细胞仪以Profile（早期,现已停产）和EPICS系列为代表,近年又推出了Cytomics FC500系列.EPICS系列是大型流式细胞仪,今朝市场上有XL.XL-MCL和ALTRA三种型号,个中ALTRA具有分选功效,实用于免疫学.细胞心理.分子生物学.遗传学.微生物学.水质剖析和植物细胞剖析.Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小,可主动进行5种色彩的剖析,实用于免疫学检测,如人类HIV诊断.特殊是FC500MPL的奇特设计可以在统一体系上应用12×75mm的离心管和24或96孔的平板.特殊合适工作量大的试验室.这二个公司重要针对医学研讨和临床工作进行设计和临盆,其产品可应用于生物医学基本研讨以及临床检测的很多范畴,如遗传.肿瘤.血液.免疫等诸多研讨中红细胞.T细胞.淋巴细胞亚群测定.检测早期细胞凋亡.肿瘤细胞免疫测定等.这二个公司的流式细胞仪价钱昂贵,我国重要购置.应用的单位根本上都是一些医疗机构. 3．3 Partec公司流式细胞仪介绍与BD和Becman-Coutler公司的产品比拟,德国Partec公司临盆的流式细胞仪的配合特色是体积小,造价低,易操纵,便于携带,合适植物学研讨,合适遥远地区和成长中国度.德国Partec公司的产品分为三类：CCA家族.PAS 家族和CyFlow家族（Galaxy为早期产品,已停产）.CCA家族包含细胞计数剖析仪CCA和倍性剖析仪PA-I.它是单或双参数的台式小型机,可以进行一些通例剖析,如核DNA测定（检测倍性或细胞周期）.细胞计数.细胞凋亡.它的特色是体积小,易操纵,价钱低,检测规模广,可以检测多种荧光素（如PI.DAPI.Fluorescein）发出的荧光.PAS家族包含粒子剖析体系PAS.粒子剖析体系III （PAS-III）和倍性剖析仪PA-II.供给三种激光器的三种组合,可检测十余种荧光染料.最多可检测和记载八个自力荧光参数.倍性剖析仪PA可以或许在2分钟内主动测量植物的倍性程度,检测异倍体.可以对叶片.幼苗.种子.果皮.根.花等植物质料进行剖析.在大多半植物中,异倍体染色体的检测分辩率为±1条染色体.PA-I 应用HBO-100汞灯,属于弧光灯,可产生紫外激发光和蓝光.PA-II 中增长了488nm氩离子激光器,可以或许检测几乎所有的荧光染料,如DAPI,Hoeehst,PI,EB,MMC,FITC,FDA等.汞灯发光是电流经由气体时,气体电离产生的.它能供给最佳的激发波长.CyFlow（R）SL配备三种激光管,可应用于诸如人类健康.微生物学.工业应用.进程控制.生态学等研讨.如HIV扫描中免疫标识表记标帜细胞计数.食物处理进程中的微生物计数.细胞凋亡等.它应用l2 V直流电,特殊合适遥远地区和成长中国度.国际上20世纪80年月开端将流式细胞仪检测应用到植物的研讨中（Galbraith,1983）,浩瀚学者都以为流式细胞仪是一种精确.快速的检测DNA含量的办法（Michaelson,1991）.应用规模主如果应用流式细胞仪研讨属内.属间多栽种物的DNA含量（Baird,1994;Jacob,1996;HALL,2000）和倍性程度（Costich,1993;Meng,2002）.检测体细胞杂种（Pfosser,1995;Keller,1996）和游离小孢子造就再生株（Kim,2003）的DNA含量.曩昔我国应用这一检测技巧的植物研讨工作者寥若晨星,且大多是在国外试验室完成的.研讨内容包含植物心理.程序性逝世亡.倍性判定等.植物研讨中应用的流式细胞仪根本上都是Partec公司的产品,也有少量是BD公司临盆的流式细胞仪.BD公司的产品重要定位于医学研讨与应用,与Partec产品比拟,不太合适从事植物染色体倍性的判定.重要表如今不克不及供给植物样品制备技巧/试剂,数据获取软件可同时检测到的倍性数量少.鉴于今朝我国科研院所中应用较多的是BD公司临盆的流式细胞仪,鄙人一篇中将会对应用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技巧和技能做具体陈述.若何选择流式细胞仪自七十年月消失第一代流式细胞仪以来,跟着盘算机技巧.电子制造技巧.激光技巧及荧光素合成技巧的不竭成长,现代流式细胞仪已今非昔比,制造工艺.功效.精确度有了质的飞跃.流式细胞仪临盆厂商推出各类不合型号的流式细胞仪来知足用户的不合须要.现临盆流式细胞的厂商全球至少有六家,各厂商产品又有不合的系列,各具特色.若何从浩瀚的型号中遴选出最合适本身的机型,我们还需从剖析应用动身,评估本身的需求来决议什么样的流式细胞仪最具性价比.最合适本身.⑴.DNA倍体剖析DNA剖析是流式细胞仪最初且是如今应用最广检测项目.因为恶性细胞DNA含量平日与正常细胞不合,消失异倍体细胞,所以现有很研讨评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系.DNA含量检测还可供给细胞周期方面的信息,这在细胞生物学中应用很广泛.特殊地,它可暗示出细胞毒性药物对细胞感化进程.这些DNA检测还可与细胞概况标记物标识表记标帜同时进行,如许在细胞混杂造就中,可平日追踪表达特异标记物的细胞显示其发展周期情形.所有办法都是基于染料能与核酸起特异的化学反响并发射出荧光,经常应用的染料为PI,DAPI.流式细胞仪请求：488nm光源,575nm滤光片.⑵.细胞生计才能试验应用Heochest 33342染料与DNA特异性结合,后因细胞活气不合,。
流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪(FloｗCytometｒｙ)1 流式细胞仪得概念及其发展历史1。
1 流式细胞仪得基本概念流式细胞仪（flｏw cｙtｏnleｔｒy,FＣM)就是对高速直线流动得细胞或生物微粒进行快速定量测定与分析得仪器，主要包括样品得液流技术、细胞得计数与分选技术,计算机对数据得采集与分析技术等。
流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，就是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学与计算机等学科知识综合运用得结晶。
