杂交瘤技术
杂交瘤细胞
杂交瘤技术
杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。其原理从下列3个主要步骤阐明。(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG1 000～2 000)是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40%(W/V)。(二)选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活5～7d，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。细胞DNA合成一般有两条途径。主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细胞融合的选择培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字头称为HAT 培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。
杂交瘤电融合方法-解释说明
杂交瘤电融合方法-概述说明以及解释
1.引言
1.1 概述
概述
杂交瘤电融合方法是一种结合杂交瘤和电融合技术的新型生物学方法。杂交瘤是一种在实验室中培育的细胞系，具有丰富的多能性和潜在的应用前景。电融合技术是通过电场作用将两个细胞融合在一起，形成杂交细胞，从而实现不同细胞之间的基因交流和功能整合。
本文将介绍杂交瘤的定义和特点，以及电融合方法的原理和应用。同时，我们将重点讨论杂交瘤电融合方法相较于传统方法的优势，探讨其在生物医学领域和生物工程领域的潜在应用。通过本文的研究，我们希望为相关领域的研究人员提供一种新的思路和方法，促进细胞学和基因工程领域的发展。
1.2 文章结构
文章结构部分的内容:
本文主要分为引言、正文和结论三部分。在引言部分，首先对杂交瘤电融合方法进行了概述，介绍了本文的目的和意义，并对文章的结构进行了简要说明。在正文部分，将详细介绍杂交瘤的定义和特点，电融合方法
的原理和应用，以及杂交瘤电融合方法的优势。最后，在结论部分对全文进行总结，并展望未来可能的发展方向，强调了该方法的重要性和潜在的应用前景。整个文章的结构清晰明了，每个部分之间内容紧密联系，能够循序渐进地引导读者逐步深入了解杂交瘤电融合方法及其相关知识。
1.3 目的
本文旨在介绍杂交瘤电融合方法，探讨其在生物医学领域的应用前景。通过深入分析杂交瘤的特点和电融合方法的原理，讨论杂交瘤电融合方法相较于传统方法的优势，并展望其未来的发展方向。通过对这一领域的研究和探讨，旨在推动生物医学领域的进步，为研究人员提供更多的思路和方法，促进科学技术的创新发展。希望能够为相关领域的专业人士和学术研究者提供有益的参考和启示，推动该领域的研究与发展。
杂交瘤技术名词解释
杂交瘤技术名词解释
杂交瘤技术 (Hybridoma Technology) 是一种用于生产单克隆
抗体的生物技术，也被称为免疫杂交技术或细胞融合技术。该技术利用肿瘤细胞或脾细胞作为受体细胞，将抗原基因融合到受体细胞的染色体中，从而使受体细胞能够产生并分泌单克隆抗体。
在杂交瘤技术中，两种细胞类型被结合到一起：一种是人类淋巴细胞 (humoral lymphocyte),另一种是肿瘤细胞或脾细胞
(cytotoxic lymphocyte)。这两种细胞类型的结合会产生一种杂交瘤细胞，这种细胞能够同时产生人类淋巴细胞和肿瘤细胞或脾细胞产生的抗体。
杂交瘤技术有许多应用，包括制备治疗用抗体、研究免疫反应、开发新药物检测方法等。该技术的优点是利用单个细胞生产大量抗体，具有很高的产量和纯度。此外，杂交瘤技术还能够生产高度特异性的抗体，对于治疗某些疾病具有重要意义。
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法：
1. 杂交瘤的制备：
将骨髓瘤细胞与抗原刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞。
2. 细胞培养：
将杂交瘤细胞接种于含有高浓度鸟嘌呤或潘孔霉素的无血清培养基中进行培养。
3. 无血清培养基的制备：
取无血清培养基中所需的基础培养液（例如：DMEM、RPMI 1640等），添加必要的生长因子、维生素、矿物质和氨基酸等，经过过滤和灭菌处理即可。
4. 细胞培养条件：
培养杂交瘤细胞时，需保持其在适宜的温度、CO2浓度和湿度下生长，通常在37℃、5% CO2气氛下进行培养。
5. 细胞检测：
在培养过程中，需定期检测细胞形态、增殖情况、表达抗原的能力等，以确保细胞的纯度和功能性。
注意事项：
为避免污染和交叉感染，需采取有效的无菌技术和严格的操作规范；同时，在培养过程中应注意细胞的生长情况和营养状况，及时调整培养条件以保证细胞的最佳生长状态。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
一、引言
单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。其制备方法主要有杂交瘤技术、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、荧光激发技术等。其中，杂交瘤技术是制备单克隆抗体最重要的方法之一。
二、杂交瘤技术基本原理
1. B细胞与肿瘤细胞的融合
杂交瘤技术的基本原理是将体内产生的特异性抗体B细胞与无限增殖
能力的肿瘤细胞进行融合，形成可分泌大量同种特异性抗体的杂交瘤
细胞。在此过程中，B细胞提供了高度特异性的抗体基因组，而肿瘤
细胞提供了无限增殖能力。
2. 杂交瘤细胞筛选和分离
将获得的杂交瘤细胞进行筛选和分离，以获取单一同种特异性抗体产
生的杂交瘤细胞株。这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格
