Eps8在恶性血液肿瘤细胞株中的表达分析

万方数据

ｍｅｎｔａｓ公司。蛋白裂解液及ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天公司。Ａｎｔｉ—Ｅｐｓ８山羊抗人一抗为Ｒ＆Ｄ公司产品，ＨＲＰ标记兔抗山羊二抗为武汉博士德公司产品。

１．３目的引物ＮＣＢＩ：ＷＩ一１４０２９。上游：５’一ＣＴＧＣ—ＴＡＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＧＡＣＴＩ＇ＧＴＧＧ－３’。下游：５’一ＴＡＧＡＡＴＴＧＴＣＡＣＡＴＡＡＡＧＧＧＴＡＡＧＧ－３７。探针：５７一ＴＩ＇ＡＣＡＡＡＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＧＴＡＴＴＣＴＧＣ＿３’。另选１个与目的引物扩增效率一致的管家基因作为内参照。

１．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析用冰ＰＢＳ分别将对数生长期肿瘤细胞及ＰＢＭＮＣｓ洗涤２次，加蛋白裂解液，置冰上３０ｍｉｎ，４ｏＣ、１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后收集上清液，利用ＢＣＡ法测定蛋白浓度，按比例加５×上样缓冲液，煮沸１０ｍｉｎ。取１００Ｉｘｇ蛋白样品进行８％聚丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝到达胶底部后，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，５％脱脂奶粉室温封闭２ｈ后，加入相应一抗４℃孵育过夜，以１３一ａｃｔｉｎ作为内参照，ＴＢＳＴ洗涤后，加入相应二抗室温孵育１ｈ，ＴＢＳＴ洗膜后，用ＥＣＬ法显色。

１．５统计学方法应用ＱＲＴ—ＰＣＲ相对定量计算法２－ＤＤＣＴ比较各组Ｅｐｓ８ｍＲＮＡ的表达水平。应用ＳＰＳＳ１３．０软件进行Ｏｎｅ—ＷａｙＡＮＯＶＡ统计分析。以Ｐ≤Ｏ．０５为差异有统计学意义。

２结果

２．１质粒及标准曲线制定将鉴定好的质粒测定ＯＤ值，计算含量，换算成拷贝数，以１０１０量于一２０℃备用，作为荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ的阳性对照标准模版。高压ｄｄＨ：０将阳性对照标准模版稀释成１０～１０２

ｃｏｐｉｅｓ／斗ｌ

ｃＤＮＡ后分别进行荧光定量ＰＣＲ，反应体系为２５斗ｌ，反应条件为：９５℃１０ｍｉｎ，９５℃１５ｓ、６０℃６０ｓ（４０个循环）。１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２ｃｏｐｉｅｓ／ｌ＿Ｌｌ标准品荧光定量ＰＣＲ得出的相对应Ｃｔ值分别为１７．０８、２０．３ｌ、２３．３４、２６．５９、２９．４６、３１．５ｌ，且重复性好。统计学分析显示，不同浓度标准品的Ｃｔ值与该标准品浓度的对数存在线性关系，且起始浓度越高Ｃｔ值越小，回归系数为０．９９６的标准曲线稳定性好。

２．２Ｅｐｓ８ｍＲＮＡ检测结果提取细胞总ＲＮＡ，利用分光光度计检测ＲＮＡ的纯度。荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ结果为，ＡＲＨ－７７、ＫＧｌａ、Ｋ－５６２、ＨＬ－６０、８２２６、Ｒａｊｉ细胞株的２。０哪值分别为１．２７８６±０．１８８０、０．５８５４±０．３５１４、４．０３０４－Ｉ－１．３１２０、１．００８２±０．１６１０、２．９６７２±１．７７１２、０．０１１０±０．００１０，与ＰＢＭＮＣｓ对照组１．００００±０．００００比较，Ｐ值分别为０．００８、０．６６１、０．２６２、１．０００、０．７０１、０．０００。