流式细胞术就是一种自动分析与分选细胞或亚细胞得技术。
其特点就是:测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量,即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性得多参数测量,且在统计学上有效。
１。
2 流式细胞仪得发展简史最早得流式细胞仪雏形诞生于19３４年，Moｌｄavan提出使悬浮得单个血红细胞流过玻璃毛细管,在亮视野下用显微镜进行计数,并用光电记录装置测量得设想。
1953年Crosｌand-Tayｌor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。
其后又经过Ｃｏulteｒ、Parｋer ＆ Hoｒst、Kａmentsky、Ｇohde、Fulｗyｌeｒ、Herｚｅｎberｇ等人得不断改进,设计了光电检测设备与细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪得物理连接及多参数数据得记录与分析、开创了细胞得免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上得应用。
近２0年来,随着流式细胞仪及其检测技术得日臻完善,人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面得工作,以扩大FＣＭ得应用领域与使用效果。
宋平根得《流式细胞术得原理与应用》就是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述得最为详尽与透彻得中文著作.这本书非常详细地介绍了流式细胞术得历史、结构、原理、技术指标等,例举了其在医学与生物工程中得应用,非常适合从事此方面专业研究得人。
由于这本书就是13年前出版得，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。
此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识得人士来说,这本书太复杂太深奥。
流式细胞仪1
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散射光信号
• 前向角散射光（FSC,Forward
Scatter）入射激光的同向 散射光信号。细胞相对大小及其表面积。 • 侧向角散射（SSC, Side Scatter）入射激光90°角的散 射光信号。细胞粒度及细胞内相对复杂性。
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前向散射光
侧向散射光
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散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形 态上的差异
经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电 转换器（光电倍增管（PMT）最为常用）转变成电信号而进行测量 的。
•
• 流式细胞计中一般备有两类放大器：一类是线性放大器。线性 放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的 信号，例DNA测量等。另一类是对数放大器。在免疫学测量中常使 用对数放大器。
样品管 鞘液管
喷 嘴
7
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2.激光源& 光学系统
1.由激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜组、滤片 和光电倍增管组成。 2.常用的光源有弧光灯和激光。汞灯：300～400nm；氩 离子激光器： 514nm绿光& 488nm蓝光；氪离子激光器 光谱：可见光，647nm较强。
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流式细胞仪光信号
散色光信号 荧光信号
• 等高线越密集表示细胞数变化率越大
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设门分析技术
1.Gate设置：指根据该图的细胞群分布组选定其中想要分析 的特定细胞群 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意性门和十字门。
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区域（Region设置）：
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23
24
25
数据的显示和分析
参数：FS, SS, FL
数据显示方式（单参数直方图、双参数散点
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
FL1
FL2
散点图和伪彩图
等高图和密度图
等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里 面的曲线代表细胞数目越多。
散点图(Dot Plot) 伪彩图(Pseudo-color Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot)
• 三维图(3D Plot)
直方图 Histogram
细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号 或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细 胞数。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