控制，以确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力。
3. 单克隆抗体的大规模制备
通过对单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养和扩增，可以大规模制备单克隆抗体。此过程中需要注意对培养条件、生长因子、营养物质等进行优化，以提高单克隆抗体的产量和质量。
三、杂交瘤技术的优点
1. 高度特异性和亲和力
通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可以用于检测、诊断、治疗等领域。
2. 无限复制能力
杂交瘤细胞具有无限复制能力，可以大规模制备同种特异性抗体。
3. 可重复性好
由于单一B细胞产生的同种特异性抗体都是完全相同的，因此通过杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体具有良好的可重复性。
四、杂交瘤技术存在的问题及解决方法
1. 杂交瘤细胞的稳定性
杂交瘤细胞筛选原理
杂交瘤细胞筛选原理
1.融合：将癌细胞和免疫细胞以一定的比例混合，并经过刺激，使其融合成杂交瘤细胞。刺激方法可以采用化学物质（如聚乙二醇）或电脉冲等。
2.杂交瘤细胞培养：将融合后的细胞在含有足够营养物质的培养基中进行培养。由于杂交瘤细胞一般具有对培养条件要求较高且很容易生长，所以培养基的选择和培养方式等需要进行优化。
3.筛选：为了筛选出能够分泌目标抗体的杂交瘤细胞，常会进行抗体的检测。最常用的方法是酶联免疫吸附测定（ELISA），将培养液中的抗体与特异抗原结合，然后用酶标记的二抗结合，通过酶作用的颜色反应来检测抗体的存在。
4.单克隆化：通常通过稀释法将筛选出的杂交瘤细胞进行单克隆化。即将细胞进行限稀化，使得每个培养皿上只有一个细胞。然后扩大单个细胞的培养，并进行抗体检测和细胞鉴定，最终得到稳定的分泌目标抗体的单克隆细胞株。
杂交瘤细胞筛选的原理基于杂交瘤细胞的特性，由于是细胞的融合，杂交瘤细胞可以同时继承两种源细胞的特性。癌细胞提供了高增殖能力，可以快速扩大细胞数目，从而提高抗体的生产能力；而免疫细胞提供了抗体的生产能力。通过对杂交瘤细胞的筛选，可以选择出分泌高水平目标抗体的细胞株，从而用于大规模生产特定抗体。
总之，杂交瘤细胞筛选是一种利用细胞融合技术筛选特定细胞株的方法。通过融合癌细胞和免疫细胞形成杂交瘤细胞，再通过抗体检测的方式筛选出特定抗体分泌细胞，最终可以得到稳定的杂交瘤细胞株。这种技术
在生物医学和制药领域中具有广泛的应用前景，可以用于生产高效、稳定的蛋白质和抗体等重组产物。
杂交瘤细胞系的产生与筛选方法
杂交瘤细胞系的产生与筛选方法
杂交瘤细胞是由两种不同细胞融合而成的细胞，具有两种不同细胞的特性。它们能够生长并稳定传递某些嵌合基因，这使得研究人员可以得到一种长期稳定的细胞系，可以用于制备蛋白质、激素和抗体等生物制品。以下是杂交瘤细胞系的产生和筛选方法。
1.细胞融合法。该方法的原理是将两种细胞（通常是淋巴细胞和骨髓瘤细胞）使用聚乙二醇等化合物进行细胞融合，使得它们的核融合在一起，形成杂交瘤细胞。这种方法需要较高的实验技术，且细胞融合成功的概率较低。
2.电穿孔法。该方法通常使用高强度电脉冲将两种不同细胞膜穿透，并使它们互相融合。这种方法比细胞融合法更加快速和高效。
3.病毒介导法。该方法是使用病毒表面的融合蛋白合并两种细胞膜，使得它们融合在一起。这种方法具有较高的效率和特异性，但需要选择合适的病毒。
1.限制性稀释法。该方法是将杂交瘤细胞与未融合的母细胞混合后进行限制性稀释，使得每个混合物包含较少数量的杂交瘤细胞，并在培养液中筛选出杂交瘤细胞。
2.间接酶标记法。该方法通过将嵌合基因的表达转移至细胞表面上的酶分子，使得可以通过底物反应检测到嵌合基因的表达水平。对于酶标记法的反应物不会通过细胞膜进入细胞内，因此可以减少假阳性的可能性，提高筛选效率。
3.细胞抗原表面标记法。这种方法将鉴定两个细胞表面分子不同的抗体分别标记上荧光素或放射性同位素等物质，然后将未融合的母细胞与杂交瘤细胞混合后进行筛选。可以通过比较杂交瘤细胞和母细胞的表面标记，即可筛选出杂交瘤细胞。
综上所述，通过细胞融合法、电穿孔法和病毒介导法可以产生杂交瘤细胞。通过限制性稀释法、间接酶标记法和细胞抗原表面标记法可以对杂交瘤细胞进行筛选，获得稳定的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞系常用于蛋白质、激素和抗体等的生产。
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤
杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：
杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合
建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
杂交瘤细胞技术的原理
杂交瘤细胞技术的原理
杂交瘤技术原理：
•淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体；
•细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；
•利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，•并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb。
1975年G. Kohler和C. Mistein利用细胞融合技术，首次获得能生产单一抗体的杂交瘤细胞。与血液中的多种抗体比较，单克隆抗体更具有其特殊的优点。也正是它的特异性和高纯度的单一性而被利用于多种产业，从而获得巨大的经济效益。
