《分子克隆载体》PPT课件 (2)
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大肠杆菌分子克隆载体 PPT课件
第三节
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
6) λ载体的种类
i. 插入型—即将外源DNA直接插入已构建载体中，如 λgt11，可以插入长达7 Kb的DNA。这类载体被限制酶 切成左右臂。 ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中的一段 DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。这类载体 常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。 * 有的取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon 4A
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。 除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源 基因 （LacZα启动子）。
pBS载体的结构
pBS-SK(-)
T7
Plac
T3
pBS-KS(-)
Plac
LacZα ori
F1(-)
pBS
(3.0 kb) Ampr
ori
三. 噬菌体载体
二、质粒与质粒载体
1. E．coli的质粒种类
1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接 合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）
2.质粒的特点
1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料， EtBr，高温等) 6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
6) λ载体的种类
i. 插入型—即将外源DNA直接插入已构建载体中，如 λgt11，可以插入长达7 Kb的DNA。这类载体被限制酶 切成左右臂。 ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中的一段 DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。这类载体 常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。 * 有的取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon 4A
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。 除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源 基因 （LacZα启动子）。
pBS载体的结构
pBS-SK(-)
T7
Plac
T3
pBS-KS(-)
Plac
LacZα ori
F1(-)
pBS
(3.0 kb) Ampr
ori
三. 噬菌体载体
二、质粒与质粒载体
1. E．coli的质粒种类
1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接 合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）
2.质粒的特点
1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料， EtBr，高温等) 6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中
2-2章 大肠杆菌分子克隆载体
如插入片段的5’段定向缺失: XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase; 插入片段的3’-端亦可采用类似的方法进行缺 失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase） 不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又 例如: pBS+多克隆位点区的排列顺序是(见图)： 假设有一EcoRI→HindⅢ DNA片段，并要求在其3’-末 端或5’-端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子）， 显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用 pBS+中的多克隆位点区就能满足要求。
λ噬菌体的基因组
5’3’
-3’ -5’
1.线状双链DNA分子，全长48.502kb。 2.两端的5’末端具有12碱基的突出互补的粘性末端 （cohensive end，cos），该末端称为cos位点。 可被λ编码的A蛋白所识别 3.当λ侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端 连接成环状分子。
第三节
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
iii)
M13 噬菌体
单链DNA噬菌体的特点
（1）+DNA。（ssDNA） （2）复制型（RF）是双链环状DNA。
（3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态大 肠杆 菌。并产生噬菌斑。
（4）不存在包装限制。 （5）可产生大量的含有外源DNA插入片 段的单链分子，便于作探针或测序。
克隆载体-精品
转移特征： 分转移性和非转移性两个特征
命名规则： pUC19
“p”表示质粒（plasmid）
“UC”表示发现或构建该质粒的作者或实验室名称
“19”表示该质粒的实验编号
2020/7/2
9
质粒的生物学特性
1. 寄生性，质粒的宿主范围很广 2. 稳定性 3. 自主复制性，质粒的拷贝数多 4. 传递性 5. 表型效应 6. 可消除性 7. 重组性 8. 分子量较小 9. 不相容性，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同
5. Phagemid载体
一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体
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6
I
细菌质粒 载体
II
噬菌体 载体
III
柯斯质粒 载体
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I.细菌质粒载体
概念： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、 能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子
质粒是基因工程中最常用的运载体 而最常用的质粒是大肠杆菌的质粒
质粒的复制能在宿主细胞外完成吗？ 质粒的存在对宿主细胞有无影响？
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分类：
F质粒（F因子或性质粒）
R质粒（抗药性因子）
Col质粒（大肠杆菌素因子）
复制类型： “严紧型”的低拷贝复制质粒（拷贝数少，为1-5个） 与“松弛型”高拷贝复制质粒的（拷贝数多，可达10-200个拷 贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
一个寄主细胞系中稳定地共存的现象
质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质 粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的 复制则只能在宿主细胞内完成
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质粒载体的修饰改造
基因克隆的载体 PPT课件
基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
分子克隆ppt课件
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重组DNA的筛选与鉴定
重组DNA的筛选与鉴定方法
1 平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 2 限制酶切图谱筛选 3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
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23
• 平板筛选
是指利用载体的遗传性标记在平板上直接 筛选的方法。具有抗药性标记的载体转化 宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet） 的培养平板上生长；未转化的则不能生长
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长 度仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
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8
λ噬菌体结构