……
每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为 5×10000（字或双字）。
流式数据的显示方式
• 常用分析软件
流式细胞术详解
流式细胞术详解加入时间：2004-12-27 来源：编辑：科泰生物一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
抗体的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适
用范围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测
数据显示方式
单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图
流式常见图形 (Histogram Plot)
流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4
第四节 凋亡检测
1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染 色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡 细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释 放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的 固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解 的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少， 成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡 细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影 响结果的准确性。 可参看文章： /content/cell/20040914791.htm /content/cell/20040914792.htm
2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干 细胞移植及基因治疗方面的检测。 3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞 性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现 活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如 果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的 原因为血小板破坏过多所致。
4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） 的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发 生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成 障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的 GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的 主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞 或WBC上出现CD55或/和CD59的减少， 可诊断为PNH。
flow cytometry流式细胞术原理及树突状细胞的检测 苏州大学
Single cells sorted into test tubes
信号
荧光信号 FL1，FL2，FL3， FL4 线性，对数
散射光信号 前向散射光(FS)： 细胞大小 侧向散射光(SS)： 结构复杂程度
直方图(HISTOGRAM)与 点图(DOT PLOT)
FL2 COUNT
FL
只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
White Light Source
Transmitted Light
620 -640 nm Light
二向色性滤片 DICHROIC FILTER
一定波长以上通过，该波长以下折射
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg
HISTOGRAM
பைடு நூலகம்FL1
DOT PLOT
GATE设门
界定分析区域：REGION
十字门：QUA
矩形门：REC
A
自由门：AMO
线性门：LIN
A
A
建立直方图之间的关系
方案PROTOCOL
选定参数 构建直方图 区域，GATE， 停止，存储，打印 放大倍数，阈值，流速。。。。
免疫荧光(IMMUNOPHENITYPING) 单标记
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5
488
675
免疫荧光 深红
PI
流式细胞仪FlowCytometry-中原大学奈米科技中心
3-2654537)
奈米科技中心流式細胞儀使用暨管理細則
1、儀器名稱：
中文名稱：流式細胞儀（設備類別：A）（開放類別：B）
英文名稱：Flow Cytometry
2、 設備廠牌、型號：
廠牌：BD (美商必帝)
型號：FACS Calibur
3、服務項目：
細胞週期分析、細胞凋亡分析
4、樣品之製備：
研究人員自行準備分選檢體，濃度需1 x 106/ml的細胞懸浮液
8.樣品製備請澄清透明，細胞或細菌數不可過多，若發現偵測通道塞住，該
名人員記違規一次，累犯三次者，該實驗室停權一個月。
9.當天使用者需於儀器使用完後一小時內繳回儀器USB，超過一小時者多算