抗体由B淋巴细胞产生，为了得到能产生单一抗体的淋巴细胞，并且要求这种淋巴细胞既能在一般的体外培养条件下进行正常的生长繁殖，而且还要能持久的产生这种单一抗体。G. Kohler和C. Mistein 发现存在多发性骨髓瘤疾病中的B淋巴肿瘤，由于在浆细胞中发生了成瘤转而能产生免疫球蛋白，而且这种细胞能在体外生长易被克隆。。受到这种天然肿瘤B淋巴细胞能产生抗体的启发，他们利用骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合成杂交瘤细胞制造各种单克隆抗体，使之成为一种成型的生产单克隆抗体的杂交瘤技术。
骨髓瘤细胞可以在体外生长，而且比正常细胞生长繁殖速度要快。此种细胞可以从患骨髓瘤的小鼠体内中获得，只是这种细胞不会产生抗体。用特定的抗原刺激正常小鼠脾脏B淋巴细胞，B淋巴细胞就会产生相应单一的特异性抗体，但这种B淋巴细胞却难以体外培养。杂交瘤技术就是将这两种具有功能的细胞融合在一起，在体外快速生长的杂交瘤细胞。此种杂交瘤细胞群持续分泌的成分但已有特异性的抗体。我们称为单克隆抗体。
临床免疫学检验第五版课后题重点(可打印修改)
第四章
1.杂交瘤技术原理：以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗
体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。
2.细胞株冻融的原则：快冻慢融。目前均采用液氮保存杂交瘤细胞。细胞放入液氮前需要逐步降温，如果冻存管放置
于-80摄氏度低温冰箱过夜后再放入液氮中，可长期保存。复苏细胞时，冻存管取出后，立即37摄氏度水浴，使之融化。
第五章
1.凝集反应：是指细菌和红细胞或红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体
（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。
直接凝集反应：在适当电解质参与下，细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原直接与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象，称为~。
间接凝集反应：可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体（如正常人O型红细胞、细菌、胶乳颗粒等）的表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在适宜的电解质存在条件下出现特异性凝集现象，称为~。其敏感度高于直
接凝集反应和沉淀反应。
正向间接凝集反应：用可溶性抗原致敏载体以检测标本中的待检抗体。
反向间接凝集反应：用特异性抗体致敏载体以检测标本中的待检抗原。
间接凝集抑制反应：用抗原致敏的载体颗粒及相应的抗体作为诊断试剂，检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。
b淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理
b淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理
淋巴细胞杂交瘤技术（又称克隆淋巴细胞杂交瘤技术）是一种
用于生产单克隆抗体的方法。其基本原理是将小鼠淋巴细胞与骨髓
瘤细胞（如NS-1细胞）融合，形成杂交瘤细胞，这些细胞称为淋巴
细胞杂交瘤细胞或克隆细胞。这些细胞具有淋巴细胞的抗原识别能
力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力，从而能够持续产生具有特定抗原
识别能力的单克隆抗体。
具体步骤包括：
1. 选择合适的小鼠作为抗原免疫动物，注射目标抗原以激发其
免疫系统产生抗体。
2. 从小鼠体内获得淋巴细胞，这些细胞含有已经产生的抗体基因。
3. 从骨髓瘤细胞中获得无限增殖能力的细胞系，如NS-1细胞。
4. 将淋巴细胞和骨髓瘤细胞以特定比例混合，通过化学或电脉
冲的方法使它们融合成杂交瘤细胞。
5. 将融合后的细胞在含有特定筛选标记的培养基中培养，以去除未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞。
6. 对杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养，使其形成单克隆细胞系。
7. 测定单克隆细胞系产生的抗体，筛选出特异性抗原的单克隆抗体细胞系。
淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理是利用细胞融合的方法将抗原识别能力和无限增殖能力相结合，从而获得能够持续产生特定单克隆抗体的细胞系。这一技术在生物医学研究和生物制药领域具有重要应用，可以生产大量高质量的单克隆抗体，用于治疗、诊断和研究等方面。
简述杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程
通过杂交瘤技术创建单克隆抗体的第一步就像给一只老鼠一个特殊的任务——成为超级抗体生产商！我们从给老鼠注射抗原开始，就像送它去执行一个秘密任务，寻找和摧毁敌人。这个"免疫"过程让老鼠的免疫系统都爆发了，就像超级英雄准备拯救这一天一样，它开始产生抗原抗体，准备战胜坏蛋！
是时候让那些脾细胞从免疫鼠！脾脏就像B细胞的聚会中心，抗体产生岩星。之后，我们将把这些脾脏细胞与肌瘤细胞结合，这些细胞基本上是细胞世界的不朽的阴茎。这种聚变将产生杂交质瘤细胞，超级细胞具有产生抗体和永远分裂的力量。这就像创造了一个超级英雄团队为了对付坏人，但在细胞层面！让核聚变的乐趣开始吧！