１０２．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果见图１。

图１Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果

注：１为ＡＲＨ＿７７，２为ＫＧＩａ，３为Ｋ５６２，４为ＨＬ－６０，５为８２２６，

６为Ｒａｊｉ，７—９为ＰＢＭＮＣｓ

３讨论

１９９３年Ｆａｚｉｏｌｉ等¨１提出Ｅｐｓ８为ＥＧＦＲ的通道底物之一，对肿瘤细胞的增殖、转移起促进作用。随后国外学者推断Ｅｐｓ８有望成为肿瘤治疗的靶点，并陆续发现Ｅｐｓ８在口腔鳞癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等实体肿瘤中异常高表达，且Ｅｐｓ８异常高表达可提高肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭能力，是肿瘤预后不良的指标∞－５］。Ｃｈｅｎ等№１发现Ｅｐｓ８可对细胞周期进行调控，用沉默Ｅｐｓ８基因的细胞株注射动物成瘤后，沉默Ｅｐｓ８后的肿瘤细胞株成瘤较未沉默的肿块显著减小，并且Ｅｐｓ８可降低宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性，其机制可能是减低ＡＫＴ的激活和提高Ｐ５３的表达。Ｙａｐ等＂ｏ研究口腔鳞癌的结果表明，高表达的Ｅｐｓ８通过整联蛋白依赖的Ｒａｃｌ激活提高细胞的转移及侵袭能力。Ｅｐｓ８通过调控Ｒａｃ在细胞黏附和运动中起重要作用哺Ｊ，机制为Ｅｐｓ８与Ａｂｉｌｌ和Ｓｏｓｌ结合时可以改变Ｒａｃ特异性鸟嘌呤核苷交换因子活性，通过参与Ｒａｃ引导的肌动蛋白重组而影响细胞膜的流动、伪足生成及细胞的增殖活性【９］。而Ｒ｛ｌｃ有促进ＣＤ刍细胞向骨髓基质细胞迁移的能力，Ｒａｃ抑制剂能明显阻止小鼠模型中白血病进展及ｃＤ刍的克隆增殖。

本研究我们通过Ｔａｑｍａｎ探针法发现，Ｅｐｓ８ｍＲＮＡ在ＡＲＨ－７７及Ｒａｊｉ中表达有差异，在其他细胞系中差异均无统计学意义。提示Ｅｐｓ８在基因转录水平及蛋白翻译水平不完全一致。本研究还发现，人髓系白血病ＫＧｌａ及人多发性骨髓瘤ＡＲＨ－７７内Ｅｐｓ８蛋白高表达，而Ｋ－５６２、ＨＬ－６０、８２２６、Ｒａｊｉ及健康正常人ＰＢＭＮＣｓ中未见表达。结合本实验室前期利用磁珠分选干细胞来源的恶性血液病细胞株的结果，ＫＧｌａ为干细胞起源的急性髓系白血病细胞株，细胞流式监测ＣＤＭ显示ＫＧｌａＣＤＭ阳性率约９８％，而ＨＬ－６０ＣＤ弘阳性率约１５％，另外，在多发性骨髓瘤分子遗传学研究方面，也逐步确定骨髓瘤细胞不是直接恶变的浆细胞，而是由前体细胞分化而来。本研究结果也提示，Ｅｐｓ８在骨髓瘤形成时可能

对干细胞分化起一定作用。

万方数据

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Eps8在恶性血液肿瘤细胞株中的表达分析

作者：熊文艳， 陆志刚， 涂三芳， 吴海燕， 宋朝阳， 李玉华， XIONG Wen-yan， LU Zhi-gang， TU San-fang， WU Hai-yan， SONG Chao-yang， LI Yu-hua

作者单位：南方医科大学珠江医院,广州,510282

刊名：

山东医药

英文刊名：SHANDONG MEDICAL JOURNAL

年，卷(期)：2011,51(12)

1.Scita G;Nordstrom J;Carbone R Eps8 and transduce signals from Ras to Rac[外文期刊] 1999(6750)

2.Funato Y;Terabayashi T;Suenaga N IRSp53/Eps8 complex is important for positive regulation of Rac and cancer cell motility/invasiveness[外文期刊] 2004(15)

3.Yap LF;Jenei V;Robinson CM Upregulation of Eps8 in oral squamous cell carcinoma promotes cell migration and invasion through integrin-dependent Rac1 activation[外文期刊] 2009(27)

4.Chen YJ;Shen MR Eps8 decreases chemosensitivity and affects survival of cervical cancer patients 2008(06)

5.Xu M;Shorts-Cary L;Knox AJ Epidermal growth factor receptor pathway substrate 8 is overexpressed

in human pituitary tumors:role in proliferation and survival[外文期刊] 2009(05)

6.Wang H;Patel V;Miyazaki H Role for EPS8 in squamous carcinogenesis[外文期刊] 2009(01)

7.Maa MC;Lee JC;Chen YJ Eps8 facilitates cellular growth and motility of colon cancer cells by increasing the expression and activity of focal adhesion kinase[外文期刊] 2007(27)

8.罗畅;丁小凤;孙一兵EPS8蛋白的表达、多克隆抗体制备及其亚细胞定位[期刊论文]-湖南师范大学自然科学学报 2008(02)

9.Fazioli F;Minichiello L;Matoska V Eps8,a substrate for the epidermal growth factor receptor kinase,enhances EGF-dependent mitogenic signals 1993(10)

本文链接：/Periodical_shandyy201112005.aspx