一個時段，並計違規一次，累犯三次者，該實驗室停權一個月。
10.每年公告考試一次，已報名者若於考試時間未到，則該次考試費用不退費，並於下次公告考試時間繳費重考。
3.請勿隨意更改儀器參數設定，如有疑問請洽詢OP。
4.樣品測試中或完畢時，若有異狀請聯絡儀器OP確認儀器之狀況。
5.擁有操作執照者，若以不當程序操作儀器，導致儀器損壞者，以停權一個月處置並且由該研究生與所屬實驗室負責賠償全部損失。
6.嚴禁專題生自行操作儀器，違反者，以停權該實驗室一個月處置。
7.儀器預約單請寫明樣品名稱與測試條件，並於七天前交至工學816。
3.本系統服務以一小時為1單元。
4.本儀器目前暫不對外開放。
5.預約後欲取消須於三天前之前告知，違者當天停止使用並照常計費。
6.預約未到且未取消累積三次者，所屬人員及實驗室停止預約資格兩個月。
6、儀器使用須知：
1.本設備經考核認證開放自行操作。
2.操作之人員必須切實的填寫操作手冊，內容包括：操作時間及儀器狀況，如有違規以次數累計，累積超過兩次者予以停權一個月。
流式细胞术简介
FCM是集现代电子物理技术、激光技术、电 子计算机技术和流体力学等于一身的高科技仪器， 开创了荧光技术的又一个崭新的领域。 近年来，此项技术发展十分迅速。具有更高灵 敏度、更高分辨率、双激光、多荧光参数分析的仪 器不断问世，并在朝着经济实用、操作简便、小巧 精制、自动化程度高的方向发展。 确信，流式细胞分析技术进一步与其它技术的 结合，将极大的推动生物医学的发展。
FACS Vantage DiVa
FACSAria
The BD FACSAriaTM cell sorter sets a new standard for high performance flow cytometry. Based on a revolutionary new design in instrumentation, this easy-to-use benchtop system delivers high-speed sorting and multicolor analysis.
BD公司自从1974年第一台商用流式细胞仪问世一直致力 于流式细胞仪的创新。 BD FACSCanto™ benchtop flow cytometer继承了这个传统。它的主要特这是： 1. 真6色容纳能力——从少量的样品量中获取每个细胞更 多的信息。 2. 敏感性(<50 MESF PE, <100 MESF FITC*) ——解决最 微弱的events。 3. 快速(10,000 events/sec) — 加速稀少事件的获取。 4. Low carryover (<0.1%) — 使样品污染最小化。 5. 更换透镜键盘化 —不用工具更换滤光片。 6. Fixed optical alignment — 免除用户调节。 7. 日常管理自动化 — 为科研节约更多时间。
流式细胞仪FlowCytometry原理简介
核酸：DNA含量，DNA成分，DNA合成，RNA，染色质结构等
总蛋白质 蛋白质分子间相互作用 抗原
细胞骨架成分
受体
功能属性： 酶活性 细胞凋亡 细胞坏死 细胞活性 氢硫基 凝血素结合位点
药物动力学 ……………………..
●FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，并对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
显微镜
静止的细胞样本
数量大
数量少
高速分选
样本难以再利用
细胞群体特征量分布 可以揭示细胞内部结构信息
64839306 或 ： 64862503 电子邮件 lcc@
Y 18
14
15
21 20
16 17
19 Ph 22
9-12
白血病患者
Chromomycin A3 （GC）
生物物理所现有流式细胞仪
型号：BD FACSVantage SE
参数：分析10，000个/ 秒，分选7，000个/秒； 激光：488nm，UV；四 色荧光通道。
地点：1406 联系方式：电话
流式细胞仪（Flow Cytometer) 基础简介
中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台
2005年3月 刘春春
主要内容
流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象
什么是流式细胞仪
●流式细胞仪实物
医学免疫学实验：流式细胞术(Flow Cytometry)的原理及应用
光谱重叠（Spectral overlap）
补偿模型图
FL2
补偿调节前后对比
FL1
数据收集和分析
1 画图（直方图，散点图） 2 寻找目标细胞 3 调整仪器设置到合适的状态 4 我们可以得到怎样的结果？
它们意味着什么？
数据分析
• 设门 • 设定阴性与阳性群体的界限 • 确定阳性与阴性细胞群体 • 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，
流式细胞仪的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
Part IV
流式细胞术实验操作 流程及数据分析
流式细胞术操作流程
流式细胞术
✓ 调整仪器设置 ✓ 收集数据 ✓ 分析结果
课堂目标
• 了解流式细胞仪的构造、原理及应用，掌 握“门”，“补偿”两个基本概念。
• 学会简单分析流式数据：小鼠脾脏分离的 单个核细胞中CD3+、CD4+ 、CD8+细胞 的比例。
Content
✓流式细胞仪的简介 ✓流式细胞仪的组成及原理 ✓流式细胞术的应用 ✓流式细胞术实验操作流程
不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。
可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮或
贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。
样本类型
可检测颗粒大小
0.2μm
50μm
流式细胞仪能检测哪些信息?