接下来令人兴奋的一步是把我们的杂交瘤细胞进行测试，看看哪些细胞具有产生抗体的超能力，这些抗原是激光聚焦于我们的目标抗原。这些超级巨星细胞然后在实验室里被踢回并放松，在那里它们可以像小的抗体工厂一样，把数吨的单克隆抗体挤出。一旦我们得到了一大批这些强大的抗体，我们可以给他们一个温泉日并净化它们，让他们都准备好在诊断测试中或作为治疗的英雄。说到生化的冒险！
杂交瘤细胞技术的原理
杂交瘤细胞技术的原理
杂交瘤技术原理：
•淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体；
•细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；
•利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，•并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb。
1975年G. Kohler和C. Mistein利用细胞融合技术，首次获得能生产单一抗体的杂交瘤细胞。与血液中的多种抗体比较，单克隆抗体更具有其特殊的优点。也正是它的特异性和高纯度的单一性而被利用于多种产业，从而获得巨大的经济效益。
抗体由B淋巴细胞产生，为了得到能产生单一抗体的淋巴细胞，并且要求这种淋巴细胞既能在一般的体外培养条件下进行正常的生长繁殖，而且还要能持久的产生这种单一抗体。G. Kohler和C. Mistein 发现存在多发性骨髓瘤疾病中的B淋巴肿瘤，由于在浆细胞中发生了成瘤转而能产生免疫球蛋白，而且这种细胞能在体外生长易被克隆。。受到这种天然肿瘤B淋巴细胞能产生抗体的启发，他们利用骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合成杂交瘤细胞制造各种单克隆抗体，使之成为一种成型的生产单克隆抗体的杂交瘤技术。
骨髓瘤细胞可以在体外生长，而且比正常细胞生长繁殖速度要快。此种细胞可以从患骨髓瘤的小鼠体内中获得，只是这种细胞不会产生抗体。用特定的抗原刺激正常小鼠脾脏B淋巴细胞，B淋巴细胞就会产生相应单一的特异性抗体，但这种B淋巴细胞却难以体外培养。杂交瘤技术就是将这两种具有功能的细胞融合在一起，在体外快速生长的杂交瘤细胞。此种杂交瘤细胞群持续分泌的成分但已有特异性的抗体。我们称为单克隆抗体。
杂交瘤技术
杂交细胞，可在HAT培养基上存活。
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HGPRTˉ细胞的筛选
可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏 HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可选育出 HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。
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2、诱导细胞融合的常用方法
生物方法：如仙台病毒 化学方法：如聚乙二醇（PEG） 物理方法：如电融合
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（1）仙台病毒融合法
常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和 副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用 最为广泛。
因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促 进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒 诱导细胞融合。
的动物脾细胞融合，形成的杂交细胞即可产生 抗体，又可无限增殖，从而创立了具有划时代 意义的杂交瘤技术。 这种技术的基础是细胞融合技术。
3
一、细胞融合（cell fusion）
1、概述
细胞融合是指两个或更多个相同 或不同细胞通过膜融合形成单个 细胞的过程。
可在自发或人工诱导下发生。
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两个不同基因型的细胞可形成一个杂种细胞。 基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体 通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单 核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid cell） 。
杂交瘤技术和单克隆抗体
将经融合的混合细胞用HAT培养液悬浮稀释。 将经融合的混合细胞用HAT培养液悬浮稀释。 HAT培养液悬浮稀释 一般在含有饲养细胞的96孔板中进行。 96孔板中进行 一般在含有饲养细胞的96孔板中进行。 在融合后7d用HAT选择培养基培养， 14d用HT培养基培 在融合后7d用HAT选择培养基培养，7-14d用HT培养基培 7d 选择培养基培养 14d后用完全培养基培养 后用完全培养基培养。 养，14d后用完全培养基培养。
小结
1. 用特定的抗 原免疫动物 4. 培养并筛选能产生抗 体的单个杂交瘤细胞
2. 从脾中取出 B淋巴细胞
5. 优化培养目的 杂交瘤细胞 3. 获得杂交瘤细胞
2. 骨髓瘤细胞
6. 纯化单克隆抗体
单克隆抗体的不足
目前单克隆抗体均是鼠源性抗体， 目前单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可 产生人抗鼠抗体（human antimouse antibody, 产生人抗鼠抗体（ HAMA) 人体的排斥反应 人体内半衰期只有5 人体内半衰期只有5-6小时 到达靶组织的药量仅有1 到达靶组织的药量仅有1％ 完整的抗体分子的相对分子量较大，穿透力不强， 完整的抗体分子的相对分子量较大，穿透力不强， 难以到达病灶的核心部位
