布病检测方法及质量控制

日内进行检查，因放置时间过长可能会导致血清 效价降低。
③ 个别血清会出现前带现象，建议多做几个管，多
采用几个稀释度。
2.3 iELISA 间接酶联免疫吸附试验 （iELISA）是另一种对布病 抗体敏感性较高的实验。大 概步骤如下，抗原包被在平 板上，血清或奶样中的特异 性抗体能够与抗原形成复合 物。通过洗液洗涤去除未结 合的抗体，当用酶标二抗孵 育显色以后，可以通过index 值来判断动物是否为阳性。
方。
（3）实验室外部质控 环比实验：外部的质量体系对实验室进行的能力 验证。 在环比实验中，实验室会收到15-20个盲样，这些 盲样的滴度都已经被测定，并且都通过了稳定性与 均一性实验。通过环比实验，可以评判各实验室在 检测过程中所存在的问题，以便其不断改进。 中国动物卫生与流行病学中心，人兽共患病监测室 在2015年11月29日进行了第一次环比实验，现结果 正在汇总分析当中。
通过以上标准对抗原进行质控至关重要。因为如
果没有良好质控的话，则实验中虎红抗原可能会过 于敏感（产生许多假阳性），或敏感性不够（产生 许多假阴性）。
当没有OIE标准血清时，需要使用国家标准血清
对抗原进行质控。国家标准血清符合OIE的要求， 应由国家参考实验室提供。
2.2 SAT
• 特异性抗体可与相应
2015年环比实验样品制备
谢谢大家！！！
（3）RBT抗原质控的方法
① 当新的一批抗原到来时，要对新的抗原进行质控。简述 ②
③
④
⑤
RBT抗原质控方法如下（以OIE标准血清为例）： 抗原滴度（可检测性）：将OIE ISS 标准血清用生理盐 水稀释为1：25, 1：40, 1：45, 1：55 和1：100。RBT实 验中当血清在1 :45稀释度时检测为阳性，1 :55为检测 阴性则此项合格。如果超过了这个范围则检测度不合格。 敏感性：取滴度略高于阴阳性临界值的阳性血清，并用 待检抗原检测，当检测结果均为阳性时则此项合格 特异性：对阴性血清（通过未感然布鲁氏菌动物的血液 制备）进行检测，检测结果全为阴性则此项合格。 纯度/无菌性
在过去的实验中主要通过凝集管进行检测，费时费 力废材料。在接受ANSES培训以后，我们开始做微 量CFT，用96孔板进行CFT实验，大大地提高了检 测效率。
（1）CFT实验步骤比较繁琐，要注意以下的事项：
① 采血5天后方能使用（让红细胞静息）。
② 每批溶血素需要测一次效价，每次实验前要测补体
效价。
（二）实验室诊断
实验诊断主要是运用实验技术和方法，通过感官、 试剂反应、仪器分析和动物实验等手段进行的诊断。 布病的实验室诊断包括病原学，血清学诊断。
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病原学诊断
（1）病原分离鉴定 将病料中（组织或奶样）的病原进行分离培 养，并对其属、种、型进行分析。从而判定该 疑似病原是否属于布鲁氏菌属，属于布鲁氏菌 属的那个种（流产，猪，羊等），属于该种布 鲁氏菌的哪个变型。
反应条件如下： 95℃ 7 min 预 变 性 ； 然 后 进 行 25 个 循 环 的 扩 增 （ 95℃ 35s ， 64℃ 45s ， 72℃ 3min ），最后 72℃延 伸10 min，4℃保存。
结果判定： ① 电泳同时出现152bp、794bp和1682bp3条条带，为牛种 布鲁氏菌； ② 电泳同时出现152bp、794bp、1071bp和1682bp4条条带， 为羊种布鲁氏菌； ③ 电泳同时出现152bp、794bp和1071bp3条条带，为绵羊 附睾种布鲁氏菌； ④ 电泳同时出现152bp、272bp、774bp、1071bp和1682bp5 条条带，为猪种布鲁氏菌； ⑤ 电泳同时出现152bp、272bp、1071bp和1682bp4条条带， 为犬种布鲁氏菌； ⑥ 电泳同时出现272bp、794bp、1071bp和1682bp4条条带， 为沙林鼠种布鲁氏菌。
2.5 FPA
荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，
FPA)是一种定量免疫分析技术
荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光
能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振 荧光(525nm)。
偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受
括以下几个方面：
② 可检测性（OIE标准血清为例）：OIEELISAspISS
1 :16稀释为阳性，1 :64稀释时为阴性。
③ 敏感性 同RBT ④ 特异性 同RBT
⑤ 可重复性（每种样品要经过多次重复（20次）并且
在两块板子上进行检测，来观察产品的重复性是否 良好）。