➢ 相对大小: Forward Scatter (FSC)
• 2.染色：小心用枪去除上清，再加入50ul预混抗体的PBS（由助 教准备），将细胞吹打混匀，避光， 4℃或冰上，染色1520min
流式细胞技术与图像处理PPT课件
流式细胞的基本信息: “形态”
24
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同 的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
25
流式细胞的主要信息:Fluorescence
FL1 FL2 FL3 FL4
最常用的标记方法是荧光素分子标记 的抗体与细胞抗原结合
鞘液
鞘液
细胞流
激光照射点 流体动力学聚焦示意图
12
液流驱动系统
13
进样速率控制
• 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并 不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。
• 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细 胞数就增加，这样会导致变异系数增加。
14
光学系统
激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。
➢自动化程度高
➢操作简便
➢使用寿命长
➢配备1-2根激光
➢细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
6
FACSAria Ⅲ
科研型分选流式细胞仪
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和 类型激光器
➢可将感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
➢适用于高速分选 和多色分析
7
FACS Vantage DiVa
伪彩图
30
Counts SSC →
假三维图和三维图
31
等高图和密度图
等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目 相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。
密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方 细胞少。
32
设门与数据分析
流式细胞仪
H L
A
D
r
CD117
CD38
CD117 CD117
5
Side Scatter
Forward Scatter
DNA Analysis
Forward Scatter Fluorescence
Forward Scatter
FALS
Fluorescence
FLUORESCENCE
Side Scatter
散射光 信号
侧向角散 射(SSC)
不依赖任何细 胞样品的制备 技术
对细胞膜、细胞质、核膜 的折射率敏感，可提供细 胞内精细结构和颗粒性质 的信息
z 信号检测与存贮、显示、分析系统
荧光信号
依赖细胞样品 的制备技术
细胞自发荧光： 细胞自身发出的微弱荧 光信号
细胞标记荧光： 经过特异荧光标记物标 记，受激发照射得到的 荧光信号，对其进行检 测和定量分析可对样品 细胞进行定性、定量分 析。
流式细胞仪（Flow Cytometer)
流式细胞仪是一种新型高科技仪器，涉及的技术有： 激光技术、流体力学技术、电子物理技术、光电测量 技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗 体技术等。
应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞 或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的 技术称为流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）。
荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量， 主要用于对DNA倍体测量。
z 荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 DNA的含量。
z 当形状差异较大，而DNA含量相等的两个细胞得 到的荧光脉冲高度不等时，对荧光信号积分后， 所得到的信号值相等。
荧光信号的宽度：用于区分双连体细胞。
流式细胞仪的参数
一、 流式细胞术的原理
流式细胞术(FCM, Flow Cytometry):是对单个细胞或其他生
物微粒进行快速定性, 定量分析与分选的一门技术。
FCM是利用流式细胞仪(Flow Cytometer)分析在高压高速下 通过样品孔径的单个细胞, 在激光束的照射下的发出的散射光
和与细胞表面结合的荧光标记的单抗的荧光信号。
并激发 后会有发射波长, 流式细胞仪检测的即是它 特定的发射波长。
利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测) 这些光学信号。
常用荧光染料
LASER FITC 488 520 PE 575 ECD PI 615 620 PC5 665
<390 l
400-450 l
450-500 l
500-570 l
4 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)
FITC PE(RD1) ECD PeCy5 488 488 488 488 525 575 620 675
用途
免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光
流式细胞仪与显微镜
FLOW
光源 对象 激光 细胞、生物粒子
MICROSCOPE
自然光、灯光、氙(汞)灯 细胞 光学信号 放大方式 PMT，放大电路
载(盖)玻片
形态及染色 目镜X物镜, 光学放大 人工，200 简单，单参数
统计 结果
计算机，>5000 多参数，综合分析
Log FITC Fluorescence (CD8)
三参数三维图
3-D Histograms
四 流式细胞仪在医学和生 物学中的应用 细胞生物学
流式细胞技术与图像处理
02
非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
03
实验标本的处理
细胞染色