制备针对特异抗原的单克隆 抗体
一般选40-50%的PEG 进行诱导。 一般选40-50%的 进行诱导。 40 细胞融合后培养液中有脾细胞融合后培养液中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤 瘤等细胞。 、脾、瘤等细胞。 常用的选择性培养基为HAT培养基。 HAT培养基 常用的选择性培养基为HAT培养基。
杂交瘤技术与单克隆抗体制备
杂交瘤技术与单克隆抗体制备
杂交瘤技术与单克隆抗体之间的关系可以用一句话来概括：杂交瘤技术是为了制备单克隆抗体这个目的而发明出来的，可以用于单克隆抗体制备的技术。
杂交瘤技术
杂交瘤技术又称单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)。1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的方法。
杂交瘤的基本原理：
杂交瘤技术是使免疫动物的脾细胞在聚乙二醇（Polyethylene Glycol ，PEG）的诱导下与同系动物的骨髓瘤细胞融合。首先是细胞质融合，然后通过有丝分裂细胞核合而为一，形成新的杂交细胞，简称为杂交瘤。细胞融合后移入HAT培养液中培养。
骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGRPT），在HAT培养液中不能增殖而死亡。淋巴细胞培养中也不能长期在培养液中生长增殖。然而杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT的基因产物，并从骨髓瘤细胞中获得肿瘤细胞不断生长繁殖（传代）的特性，因此在HAT培养液中选择性存活下来。细胞融合后既具有产生特异性抗体的能力。又保留了瘤细胞能体外长期培养的特性。
单克隆抗体的制备
单克隆抗体概念
单克隆抗体是由一个淋巴细胞增殖分化形成一个基因相同的细胞群称为克隆，或无性繁殖细胞系（简称细胞系），由单一克隆产生的抗体称为单克隆抗体。众所周知，我们人体或动物体受天然抗原刺激后产生的抗体是多种抗体组成的混合抗体，即所谓的多克隆抗体。因
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McAb技术的核心是用骨髓瘤 细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋 巴细胞融合得到杂交瘤细胞 (hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能 象骨髓瘤细胞那样在体外无限增 殖，又具有B淋巴细胞产生特异性 抗体的能力。
杂交瘤技术的基本过程
24
（二）杂交瘤技术产生的三个技术关键
1、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性
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（4）慢慢加入预热的无血清1640 1ml ，1min，目的是稀释 PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml ，2-3min内加完， 并持续轻轻搅动，此时细胞对机械损伤非常敏感。
（5）离心1000rpm，室温10 min，去上清。
（6）取预热的15%牛血清1640，先加10ml，对准细胞团加液， 使细胞颗粒均匀分布于悬液中；再加入90ml。
取抗体阳性的克隆，可继续克隆化或进一步扩 大培养。
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防染色体丢失、 变异及污染。
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9、抗体大量生产
方法主要有两种： 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从
上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一 般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产， 费用较高。 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。腹水 可达每毫升几毫克抗体。
淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋 巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂 交瘤细胞系的技术。
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单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb) 指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识
别一种抗原决定簇的均质抗体。 克隆
指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖 形成的细胞集落。
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（3）电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，将细胞置于电 场中，使它们彼此靠近紧密接触并排列呈串，然后在高 强度、短时程的直流电脉冲的作用下，相互连接的细胞 膜被击穿而导致细胞融合。
其优点是：
