一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法

有抑菌作用的 菌株数／株 １４２ １６３ １１０ １７９ ２２６ ３９６
检出率 ％
３５．８６ ４１．１６ ２７．７８ ４５．２０ ５７．０７
－
用乳酸和盐酸分别调蒸馏水、ＭＲＳ 液体培养基
第５期
张国强等： 一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法
７４３
的 不 同 ｐＨ 值 。 用 乳 酸 和 盐 酸 调 蒸 馏 水 ｐＨ 值 为 ３．０～６．０ 时都没有抑菌效果； 乳酸和盐酸调 ＭＲＳ 液 体培养基 ｐＨ 值 ３．０ 时 都 有 抑 菌 效 果 ， ｐＨ 值 ４．０ 时 对大肠杆菌、沙 门 氏 菌 、蜡 状 芽 孢 杆 菌 都 有 抑 菌 效 果， 而对金黄色 葡 萄 球 菌 、枯 草 芽 孢 杆 菌 没 有 抑 菌 效果， ｐＨ 值 ４．５ 以上时都没有抑菌效果， 故选择 ｐＨ 值 ４．５ 作为酸排除的对照。
过 氧 化 氢 作 用 的 排 除［７］： 挑 取 乳 酸 菌 发 酵 产 物 排除酸后仍有抑菌效果的菌株， 接种于 ５ ｍＬ ＭＲＳ 液体， ３０℃摇床培养 ４８ｈ， １０ ０００ ｒ·ｍｉｎ－１ 离心 １０ｍｉｎ 后， ８０℃水浴 １０ ｍｉｎ， 用牛津杯法做对各种指示菌的 抑菌试验。 １．４．５ 与 传 统 筛 选 方 法 的 比 较 传 统 筛 选 方 法 主 要是初筛先将细菌进行 ＭＲＳ 液体发酵培养， 然后 将原始发酵液离心， 取上清液活性检测， 最后对活 性较好的菌株进行复筛， 包括排除酸的作用和过氧 化 氢 的 作 用 等 。 抑 菌 活 性 检 测 主 要 有 点 种 法 、滤 纸 片法、打孔法和牛津杯琼脂扩散法［６］。酸抑制作用的 排除 ［７］： 用乳酸和盐酸分别调蒸馏水、ＭＲＳ 液体的 ｐＨ 值分别为 ３．０、４．０、４．５、５．０、６．０， 用牛津杯法做 对 各种指示菌的抑菌试验， 确定对照 ｐＨ 值。挑取发酵 产物对 ５ 种指示菌都有抑菌作用的菌株， 接种于 ５ｍＬＭＲＳ 液体， ３０℃摇床培养 ４８ ｈ， １０ ０００ ｒ·ｍｉｎ－１ 离 心 １０ ｍｉｎ 后， 测其 ｐＨ 值 ， 并 用 １ ｍｏｌ·Ｌ－１ ＮａＯＨ 和 １ ｍｏｌ·Ｌ－１ ＨＣｌ 将 其 离 心 发 酵 上 清 液 调 至 对 照 ｐＨ 值， 用牛津杯法做对各种指示菌的抑菌试验。过氧 化氢作用的排除方法同上。
通讯作者， 杨自文， 研究员， 博士， （ 电话） ０２７－ ８７３８９７３２（ 电子信箱） ｚｗｙａｎｇ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｗｈ．ｈｂ．ｃｎ。
７４２
湖 北 农 业 科学
２００７ 年
中加入含有 １％ＣａＣＯ３ 的改良 ＭＲＳ 液体 ５ ｍＬ， 用接 种环挑取选定的出发菌接种入 Ｅｐ 管， 密封， ３０℃摇 床培养 ４８ ｈ。 １．４．３ 指 示 菌 菌 悬 液 制 备 用 接 种 环 挑 取 活 化 的 指 示 菌 １ 环 接 种 于 １０ ｍＬ ＬＢ 液 体 培 养 基 ， ３０℃摇 床过夜培养。倾注培养法测其菌悬液浓度， 用无菌 生 理 盐 水 稀 释 成 １０７ 个·ｍＬ－ １ 菌 悬 液 ， 冰 箱 保 存 待 用 ［５］。 １．４．４ 筛 选 方 法 在 乳 酸 菌 发 酵 液 中 加 入 １％ ＣａＣＯ３， ３０℃摇 床 培 养 ４８ ｈ。 采 用 牛 津 杯 琼 脂 扩 散 法 ［６］做 抑 菌 试 验 。 将 指 示 菌 菌 悬 液 在 每 个 平 皿 中 加 入指示菌稀释液 １ ｍＬ， 再将冷至 ４５℃的灭菌 ＬＢ 培 养基每皿定量加入 ２０ ｍＬ， 摇匀， 冷却制成含菌平 板， 在每个平板上均匀放置 ４ 个牛津杯。乳酸菌发 酵液以 １０ ０００ ｒ·ｍｉｎ－１ 离心 １０ ｍｉｎ， 在平板牛津杯里 定 量 加 入 １００ μＬ 不 同 乳 酸 菌 菌 株 发 酵 离 心 上 清 液， 标注菌株号， ４℃冰箱放置 ４ ｈ 以上， 然后 ３０℃培 养箱 中 静 置 培 养 １６ ｈ， 观 察 抑 菌 情 况 ， 选 取 牛 津 杯 周围有明显抑菌圈的菌株作复筛。
收稿日期： ２００７－ ０６－ ３０ 基金项目： 湖北省“十一五”重点科技攻关项目（ ２００６ＡＡ２０５Ａ０１） ； 湖北省农业科技创新中心资助项目（ ２００７－ ６２０－ ００１－ ０３） 作者简介： 张国强（ １９８２－ ） ， 男， 山东潍坊人， ２００５ 级硕士研究生， （ 电话） １３７９７０７９４９５（ 电子信箱） ｇｕｏｑｉａｎｇ＿ｆｓｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；