染色要求： 特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚群 非特异反应水平低 抗体效价高，用量适用于常规标本 使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标记的抗体 采用适当的阴性对照物 抗体最适滴度
首选直接标记抗体
荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原
Annexin V Assay （建议用于悬浮细胞）
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。
在Ca2+存在时，Annexin V 与PS 有很高的亲和力，可与之迅速结合。PS 外翻发生在细胞核破裂、DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。
台式机 双激光四色，市场覆盖率最高
FACSAria Ⅲ
特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析
科研型分选流式细胞仪
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
鞘液
鞘液
细胞流
激光照射点
流体动力学聚焦示意图
液流驱动系统
进样速率控制
高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。
通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。
光学系统
激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。
flowcytometry
激光光源 光收集系统
电子系统
光电转换 数据处理系统
2020/6/22
中国科技大学生命科学实验中心
7
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
2020/6/22
中国科技大学生命科学实验中心
8
细胞被戴上特殊的标记。所用的标记细 胞的探针是能够同待分选细胞表面特征性 蛋白(抗原)结合的抗体，而这种抗体又能 够同某种荧光染料结合。被结合的细胞带 上了荧光标记。当稀释的细胞进入超声波 振荡器时，极稀的细胞悬浮液形成很小的 液滴，一个液滴中只含有一个细胞。液滴 一旦形成并通过激光束时，激光束激发结 合在细胞表面抗体分子。
18
Fluorescence Detectors
Laser
FALS Sensor
Freq
2020/6/22
Fluorescence
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Purdue University Cytometry Laboratories
中国科技大学生命科学实验中心
Shades of a color
2020/6/22
中国科技大学生命科学实验中心
32
Beads Provide a Flexible Platform
Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer
Multiple sizes
• 单细胞悬液的制备：胰酶消化 • 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 • 非特异结合的去除：洗涤和封闭
流式细胞仪
Th1细胞主要是CD4+细胞分泌IL-2、IL-12、IFN-g和TNFb/a等，主要介导细胞免疫应答。
Th2细胞主要是CD4+细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等， 主要介导体液免疫应答。
Tc1细胞主要是CD8+细胞分泌IFN-g、 IL-2、 IL-6和IL-10 等。
Tc2细胞主要是CD8+细胞分泌IL-2、 IL-4、IL-5、 IL-6和 IL-10等。
工作原理
•将经特异性荧光染料染色后的细胞放入样品管中， 细胞在气体的压力下进入充满鞘液的流动室, 在鞘 液的约束下细胞排成单列，并由流动室的喷嘴喷 出，形成细胞柱，通过激光器的照射激发出散射 光信号和荧光信号, 再由各自的激光检测器收集信 号, 经光电倍增管(PMT) 将信号放大, 转变为电信 号后由计算机系统进行分析.
BrdU细胞增殖检测
BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活 细胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选 择性整合到复制细胞中新合成的DNA中 （细胞周期S期）。这种掺入可以稳定存 在，随DNA复制进入子细胞中。BrdU 特 异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而 判断细胞的增殖能力。
树突状细胞检测:
自然杀伤细胞 （NK细胞）
淋巴细胞免疫表型分析
• 根据淋巴细胞的功能及膜表面标记，主要分 为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞三个亚 群，但三者在普通光学显微镜下不能区分， 血细胞分析仪也无法鉴别，只有用流式细胞 仪结合单克隆抗体技术才能准确分类计数淋 巴细胞亚群。
经常测定的淋巴细胞免疫标记包括： T淋巴细胞 ：CD3、CD4、CD8,
ELISA一次反应只检测一个指标。而CBA一次可 同时检测6-7个指标。
• CBA （Cytometric Bead Array)是利用一系 列荧光强度不同的微球，同时分析样本中 多种可溶成分的流式检测方法。
流式细胞术
流式细胞术流式细胞术(flow cytometry)是利用流式细胞仪(flow cytometer)快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术。
流式细胞仪通过接收激光照射后液流内细胞的散射光信号和荧光信号反映细胞的物理化学特征，如细胞的大小、颗粒度和抗原分子的表达情况等。
原理：流式细胞术是特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流,产生的光信号被多个接收器接收,一个是在激光束直线方向上接收到的散射光信号(前向角散射),其他是在激光束垂直方向上接收到的光信号,包括散射光信号(侧向角散射)和荧光信号。
液流中悬浮的直径从0.2~150μm的细胞能够使激光束发生散射光,细胞上结合的荧光素被激光激发后能够发射荧光。
