食品专业论文

随着基因工程技术在农业生产中应用的深入,越来越多具有改良特征的转基因植物在全球范围内得到广泛种植,随之而来的转基因食品也迅猛发展,转基因产品大规模商业化引起了对安全性问题的担忧。为保证转基因产品标签制度的顺利实施,建立快速、准确、高通量的定量检测方法十分必要。通过对国内外转基因食品检测技术的研究进展,定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用,并通过构建质粒标准分子的方法来实现对更多转基因植物品系的定量检测。

是年由美国的肠巧等人首创并由美国的公司开发的一项体外扩增的方法。问世短短十几年的时间, 却在许多领域得到广泛的应用, 成为基因工程中的重要技术, 同时, 也为食品微生物的检测分析提供了新的快捷方法。PCR 技术检测微生物的基本原理是在被检测微生物核酸序列, 在PCR 体系下经高温变性、低温退火、适温延伸三步循环将单个核酸分子序列以2的指数进行大量复制扩增的过程。即在检测时, 被检测微生物双链DNA 序列在94℃变性解链成双链, 55℃特异性引物与单链DNA 结合, 72℃在引物的引导延伸复制检测微生物DNA 序列。以上三步进行循环扩增得到大量的被检测微生物DNA 序列, 最后一般在凝胶电泳下检测目的DNA。理论上只要样品中有一个分子的微生物就可以在短时间内用PCR 技术检测到。食品中污染微生物种类很多, 即使是同一种食品中微生物种类也有很多, 用传统的方法检测食品中微生物要分离出所有的微生物很困难。特别是在检

测食品中的弱势菌时, 可能很难用传统的方法检测出来, 特别是有些微生物很难培养, 而用PCR 技术检测这些微生物可以避免这些问题, 因此, 利用PCR 技术能够比较准确地检测食品中微生物。PCR 是在体外合适条件下,以单链DNA 为模板,以1对人工合成的寡核苷酸为引物, 在热稳定DNA 聚合酶作用下特异性扩增DNA 片段的技术。整个反应过程通常由20～40 个PCR 循环组成, 每个PCR 循环包括高温变性-低温复性- 适温延伸3 个步骤。方法是首先将靶DNA 双链加热变性为单链,然后加入2 段人工合成的与靶DNA 端邻近序列互补的寡核苷酸片段作为

引物, 即左端引物和右端引物;该对引物与互补的DNA 单链碱

基互补结合后,在有DNA 多聚酶和4 种dNTPs底物存在的情况下,引物沿模板DNA 链(靶DNA 单链)按5’末端向3’末端方向延伸, 自动合成新的DNA 双链, 新合成的DNA 双链又可作为扩增的模板,继续重复以上的DNA 聚合酶反应。经过25～35 次循2 PCR 技术在食品致病菌检测中的应用传统方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时, 需经富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程, 并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。而应用PCR 技术,只需数小时,就可以电泳法检测出0.1 mgDNA 中仅含数个拷贝的模板序列; 用PCR 扩增细菌中保守的rDNA 片,还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。利用PCR 检测食品中的致病菌,首先要富集细菌细胞,通常经离心沉淀、滤膜过滤

等方法可从样品中获得细菌细胞, 然后裂解细胞,使细胞中的DNA 释放,纯化后经PCR 扩增细胞靶DNA的特异性序列,最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的DNA 序列

食品样品中致病菌的检测利用检测食品中的致病菌, 首先要抽提靶, 通过离心或过滤的方法可从样品中获得细菌细胞, 然后将细胞裂解, 进行核酸纯化, 使其适合作。也可以直接裂解样品中的细菌细胞, 抽提核酸。应用PCR技术，只需数小时，就可以电泳法检测出0．1 mgDNA中仅含数个拷贝的模板序列；用PCR扩增细菌中保守的rDNA片，还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。利用PCR检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞，然后裂解细胞，使细胞中的DNA释放，纯化后经PCR 扩增细胞靶DNA的特异性序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的DNA序列。实时荧光PCR(Real time PCR)是近几年兴起的分子生物学检测技术，是在传统意义上的PCR反应体系中加入了一条与扩增模板能特异性结合的、标记了两个荧光基团的探针，并在传统的PCR仪上增加了荧光信号检测系统。实时荧光PCR法检验周期短、灵敏度高，同时通过光学系统检测荧光信号而省去了凝胶电泳的繁琐操作，避免了实验过程中EB等致癌物质的污染，既减少了假阳性的发生率和对人、环境的潜在危害，又缩短了检测时间。对污染较重的样品，从样品准备到检出只需约4。5 h；对于污染较轻的样品，需要有18～24 h

的增菌，而经典培养法鉴定需要5～15 d。李氏溶血素0基因与内化素基因是单核细胞增生李斯特菌最主要的致病因子与侵袭因子，这两个致病基因的位点均在染色体上。溶血素由hlyA 基因编码，且hlvA基因在该菌中保守。根据发表的单核细胞增生性李斯特菌的重要毒力基因hlyA的全基因序列，设计出引物，建立了该菌的PCR诊断方法，结果显示扩增可获得预期743 bp 的片段，且扩增具有极好的种特异性。同时，实验结果表明，用食品标本检测时，许多复杂成分含抑制Tag酶的活性，当经过增菌培养，并对培养物进行化学抽提，去除样品中的脂类和蛋白质，纯化的菌体经加热裂解后直接用作PCR反应模板，可大大提高检出率目前，该方法在检测转基因食品的应用中，还存在一些问题，如从食品中提取DNA的效率，可能存在的PCR抑制剂，DNA的降解，可能存在的RNA，以及选择合适的靶序列的引物来保证扩增的成功等，这些都可能成为制约鉴定结果成功与否的因素。在实验过程中，PCR的污染及条件的重复性是实验判定结果的关键。每一次实验均需要设有阴性及阳性对照以确保实验结果可靠性。在样品采集及处理过程中也需要注意防止污染。

结语:

食品在生产、运输、销售过程中很容易受到微生物的污染，所以微生物的检测是食品检验中的一项重要内容。目前常规方法

(尤其是对致病微生物的检验)操作繁琐，耗时长，通常需要几天的培养鉴定时间，不能达到快速监测食品的目的。PCR技术发展起来后，人们尝试把该方法引入食品微生物的检验中，取得了较好的效果。随着分子微生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，尤其是核酸探针和聚合酶链反应(PCR)以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于食源性病原菌的检测。