2.4 CFT 补体结合实验（CFT）， 是利用绵羊红细胞与溶血 素，补体组成溶血指示系 统。当布鲁氏菌的特异性 抗原、抗体复合物竞争结 合指示系统中的补体时， 溶血被抑制。因此可以通 过抗溶血的程度来判断抗 体滴度与阴阳性。补体结 合实验主要检查IgG类抗体， 特异性强，准确性高，敏 感性差，但是操作比较复 杂，可以作为确诊检测。
布病检测方法及质量控制
一、布病诊断
• 布病的诊断过程可分为初步诊断和实验室诊断。
流行病学调查
• 初步诊断
病原学 实验室诊断
临床诊断 病理诊断
血清学
（一） 初步诊断
1 流行病学调查 （ 1 ）疫区内动物基本情况，免疫情况，免疫监测情 况等。 （ 2 ）本次疫病的流行情况，包括最初发病时间，地 点，疫情，是否在短时间内出现许多明显的流产症状。 本地区过去曾否出现过布病，附近地区近期是否有布 病发生，是否有其它地方引进动物或有其它地方人员 来参观。 （ 3 ）本地相关动物管理制度，牲畜流动，检疫屠宰 情况，气候、地理、交通情况等。
的布氏菌抗原发生特 异性结合，在电解质 的作用下，就会形成 肉眼可见的凝集反应， 通过这种检测来判断， 该动物是否为患病动 物。
优点：
① SAT主要检查血清中的IgG和IgM。 ② 特异较好，实用性、敏感性较强。
缺点：
① 有前带现象，有时出现假阴性结果。 ② 出结果慢，需要两天。
实验要点：
① 受检血清应新鲜、无溶血、无污染。 ② 存放血清处温度不能超过10℃，采血后应于3-4
（1）技术要点：
① 反应条件要控制在室温，3D摇晃4min后立即判读
（大量样品操作时容易造成时间延误）。
② 虎红抗原要4°C冷藏，严禁冷冻保存。 ③ 不能使用血浆样本（容易产生假阳性）。 ④ 在实验过程中要加阴阳性对照。
（2）RBT抗原质量控制 如果想得到更为可靠、准确使检测结果，就要对检 测的各个环节进行质量控制，使其标准化。 首先要对抗原进行质控。
精确度低 精准度高
精确度高 精准度低
③ 检测步骤：要有标及时记录各种检测试剂的
信息（批号，生产日期等）。
⑤ 检测结果记录，验证：要在实验过程中对实验结
果进行记录，需要第二个人对实验结果进行验证。
⑥ 表格：各种表格要完备，并要放在触手可及的地
属
布鲁氏菌与 否？
种
牛、羊、猪 种布鲁氏菌？
型
变 型 1, 2, 3……
优点：
① ②
诊断结果明确，是布病诊断的“金标准”。 能对流行菌株进行分型，流行病学价值高。
缺点：
①
②
费时 检测需要花费近一周的时间，不适用于大规 模的检测。
费钱 需要高级别的生物安全实验室及生物安全管 理体系，适当的培养基，这些都需要花费大量的财 力。
2 血清学诊断
RBT（虎红平板凝集实验） SAT（试管凝集实验） CFT（补体结合实验） ELISA（酶联联免疫吸附实验） FPA（荧光偏振实验）
布鲁氏菌诱导机体抗体曲线图
2.1 RBT

简便快捷，敏感性较高。
能够检测所有光滑型布鲁氏菌的感染。 抑制IgM,检测IgG1。 等体积混合4分钟，观察到凝集现 象。 会产生假阳性与假阴性。
③
不敏感，不易采样。
（2）PCR 随着分子生物学的发展，PCR等技术得到广泛应 用。我们实验室使用的主要是多重PCR技术，来对 布鲁氏菌的种型进行分析。其扩增的目的条带是细
菌基因组中广泛分布的基因片段。通过电泳条带比
较分析，揭示基因组间的差异。该方法特异性强，
灵敏度高，简单快捷。
引物如下:
引物名称 a BMEI0998f BMEI0997r BMEII0843f BMEII0844r BMEI1436f BMEI1435r BR0953f BR0953r BMEII0987f BMEII0987r 序列（5’—3’） ATC—CTA—TTG—CCC—CGA—TAA—GG GCT—TCG—CAT—TTT—CAC—TGT—AGC TTT—ACA—CAG—GCA—ATC—CAG—CA GCG—TCC—AGT—TGT—TGT—TGA—TG ACG—CAG—ACG—ACC—TTC—GGT—AT TTT—ATC—CAT—CGC—CCT—GTC—AC GGA—ACA—CTA—CGC—CAC—CTT—GT GAT—GGA—GCA—AAC—GCT—GAA—G CGC—AGA—CAG—TGA—CCA—TCA—AA GTA—TTC—AGC—CCC—CGT—TAC—CT 扩增产物大小（bp） 1682 1071 794 272 152
（1）实验要点：
① 要严格控制孵育时间和实验温度。
② 洗涤步骤是最为关键的。要充分洗涤，拍干残留
液体，不要让板子变干燥。
③ 奶样要-20°C 冻存，在4°C 保存抗体滴度会降
低。
④ 实验过程中，要加入阴阳性对照。
（2）新进iELISA试剂盒的质控：
① 对不同检测样品都要进行一次质控（血清，奶）包
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临床诊断
（1）最初阶段的临床症状不明显。 （2）随着病程的发展，布病会引起母畜流产、死 胎、不孕和子宫内膜炎等。 （3）雄性动物出现附睾炎和睾丸炎。