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上 有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把 噬菌体的DNA注入细菌内
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9
cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半 乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落
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LOGO
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3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
4
有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
5
从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
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5
分子克隆载体的选择-PPT课件
5. 合适的克隆位点
单克隆位点和多克隆位点
第九节
分子克隆载体的组建
构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点， 标记基因，载体容量等。
1. 克隆位点的建立
1) 体外重组
i. 减少限制酶识别位点 ii. 增加限制酶识别位点： 人工接头，匹配接头
2) 体内重组或突变
i. 减少限制酶识别位点 体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系 列载体时，去除Kanr 基因中的indIII位点就采用了以下技 术路线： 培养有pNG35的大肠杆菌细胞 提取质粒DNA 用HindIII 完全酶切 转化大肠杆菌 再提取质粒DNA 再酶切，
2. 标记基因的建立
1）启动子 2）编码区—密码子偏爱性，基因产物适用范围 3）终止子
3. 载体容量
尽可能除去无关的DNA序列。
第二章 练习题
1．当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的HindⅢ克隆位 点后，重组质粒仍可转化E.coli (CmlsTcs) 为CmlrTcr ，为什么? 可设计什么实验证明其假设? 2．当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落， 兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳 检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质 粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白 色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果? 可 设计何种实验证明你的解释是正确的? 3．当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化 E.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类， 即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样， 从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收 插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却
分子克隆载体 ppt讲义转pdf
AU A G C A CG GC CG CG GC 5’…AUACCA UUUUUUUUU…3’ ’… …
UUUU...…
RNApol RNA pol
5¢ 5 ¢ 3¢ 3 ¢ 3¢ 3 ¢ 5¢ 5 ¢
5´pppG 5
茎环结构使转录终止的机理 茎环结构使转录终止的机理
一、pBR322
调控序列
增强子 启动子
结构基因
UAS 酵母
TATA
核糖体结合位点（S-D序列）
mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列 (Shine-Dalgarno)，又称为核糖体结合点。
3’… A CACUAGG…5’ 16sRNA U C U-C-C-U 5’……A G G A PuPuUUUPuPu…AUG mRNA
表达体系的发展
表达体
第一代 原核生物表达体系 第二代 酵母表达体系 第三代 哺乳类细胞表达体系 第四代 基因直接导入
载体
质粒、噬菌体 穿梭质粒 病毒、脂质体 DNA本身
宿主
细菌 酵母 培养细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。 基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结 合等组成的表达体系的调控。 基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修 饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知 识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
P
O
Z Y X
诱导物 诱导物
乳糖(或IPTG)
P O
Z Y X
Am
lacZ
N H 2
COOH
a片段 片段
w片段 片段
lacZ
标志补救（ß-半乳糖苷酶法） ß 半乳糖苷酶法）
UUUU...…
RNApol RNA pol
5¢ 5 ¢ 3¢ 3 ¢ 3¢ 3 ¢ 5¢ 5 ¢
5´pppG 5
茎环结构使转录终止的机理 茎环结构使转录终止的机理
一、pBR322
调控序列
增强子 启动子
结构基因
UAS 酵母
TATA
核糖体结合位点（S-D序列）
mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列 (Shine-Dalgarno)，又称为核糖体结合点。
3’… A CACUAGG…5’ 16sRNA U C U-C-C-U 5’……A G G A PuPuUUUPuPu…AUG mRNA
表达体系的发展
表达体
第一代 原核生物表达体系 第二代 酵母表达体系 第三代 哺乳类细胞表达体系 第四代 基因直接导入
载体
质粒、噬菌体 穿梭质粒 病毒、脂质体 DNA本身
宿主
细菌 酵母 培养细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。 基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结 合等组成的表达体系的调控。 基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修 饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知 识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
P
O
Z Y X
诱导物 诱导物
乳糖(或IPTG)
P O
Z Y X
Am
lacZ
N H 2
COOH
a片段 片段
w片段 片段
lacZ
标志补救（ß-半乳糖苷酶法） ß 半乳糖苷酶法）
第三章 分子克隆的载体 ppt课件
✓ 选择标记基因selective marker gene 用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的
宿主挑选出来 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记
24
•氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） •四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） •氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） •卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid • 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
18
2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片 段插入到载体中。
34
35
二、质粒载体的种类
1. pBR322之前 2. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标
的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天
26
•正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因 产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。 如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来 说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组 子。