融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 可在显微镜下观察融合过程； 诱导过程可控性强。
B淋巴细胞（B lymphocytes）： 接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异 性抗体，在体液免疫中具有重要功能。 本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细 胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命 细胞。
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骨髓瘤细胞 (myeloma cells)： 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可 永远分裂和存活——长命细胞。 没有抗体分泌。 经筛选HGPRTˉ或TKˉ。
的动物脾细胞融合，形成的杂交细胞即可产生 抗体，又可无限增殖，从而创立了具有划时代 意义的杂交瘤技术。 这种技术的基础是细胞融合技术。
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一、细胞融合（cell fusion）
1、概述
细胞融合是指两个或更多个相同 或不同细胞通过膜融合形成单个 细胞的过程。
可在自发或人工诱导下发生。
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两个不同基因型的细胞可形成一个杂种细胞。 基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体 通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单 核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid cell） 。
HGPRTˉ或TKˉ细胞在HAΒιβλιοθήκη Baidu培养基上不能存活； HGPRTˉ与TKˉ细胞融合或与正常细胞融合后的
杂交细胞，可在HAT培养基上存活。
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HGPRTˉ细胞的筛选
可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏 HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可选育出 HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。
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12、杂交瘤抗体的贮存
因为反复冷冻和融化往往导致杂交瘤抗体变性，所以 对培养上清可加0.1%NaN3在4℃保存，对血清和腹水可以 小容量分装，冻存-70 ℃以下，在-20 ℃保存亦可。将它 们以硫酸铵沉淀物的形式（加等体积的饱和硫酸铵），保 存在4 ℃是一种节约、完全和长期贮存的方法。对纯化的 杂交瘤蛋白保存在4 ℃下，含0.1% NaN3的PBS中。
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10、杂交瘤细胞的保存
因为细菌的污染和细胞的突变，使杂交瘤难 以维持，冻存几批早期杂交细胞，预防意外是必 要的。
无菌DMEM含20%牛血清加10% DMSO（二甲 基亚砜）配成冻存液，2×106~5×106细胞加入 1ml冻存液，于液氮中贮存。
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11、细胞复苏
冻存管由液氮中取出，即刻投入37℃水浴中，很快 融化，用吸管吸出细胞到50ml离心管，内有50ml细胞生长 液，1000rpm ，10min，去上清，细胞沉淀物，再悬浮于 10ml生长培养液，室温静止10min，再悬于5ml生长培养液， 转移到25ml细胞培养瓶，置37 ℃ 5%CO2 孵箱培养，有些 细胞在复苏后1天左右即会死去。
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8、克隆化
由于在一个培养孔内不能保证只存在一种杂交瘤细胞系， 因此必需克隆化。一般需克隆化3~5次，才能获得稳定 型基因和稳定分泌特异性抗体的细胞。
要尽早克隆化，以防止单克隆抗体细胞系被竞争淘汰。 分泌抗体的克隆一般生长较慢。
克隆化后的杂交瘤细胞也需定期再克隆，以防突变和染 色体丢失。
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H—hypoxanthine （次黄嘌呤） A—aminopterin （氨基喋呤） T—thymidine （胸腺嘧啶核苷）
糖和
A
氨基酸
核苷酸 前体
T
TMP
TK HGPRT
H
IMP
核苷酸 DNA
DNA的生物合成途径与HAT选择培养基
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凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能利 用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；
（7）加入已含有饲养细胞的96孔板或24孔板（每孔加入细胞 数分别为2×105 和1×106 ）。
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6、HAT 和HT选择培养
（1）接种24h后加入HAT选择培养液。 （2）融合后7~10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加