摘要： 采用 １０ｍＬＥｐ 管培养菌液， 用 ＣａＣＯ３ 中和酸法筛 选 产 抑 菌 活 性 物 质 乳 酸 菌 的 新 方 法 ， 与 传 统 方 法
相比具有工作量小， 检测手段灵敏， 筛选效率高等特点， 特别适用于筛选微好氧菌及兼性厌氧菌。
关键词： 乳酸菌； 快速筛选； 抑菌活性物质； ＣａＣＯ３ 中和酸法
表 １ 有抑菌作用的菌Hale Waihona Puke Baidu的筛选结果
被抑制的指示菌 对 ５ 种指示菌有抑制作用 对 ４ 种指示菌有抑制作用 对 ３ 种指示菌有抑制作用 对 ２ 种指示菌有抑制作用 对 １ 种指示菌有抑制作用
有抑菌作用的菌株数／株 ４８ ６１ ５０ ６７ ７３
表 ２ 发酵上清液对指示菌有抑制作用的菌株
被抑制的指示菌
对大肠杆菌有抑制作用的菌株 对沙门氏菌有抑制作用的菌株 对枯草芽孢杆菌有抑制作用的菌株 对金黄色葡萄球菌有抑制作用的菌株 对蜡状芽孢杆菌有抑制作用的菌株 从平板中挑选出进行检测的菌株
泡菜发酵是一种具有 ２０００ 多年历史的乳酸发 酵工艺。泡菜发酵主要是乳酸发酵， 发酵过程中会 产生大量有机酸， 细菌素， 益生菌等， 可以调节动物 和人体肠道微生态平衡， 对机体的健康十分有益， 并有帮助消化， 防止便秘， 防止细胞老化， 降低胆固 醇， 抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作 用 ［１］。 当 前 各 国 学 者 致 力 于 将 随 机 的 经 典 式 筛 选 转 变为目标明确的理性筛选， 创建新的筛选模型与方 法［２］。本文设计了一种使用 １０ｍＬ Ｅｐ 管培养菌液， 用 ＣａＣＯ３ 中和酸法筛选产抑菌活性物质乳酸菌的新型 筛选方法。
２ 结果与分析
２．１ 出发菌的筛选结果 采用平板稀释法和厌氧培养技术， 从泡菜中分
离、纯化得到 ３９６ 株典型菌株， 接入 Ｅｐ 管进行产抑 菌活性物质乳酸菌的筛选， 检出有抑菌活性的阳性 菌株数 ２９９ 株， 检出率高达 ７５．５１％。
２．２ 有抑菌作用菌株的筛选结果 通过反复试验， 在改良 ＭＲＳ 发酵液中加入 １％
中图分类号： Ｑ９３９．１１＋７； Ｑ９３．３１
文献标识码： Ｂ
Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｓｃｒ ｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｐｒ ｏｄｕｃｉｎｇ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ
ＺＨＡＮＧ Ｇｕｏ－ ｑｉａｎｇ１， ＹＡＮＧ Ｚｉ－ ｗｅｎ２， ＷＡＮＧ Ｋａｉ－ ｍｅｉ２ （ １．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００， Ｓａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ；
ＣａＣＯ３， 一方面可以很好的起到中和酸的作用， 发酵 液最终 ｐＨ 值在 ５．０ 以上， 减轻了后期酸作用排除 的工作量， 另一方面为乳酸菌的良好生长创造了条 件， 可以维持发酵液 ｐＨ 值在 ５．０～６．４ 之间。采用 ＣａＣＯ３ 中和酸法和牛津杯法抑菌试验， 最终筛选出 ９ 株活性较好的乳酸菌， 菌株编号分别为 １７４、１７７、 ２４０、３１６、３２９、３３３、３７２、３８１ 和 ３８６。
挑取对 ５ 种指示菌都有抑菌效果的 ４８ 株乳酸 菌菌株进行酸作用的排除试验， 调发酵上清液 ｐＨ 值为 ４．５， 用牛津杯法进行抑菌试验。指示菌经过 １６ ｈ 培养后观察， 乳酸菌 ｐＨ 值 ４．５ 时对照孔周围 没有出现抑菌圈， 而挑取的 ４８ 株菌有 １２ 株周围有 较好的抑菌圈， 对指示菌在一定程度上有抑制作 用， 测其发酵上清液 ｐＨ 值 ４．０ 左右， 最 低 时 ｐＨ 值 ３．４５， 最高时 ｐＨ 值 ４．６０， 说明乳酸菌产酸能力很 强， 但排除酸作用后仍有抑菌活性物质存在。
传统筛选方法主要有点种法， 滤纸片法， 打孔 法和牛津杯法， 经过比较最终决定采用牛津杯法。 此法可精确掌握样品量， 且操作方便， 抑菌圈边缘 整齐， 结果易观察。选取抑菌圈明显的进行记录， 结 果如表 １、表 ２。表 １ 和表 ２ 表明， 从泡菜水中可以 筛选出抑菌活性物质乳酸菌， 而且大量菌株有广谱 抑菌作用， 尤其是对蜡状芽孢杆菌有显著抑制作 用。
