脱羰秋水仙碱诱导牛卵母细胞显核的研究

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2008,16(4):593~596

*基金项目:国家高技术研究与发展计划 （863） (No.2001AA213081)资助。

**通讯作者。Author for correspondence.教授,博士生导师,主要从事哺乳动物胚胎工程.E­mail:.收稿日期： 2007­11­05接受日期： 2008­01­14·研究论文·

脱羰秋水仙碱诱导牛卵母细胞显核 *

万 敏， 马夜肥， 王勇胜， 彭新容， 张 东， 杨 鹭， 张 涌 **

(西北农林科技大学生物工程研究所,杨凌 712100)

摘要：用脱羰秋水仙碱 （deme colcine,Deme） 诱导牛卵母细胞显核。比较不同显核时间、 Deme浓度以及极体形成等因素对 牛卵母细胞显核的影响。结果显示：淤 0.5滋 g/mL Deme处理卵母细胞，诱导 1h时获得最高显核率（76.00%），高于 0.5h （61.18%）、 1.5h（64.10%） 和 2h（63.46%） 组； 于不同浓度 Deme处理成熟卵母细胞 1h，0.4和 0.5滋 g/mL Deme组显核率较高， 分别为 75.24%和 77.31%， 显著高于 0.3滋 g/mL组 （46.54%） 与 0.6滋 g/mL（60.66%） 组;盂0.4滋 g/mL Deme处理卵母细胞 1h， 有 极体组显核率 （83.24%） 与无极体组 （77.54%） 无显著性差异。 研究表明,0.4滋 g/mL Deme处理卵母细胞 1h能更好地诱导牛 卵母细胞显核。

关键词：牛;脱羰秋水仙碱;卵母细胞显核

中图分类号: S185 文献标识码:A 文章编号: 1006­1304(2008)04­0593­04

Nucleus Extrusion in Bovine Oocytes Induced by Demecolcine WAN Min,MA Ye­fei,WANG Yong­sheng,PENG Xin­rong,ZHANG Dong,YANG Lu,ZHANG Yong**

Demecolcine was used to induce nucleus extrusions in bovine oocytes.And some factors effecting the formation of nuclear extrusion were assessed,including oocytes with or without the first polar body,different concentrations and durations of demecolcine­treatment.The results demonstrated:淤 oocytes induced by0.5滋 g/mL demecolcine for1h gained higher extrusion rate (76.00%)than those for0.5h(61.18%),1.5h(64.10%)and2h(63.46%);于 in1h demecolcine­treatment,0.4 and0.5滋 g/mL demecolcine group obtained the higher rate of extrusion(75.24%and77.31%respectively)compared to the0.3滋 g/mL(46.54%)and 0.6滋 g/mL group(60.66%);And盂 there was no significant difference on the extrusion rate between oocytes with(83.24%)and without(77.54%)first polar body.To sum up,bovine oocytes induced with0.4滋 g/mL demecolcine for1h can gain the higher rate of

extrusion in bovine

oocytes.

bovine;demecolcine;nuclear extrusion in bovine oocytes

自1996年克隆绵羊 Dolly诞生以来,体细胞核移 植技术得到了较快的发展,许多克隆动物如牛(Cibelli ,1998)、 小鼠(Wakayama .,1998)、 山羊(Wilmut .,1997;Baguisi .,1999)、猪 (Poleiaeva ., 2000)、 猫(Shin ,2002)、 骡子(Gordon .,2003)相 继诞生。但目前体细胞核移植的效率还很低， 克隆动 物出生率只有 0%～10%。影响体细胞核移植效率的 因素很多， 卵母细胞的去核效率及质量是其中较关键 的因素之一。牛体细胞核移植,传统的去核方法主要 是盲吸法,这种方法的优点是操作简单， 缺点是去核 率低及去核不完全。为了提高盲吸法的去核率， 一般 去除总胞质量的 1/6～1/4，但研究表明（谭世俭等, 2003），受体细胞质的胞质量对核移植胚的后期发育 有较大的影响。 因此寻找一种更有效的去核方法一直 是核移植研究中的热点。

脱羰秋水仙碱 （demecolcine,Deme） 辅助去核法 主要利用其对细胞骨架的松弛作用，诱导卵母细胞 表面产生含染色质的可见突起，从而准确显示卵母 细胞核所在位置。去除该突起以及周围紧贴的细胞 质即能可靠去核(Vajta ,2005)。 这种去核方法能 获得高达 98%的去核率(Vajta .,2005)且吸出的 胞质量很少， 低于总胞质量的 1/8。这种去核方法受