一半新的)，以后每2~3天半量换液一次。 （3）两周后换HT培养液（目的是洗出残留于细胞内的氨
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用 灭 活 的 病 毒 诱 导 的 动 物 细 胞 融 合 过 程 示 意 图
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（2）聚乙二醇融合法
聚乙二醇（polyethyleneglycol ，PEG） 分子可在质膜 之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融 合。
其优点是融合成本低，勿需特殊设备；简便、融合效 率较高。因此在1975年获得成功后很快取代仙台病毒 法。
用于融合。
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2、骨髓瘤细胞的准备
常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2/0、X63等。 选择要点：稳定易培养、自身不分泌抗体、融
合率高、HGPRT缺陷株（8-氮鸟嘌呤定期筛 选）。 融合条件：对数生长期，良好的细胞形态，活 力细胞达95%。
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3、饲养细胞的准备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨 髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数 分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加 入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞 称为饲养细胞（Feeder cells）。
机制尚不明了，一般认为： 可能释放非种属特异性的生长刺激因子； 也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
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常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹 腔巨噬细胞。其中小鼠腹腔巨噬细胞使用最为 普遍，因其来源及制备较为方便，且有吞噬清 除死亡细胞及其碎片的作用。
饲养细胞的制备：
细胞融合前一天，从同系正常小鼠腹腔取巨噬细 胞，加入培养板，96孔板每孔细胞数为2×104；24孔板， 每孔为1×105个，置37℃培养。
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4、 50%PEG配制
称20~50g PEG1500~4000粉剂，放于玻璃 瓶中，高压灭菌（121℃~132℃）20min，溶化 呈液状，PEG尚未凝固时，加入RPMI-1640 20~50ml（与PEG重量相当）立即充分混合。此 为50%PEG保存于室温，呈碱性，不必调节pH。
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5、细胞融合
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2、诱导细胞融合的常用方法
生物方法：如仙台病毒 化学方法：如聚乙二醇（PEG） 物理方法：如电融合
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（1）仙台病毒融合法
常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和 副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用 最为广泛。
因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促 进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒 诱导细胞融合。
存活但短命 死亡
存活
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（三）单克隆抗体的制备过程
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三个基本环节和两个决定因素
选
择 培
免疫鼠
培养筛选
取脾细胞 骨髓瘤细胞系
饲 养
养 基
细 胞
（HAT）
融合
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1、免疫小鼠和脾细胞的制备
免疫动物：6~8周龄BALB／c小鼠 免疫抗原：各种病毒、细菌、细胞或可溶性抗原。一
般可溶性抗原用完全佐剂效果较好。 免疫途径：皮下、腹腔或静脉注射 免疫程序：基础免疫2次，静脉再加强免疫1次。 免疫后3~5天解剖，取脾细胞配制成适量浓度细胞悬液
（1）SP2/0细胞和免疫脾细胞按1:4的比例放于一个50ml离 心管中，充分混匀，离心后尽量吸尽上清，置于37℃玻 璃杯水浴中。
（2） 用1ml吸管将1ml 37 ℃预热的50%PEG溶液，逐滴缓 慢加入混合细胞管中（1min以内加完），边加边轻轻搅 拌。
（3）继续搅动团块1分钟，目的使所有的细胞尽可能地与 PEG接触。
克隆培养方法
有限稀释法（较常用）：使96孔板上其中36孔每孔5个 细胞，另36孔每孔1个细胞，余下24孔每孔0.5个细胞； 亦有经连续稀释成最终30个/ml，每孔0.1ml接种48孔。
软琼脂平板法 FACS选取法 显微挑选法