２．Ｈｕｂｅｉ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ： Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｙ Ｅｐ ｔｕｂｅｓ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｙ ＣａＣＯ３ ｔｅｓｔ ｉｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ． Ｔｈｉｓ ｋｉｎｄ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｍｏｒｅ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈａｎ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ． Ｉｔ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｅｒｏｂｅ ａｎｄ ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ ａｅｒｏｂｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ； ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ； ＣａＣＯ３ ｔｅｓｔ
ＣａＣＯ３ 中和酸法已很好排除酸的干扰， 挑取对 ５ 种指示菌有较好抑菌效果的 ９ 株乳酸菌菌株进行 过氧化氢作用的排除， 结果表明， 这 ９ 株乳酸菌菌 株水浴后抑菌圈的变化很小或几乎没有变化。说明 过氧化氢在乳酸菌的代谢产物中只占很少部分。过 氧化氢对热不稳定， ８０℃水浴 １０ ｍｉｎ 可排除过氧化 氢， 如果是过氧化氢在起抑菌作用， 那么水浴后过 氧化氢消失， 即没有了抑菌效果， 如果还有抑菌效 果说明不是过氧化氢的作用， 可能是其他活性物质 的作用。 ２．３ 传统筛选方法的筛选结果
１ 材料与方法
１．１ 样品来源 各地市售泡菜（ 包括四川、湖北、湖南、江苏、安
徽、福建、甘肃、河南、山东等地） １．２ 供试指示菌
大 肠 杆 菌 （ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ； 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌
（ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｎｉｕｎｓ） ； 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ） ； 枯 草 芽 孢 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） ； 蜡状芽孢杆菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ） ， 以上菌株 均由湖北省生物农药工程研究中心提供。 １．３ 培养基［３， ４］
第 ４６ 卷第 ５ 期 ２００７ 年 ９ 月
湖北农业科学 Ｈｕｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
Ｖｏｌ． ４６ Ｎｏ．５ Ｓｅｐ．， ２００７
文章编号： ０４３９－ ８１１４（ ２００７） ０５－ ０７４１－ ０３
一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法
张国强 １， ２， 杨自文 ２， 王开梅 ２ （ １．西北农林科技大学食品科学与工程学院， 陕西 杨凌 ７１２１００； ２．湖北省生物农药工程研究中心， 武汉 ４３００６４）
乳酸菌分离培养基（ ＢＣＰ 培养基） ； 乳酸菌筛选 培养基（ 改良 ＭＲＳ 培养基） ； 乳酸菌发酵培养基（ 改 良 ＭＲＳ 液体） ； 指示菌生长培养基 （ ＬＢ 液体培养 基） ； 抑菌实验培养基（ ＬＢ 培养基） 。 １．４ 方法 １．４．１ 乳酸菌分离与鉴定 取各种液体样品（ 固体 样品需先剪碎、研磨处理） ， 分别用无菌生理盐水作 梯度稀释， 选择适宜的稀释浓度梯度（ １０４， １０５， １０６） 用 Ｌ 棒涂布 ＢＣＰ 平板， ３０℃厌氧培养 ４８ ｈ， 挑取颜色 变黄特征性菌落， 多次划线纯化后保存于 ＭＲＳ 斜 面试管， 并做革兰氏染色镜检， 符合乳酸菌形态特 征的初步判定为乳酸菌菌株。 １．４．２ 乳酸菌发酵液制备 在灭菌的 １０ ｍＬ Ｅｐ 管