农 业 生 物 技 术 学 报 2008年

表 1 Deme处理时间对显核率的影响

Table1Effect of Deme­treatment duration on the rate of extrusion on oocytes

Deme处理时间/h Duration of Deme­treatment 0

0.5

1.0

1.5

2.0显核率/%

Rates of extrusion

0（0/20）

61.18 a（52/85）

76.00 b（76/100）

64.10 ab（75/117）

63.46 ab（66/104）

重构胚数/个

Nunber of reconstructed embryos

-

45

56

62

57

卵裂率/%

Rate of cleavage

-

73.33 a（33/45）

75.00 a（42/56）

74.19 a（46/62）

73.68 a（42/57）

囊胚发育率 /%

Rate of blastocysts

-

12.12 a（4/33）

14.29 a（6/42）

13.04 a（6/46）

11.90 a（5/42）

到研究者的关注，但目前由于对 Deme引起卵母细 胞形成胞突的原因及其影响因素不同研究者间得到 的结果也不一致， 还有待深入研究。 尽管国内外有很 多实验室对其进行了一系列的研究，但并未对影响 显核率的各因素做系统的分析。本研究意在探索影 响 Deme显核的因素，从而优化 Deme诱导显核程 序,为该去核方法的应用提供技术参考。

1材料和方法

1.1 材料

牛卵巢采自西安屠宰场， 采后置于 25～35 ℃生 理盐水， 3～5h内运回实验室。体视显微镜(Nikon)及荧光显微镜(Nikon Eclipse TE300)等。 相关试剂均 购于美国 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1卵母细胞体外成熟 抽吸法吸取卵母细胞， 12 #针头抽取卵巢上直径为 2～8mm卵泡。体视显 微镜下， 选择外围紧紧包裹 2～3层均匀一致卵丘细 胞，且颜色均匀的卵母细胞，置于含 10%FBS的 TCM­199成熟液（购自美国 Sigma公司）中， 38.5 ℃、 5%CO

2培养箱中成熟培养 20h。0.1%的透明质 酸酶处理成熟卵母细胞,移液器轻吹去除卵母细胞 表面扩散的颗粒细胞。

1.2.2卵母细胞去核 将去颗粒细胞的卵母细胞 移入含 Deme的 TCM­199(含 10%FCS)中， 38.5

℃、 5%CO

2条件下诱导显核。 卵母细胞显核后， 体视 显微镜下观察，表面具有半圆状小突起的为已显核 卵母细胞。将显核卵母细胞进行计数，计算其显核 率。 显微操作仪下吸除卵母细胞表面突起进行去核。 Hoechst33342染色检查去核率。

1.2.3后期发育检测 将去核卵母细胞进行核移 植， 体外培养至 8d囊胚期， 检测其后期发育情况。

1.3 实验设计

根据 Vajta .(2005)和 Russell .(2005)的 Deme诱导卵母细胞显核方法,设计了 3个实验:淤 0.5滋 g/mL Deme分别处理卵母细胞 0、 0.5、 1.0、 1.5和 2.0 h对显核率的影响;于0、 0.3、 0.4、 0.5和 0.6

滋 g/mL Deme处理卵母细胞 1h对显核率的影响;盂 0.4滋 g/mL Deme分别诱导有、 无极体卵母细胞显核 1h对显核率的影响。

1.4 数据分析

所有实验重复 3次以上,实验数据用 字 2进行差 异显著性分析。

2结果

2.1 Deme处理时间对显核的影响

表 1显示， 0.5滋 g/mL Deme诱导卵母细胞显 核， 处理时间为 1h时获得最高显核率 （76.00%）， 显 著高于 0.5h组 （61.18%）， 略高于 1.5h（64.10%） 和 2h组 （63.46%）。显核卵母细胞去核后作为受体细 胞， 其卵裂与囊胚发育 （图 2） 未见异常形态， 且重构 胚卵裂率及囊胚发育率在 4个实验组间差异并不显 著( >0.05)。

2.2 Deme浓度对显核率的影响

表 2表明，不同浓度 Deme诱导卵母细胞显核 1h， 0.4滋 g/mL（图 1） 和 0.5滋 g/mL Deme组获得了 较高显核率（分别为 75.24%和 77.31%），与 0.3滋 g/mL（46.54%） 和 0.6滋 g/mL（60.66%） 组差异显著。 但 4组重构胚的卵裂率和囊胚发育率均无显著差 异。

2.3 极体对显核率的影响

表 3可见， 0.4滋 g/mL Deme诱导卵母细胞显核 1h， 有极体组显核率 （83.24%） 虽略高于无极体组 （77.54%）， 但两者无显著性差异。且重构胚的卵裂 率和囊胚发育率在两组间无显著性差异。

上标的不同字母代表数据有显著性差异,下表与此相同。Deme浓度为0.5滋g/mL

Different letters in the same column indicate significant difference( <0.05).The following Tables are the same as Table1. The concentration of Deme is0.5滋 g/ mL

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