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克隆化培养后，通常在10~14天测抗体进行阳 性克隆的筛查。
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电融合示意图
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3、杂种细胞的筛选
人工诱导细胞融合是一个随 机的过程，可能产生多种类型的 细胞，筛选的目的是获得优良的 杂种细胞。
应根据其细胞特性来选择适 当的筛选方法（如酶缺陷、药物 抗性标记、营养缺陷、温度敏感 等）。
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HAT是最常用的筛选系统
原理
细胞DNA合成有两条途径： 主要合成途径 补救合成途径
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主要合成途径
即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取 的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷酸，进 而合成DNA。
这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基， 因此该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断。
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补救合成途径
细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶 （HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）， 将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料。
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2. 细胞融合技术
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞)
长命 不分泌抗体
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
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3. 杂交瘤细胞的筛选
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 筛选出
脾细胞脾细胞
不能长期存活
骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
脾细胞 骨髓瘤细胞
不能长期存活
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HAT培养基筛选
B淋巴细胞： HGPRT+，TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRTˉ或TKˉ 杂交瘤细胞： HGPRT+，TK+
基喋呤），以后每3~4天换液一次。 （4）再维持培养两周改用一般培养液。
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7、抗体的筛查
细胞融合后两周即可筛查抗体。选择检测方法以快速、 简便、特异、敏感和便于一次处理大量样品为原则。
常用的方法有： ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等 McAb的检测。 RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。 IFA用于细胞和病毒McAb的检测。 FACS(流式细胞术)用于检查细胞表面抗原的McAb检 测。
杂交瘤技术
（hybridoma technique）
安徽医科大学微生物学教研室
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内容纲要
细胞融合
概述 诱导细胞融合的常用方法 杂种细胞的筛选（HAT）
杂交瘤技术与单克隆抗体的制备
基本概念 三个技术关键 单克隆抗体的制备过程
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杂交瘤技术又称单克隆抗体制备技术。 1975年，Kohler和Milstein将骨髓瘤细胞与免疫
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由此可见，HAT选择培养基及补救合成途 径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后 选择出杂交细胞株的关键因素。
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二、杂交瘤技术与单克隆抗体的制备
（一）基本概念
杂交瘤细胞 指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细
胞，它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力， 又具有参与融合的体细胞的一些特征。
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杂交瘤技术（也称单克隆抗体制备技术） 是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B