散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收,根据信号的强弱波动就能反映出每个细胞的物理化学特征。
三大要素：流式细胞术有三大要素,分别为流式细胞仪、样品细胞和荧光染料或者荧光素偶联抗体。
流式细胞术是在流式细胞仪上操作的,流式细胞仪根据其功能的不同可以分为分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪,前者只能流式分析,不能分选纯化目标细胞,后者能够同时进行流式分析和流式分选。
检测对象：流式细胞术检测的对象是细胞,而且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞,即单细胞悬液。
流式细胞术不能直接检测组织块中的细胞，要检测脏器或组织中的细胞,必须先用各种方法将脏器或组织制备成单细胞悬液,然后标记上荧光素偶联抗体,才能被流式细胞仪检测。
流式细胞术不能直接检测分子,但是用人工合成的颗粒代替细胞,然后将该分子的抗体与人工颗粒结合，可以间接检测分子,如用CBA法检测细胞因子等。
流式细胞术可以定量检测样品细胞的物理化学特征,其定量是以光信号为基础的,通过分析接收到的激光照射到细胞后的散射光信号和荧光信号完成定量分析。
样品细胞只有标记荧光染料或者荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号,从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱情况等化学特征,否则只能通过分析散射光信号得到样品细胞体积大小和颗粒度等物理特征。
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白血病系列分化抗原
T淋巴细胞白血病:CD3,CD5,CD7. B淋巴细胞白血病:CD10,CD19,CD22. NK淋巴细胞白血病:CD16,CD56,CD57. 髓系白血病:CD13,CD14,CD33,MPO(髓过氧化物酶). 红白血病:GlyA(血型糖蛋白A). 巨核细胞白血病:CD41,CD42,CD61.
移动流式细胞分析
流式细胞分析分选系统
她就像……
一个光学高度计 一个磅秤 在入口处分发荧光棒 安装红光和绿光侦测计数器 让来客鱼贯进入 最后一个客人进入时资料也得到了
参考教材
2005－8－1
2005－8－1
流式细胞仪原理
发展历史，构造及原理和技术指标 工作原理 荧光素选择 补偿设置 注意事项
3. Electronic System
FS = 100
3. Electronic System
Lin
Log
4. Computer System: Data Display
Color Dot Plot
4. Computer System: Data Display
Histogram Plot
DNA含量及细胞周期分析
在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各个时期， DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核 酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以 得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%， S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖 活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、 核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分 期：G0、G1、S、G2、M, 用于肿瘤的早期诊断、 肿瘤的良恶性判断、观察细胞的增殖状态及周期分 布和疗效监测。
免疫表型分析的应用
1.检测淋巴细胞亚群： 2.白血病/淋巴瘤免疫分型 ； 3. HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系； 4.干祖细胞的定量及分析； 5.粘附分子; 6.免疫调节：细胞因子/受体的相互作用、共刺激分子受体/ 配体的相互作用； 7.发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传 递障碍有关； 8.药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效 果的监测 ； 9.免疫状态评价： 移植、放化疗等。
主要构造
流动室及液流驱动系统 激光光源及光束形成系统 光学系统 信号检测与存储、显示、分析系统 细胞分选系统。
流式细胞仪主要技术指标
分析速度：一般每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达 每秒上万个细胞。 检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两 个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC） 反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～ 0.5μm。 分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪 能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时 要求必须达到的。 分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选 细胞纯度可达99%以上。
细胞丢失：洗涤离心过程可能丢失细胞。
细胞悬浮：避免微细管道堵塞，特别是黏附细胞，如星形细胞。
流式细胞仪应用
常用范围
细胞大小 细胞颗粒 细胞表面分子：CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：p53 细胞功能检测：细胞周期，细胞调亡
应用分类
免疫表型分析 DNA含量和细胞周期分析 定量分析 细胞功能研究 细胞凋亡研究 其他
多色分析荧光素首选----Alexa Fluor 荧光染料 亮度(Brightness) --- 高
光稳定性(Photostability) --- 强
pH --- 不敏感
单参数直方图
双参数散点图
3-D直方图
计算机分析
计算机分析
