野生苋属植物籽实中新型α-淀粉酶抑制剂的分离纯化和结构与功能研究

湖南师范大学硕士学位论文野生苋属植物籽实中新型α-淀粉酶抑制剂的分离纯化和结构与功能研究姓名：王琳申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王贤纯;梁宋平20050501摘要从野生苋属植物（Ａｒｅａ．ｒａｎｔｈｕｓｐａｎｉｃｕｌａｔｕ西籽实中发现了两种新型Ⅱ一淀粉酶的蛋白质类抑制剂（分别命名为ｗＡＩ－１和ＷＡＩ一２），并对其性质、结构及结构与功能的关系进行了系统的研究。

通过反相高效液相色谱（１ｉｐ—ＨＰＬＣ）分离纯化技术得到纯化的ＷＡＩ—ｌ和ＷＡＩ一２。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测得其分子量分别为９８６．５Ｄａ和１０２７．５Ｄａ，是目前报道的分子量最小的Ｑ一淀粉酶的蛋白质类抑制剂。

ＷＡＩ—ｌ能在弱酸性条件下，以非竞争性抑制作用方式有效抑制美洲蜚蠊消化道Ⅱ一淀粉酶的活性。

最适抑制ｐＨ值为６．０。

３７＂Ｃ下与酶预温浴约３０ｍｉｎ后显示最大抑制活性。

当ａ一淀粉酶用量一定时，ａ一淀粉酶活性的抑制率在约５０％的范围内随抑制剂／酶比例的增大而呈线性增加，超过５０％后，抑制率随抑制剂／酶比例的增大而缓慢上升，最终达到最大值（约６５％）。

ＷＡＩ－１具有较强的热稳定性。

经８０４Ｃ水浴１２０ｍｉｎ后，抑制率为５８．７％；ｌ００６ｃ水浴１０ｒａｉｎ后，抑制率仍有２３．０８％。

ＷＡｌ—１对入唾液淀粉酶、猪胰腺Ⅱ一淀粉酶、枯草杆菌Ｑ一淀粉酶和米曲霉Ⅱ一淀粉酶活性均无影响。

ＷＡＩ一１对美洲蜚蠊消化道。

一淀粉酶的抑制活性大于黄粉虫消化道Ｑ一淀粉酶的抑制活性。

通过氨基酸组成分析和Ｅｄｍａｎ降解测序以及串联质谱技术解析ＷＡＩ－１的结构。

初步的分析结果表明，ＩＶＡＩ一１是由９个氨基酸残基组成的环状多肽，Ｎ端为焦谷氨酸。

稀ＨＣｌ水解导致的焦谷氨酸侧链开环不明显影响它的抑制活性，但胰蛋白酶处理导致整个环状分子开环时会使抑制活性完全丧失。

ＷＡＩ一２能在弱酸性条件下，以竞争性抑制作用方式有效抑制美洲蜚蠊消化道Ｑ一淀粉酶的活性。

最适抑制ｐＨ值为５．５。

３７。

Ｃ下与酶预温浴约３５ｒａｉｎ后显示最大抑制活性。

当Ⅱ一淀粉酶用量一定时，ａ一淀粉酶活性的抑制率在约６０％的范围内随抑制剂／酶比例的增大而呈线性增加，超过６０％后，抑制率随抑制剂／酶比例的增大而缓慢上升，最终达到最大值（约７０％）。

ＷＡＩ一２也具有较强的热稳定性。

经８０。

Ｃ水浴１２０ｉｎｉｎ后，抑制率约为５０％：经１００。

Ｃ水浴１０ｍｉｎ后，抑制率仍有约３０％。

ＷＡＩ－２对入唾液淀粉酶活性无影响。

对美洲蜚蠊消化道Ⅱ一淀粉酶的抑制活性大于对黄粉虫消化道ａ一淀粉酶、猪胰腺Ⅱ一淀粉酶和米曲霉Ⅱ一淀粉酶的抑制活性。

ＷＡＩ一２的抑制活性低于ＷＡＩ一１和ＡＡＩ。

关键词：蛋白质类抑制剂，抑制活性，结构，功能，苋属植物，ａ一淀粉酶ＡＢＳＴＲＡＣＴＴｗｏＢｏｒｅｌｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｎａｍｅｄＷＡＩ一１ａｎｄＷＡ卜２ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌＹ，ｈａｖｅｂｅｅｎｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｗｉｌｄａｍａｒａｎｔｈ（Ａｍａ？＇ａｎｔｈｕｓ＂ｐａｎｉｃｕＭｔｕｓ）ｗｅｅｄｓ．Ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙ，ＷＡＩ—ｌａｎｄＷＡＩ一２ｗｅｒｅｐｕｒｌｆｉｅｄｂｙＲＰ－ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ—ｐｈａｓｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ１ｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），ａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＷＡＩ—ＩａｎｄＷＡＩ一２ｈａｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｏｆ９８６．５Ｄａａｎｄ１０２７．５ＤａｒｅｓｐｅｃｔｉｒｅｌＹ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ—ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒ—ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅ—ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）．ＴｈｅｙａｒｅｔｈｅｓｍａｌｌｅｓｔｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＱ—ａｍｙｌａｓｅｆｏｕｎｄＳＯｆａｒＷＡＩ—ｌｃｏｕｌｄｐｏｔｅｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｄ—ａｍｙｌａｓｅｏｆＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａａ破ｅｒｉｃａｎａｄｉｇｅｓｔｉｖｅｄｕｃｔｉｎａｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｒｉｖｅｍａｎｎｅｒｕｎｄｅｒｍｉＩｄａｃｉｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙａｔｐｉｔ６．０ＷＡＩ一１ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｔ３７。

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粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业都经常使用“３。

它作用淀粉时可从分子内部切开Ｑ—ｌ、４糖苷键，生成糊精和还原糖从而催化淀粉水解睁３１。

产物的末端残基第一个碳原子构型为ａ构型，故称Ｑ一淀粉酶。

能与。

一淀粉酶分子上的相应部位结合后并引起Ｑ一淀粉酶分子构象改变，使它的催化活性降低或丧失的化合物称为Ｑ一淀粉酶抑制剂。

它们属于糖水解酶抑制剂的一种，对人和哺乳动物、昆虫以及微生物的ｄ一淀粉酶有很强的特异性抑制作用Ｈ１。

因此，研究淀粉酶蛋白质类抑制剂，既有重要的理论意义，又有广阔的应用前景：农业上，为设计新型无毒无污染杀虫、杀菌药物，减少环境污染提供实验材料，为转基因抗病虫农作物新品种的培育提供理论依据。