流式细胞仪原理
发展历史，构造及原理和技术指标 工作原理 荧光素选择 补偿设置 注意事项
4 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5
同时使用二种荧光染料，会出现发射光谱叠加现象 计算机将此部分信号记入，从而引起偏差
补偿调节
BD 数字调节 Coulter 图形和自动调节
多参数细胞内染色
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ流式细胞仪特点
标本只要是单细胞即可用于分析， 极短时间内可分析大量细胞， 可同时分析单个细胞的多种特征， 定性或定量分析细胞 获得有兴趣的细胞
90 Degree Scatter
人周围血多形核细胞
不同条件下的树突状细胞
4 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5
荧光素强度比较
PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)
流式细胞术(Flow Cytometry)
原理及应用
流式细胞技术是近代细胞生物学、分子生 物学、分子免疫学和单克隆抗体技术、激光 技术、电子计算机技术等学科高度发展、综 合的结晶。 流式细胞技术应用标志着细胞学、肿瘤学、 免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。 细胞的CT。
2006年 64694篇
Beckman Coulter
CyFlow Space (德国）
16光学通道：（FSC，SSC1, SSC2, FL1~FL13） 3种激光光源：200mW，488nm (blue)；25mW， 635nm (red)；50mW，532nm (green)和100W UV灯 （汞弧灯）
小型流式细胞仪
抗体标记的方法
Intracellular Cytokine-Protocol
实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照
单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）
阳性对照：检测阴性时
空白对照和阴性对照的比较
免疫表型分析的应用
1.检测淋巴细胞亚群： 2.白血病/淋巴瘤免疫分型 ； 3. HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系； 4.干祖细胞的定量及分析； 5.粘附分子; 6.免疫调节：细胞因子/受体的相互作用、共刺激分子受体/ 配体的相互作用； 7.发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传 递障碍有关； 8.药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效 果的监测 ； 9.免疫状态评价： 移植、放化疗等。
Antigen presentation
•High surface MHC II •Low endocytosis •Low CCR1, CCR5, CCR6 •High CCR7 •High CD40, 54, 80, 86, 83 •Low CD68/High DC-LAMP •High p55
T，B细胞和T细胞亚群
Properties of immature and mature DC
Antigen capture
•High intracellular MHC II •Phagocytosis •High CCR1, CCR5, CCR6 •Low CCR7 •Low CD40, 54, 80, 86, 83 •High CD68 •No DC-LAMP
4. Computer System: Gate & Analysis
细胞流动
细胞分析工作原理模式图
细胞分选工作原理模式图
细胞类型
悬浮细胞 贴壁生长细胞
流式细胞仪原理
发展历史，构造及原理和技术指标 工作原理 荧光素选择 补偿设置 注意事项
荧光素检测原理
主要测定指标
FITC PE(RD1) PI ECD PerCP PECy7
PeCy5
488 488 488 488 488 488
488
525 575 620 （核染） 620 670 755
675
APC
633
670
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流式细胞仪原理
发展历史，构造及原理和技术指标 工作原理 荧光素选择 补偿设置 注意事项
1. Fluid System
Flow Cell
2. Optical System & Light Detector
620 BP 575 BP 675 BP
525 BP
645 LP 600 LP 550 LP 488 Laser blocker
We are proud to announce the introduction of 3 new conjugates for flow cytometry and fluorescence/confocal microscopy. The new dyes, Alexa Fluor® 488, 647 and 405, are being introduced widely across our human, mouse and rat ranges, providing additional options for multicolor flow cytometry. Whilst Alexa Fluor 488 can be used instead of FITC and the Alexa Fluor 647 replaces APC or Cy5, Alexa Fluor 405 is designed to work with the violet laser diode that is now being fitted to new generation flow cytometers, as well as with 407nm krypton lasers. These new conjugates are significantly brighter compared with ‘old’ fluorochromes enabling more sensitive detection, and are also highly photostable for applications such as confocal microscopy.