宿主挑选出来 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记
24
•氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） •四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） •氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） •卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid • 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
18
2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片 段插入到载体中。
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二、质粒载体的种类
1. pBR322之前 2. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标
的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天
26
•正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因 产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。 如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来 说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组 子。
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基因)lacz’基因。
6
但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能
用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。
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20
构建质粒载体的基本原则
4 选用合适的启动子
如果用真核生物基因的启动子作为原核 生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；
原核生物和病毒基因的启动子用作真核 生物表达克隆载体的启动子，可保留其原来 的功效。
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15
2 质粒的不相容性(incompatibility): 两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。
亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。
野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质 粒。
当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑 受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属 于亲和性质粒。
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9
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露 的dsDNA分子。
一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。
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10
以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
作为受体细胞最好不含内源质粒。
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16
3 质粒的转移性
接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合
成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的 结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。 非接合型质粒(non-conjugative plasmid)：
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
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12
质粒DNA的大小
质粒
宿主
pPbs
蓝藻
CoLE1
大肠杆菌
PV21
三叶草根瘤菌
多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
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13
质粒的基本性质： 1 复制
按照质粒控制拷贝数的程度，可以将质粒分 为: 1）严谨型质粒(stringent plasmid)
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因；
5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
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6
多克隆位点
MCS
复制起始点 ori
遗传标记
Ampr
克隆载体
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7
按功能分：
克隆载体
表达载体
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8
质粒克隆载体 (plasmid cloning vector)
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1
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
DNA ligase
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载体自连
目的基因 自连
2
基因操作的基本步骤
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3
载体
单独一个包括启动子、编码区和终止子的 基因，或者组成基因的某个元件，一般是不 易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入 细胞后，也不容易在受体细胞内维持。
得含有某种元件的DNA片段。 为了获得含某种元件的DNA片段，选用的
切割位点既要保证元件完整无缺，又要使 DNA片段愈小愈好，尽可能不含或少含不必 要的序列，使构建的载体尽可能小。
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19
构建质粒载体的基本原则
3 组装合适的选择标记基因
4
5
构建供转化大肠杆菌用的质粒载体，
可组装蓝/白颜色进行选择的(B-半乳糖苷酶
顺式作用元件： bom位点 移动基因：mob基因 (分子质量小、拷贝数多、被动迁移)
精选ppt
17
构建质粒载体的基本原则
1 选择合适的出发质粒 必备元件： A 复制起始点 B 选择标记基因 C 克隆位点 D 启动子 E 终止子 等等………..
精选ppt
18
构建质粒载体的基本原则
2 正确获得构建质粒载体克隆元件 一般用限制酶切割出发质粒DNA分子，获
精选ppt
21
构建质粒载体的基本原则
5 在能达到预期目的的情况下，构建过程要 力求简单。
精选ppt
22
构建质粒克隆载体的基本策略
1.构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受 体细胞中进行有效的复制，并作为质粒克 隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝 数。
2.构建的质粒克隆载体必须含有允许外源 DNA片段克隆的位点，并这样的克隆位点 应尽可能多。
载体(vector): 能携带外源基因（或 DNA片段）进入细胞复制、整合或表达 的工具。
精选ppt
4
作为克隆载体的DNA分子具备的条件：
1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞；
2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基 因的增殖；
精选ppt
5
3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）；
如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分 别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。
精选ppt
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选择标记基因：(用于鉴别目的DNA的存在， 将成功转化了载体的宿主挑选出来）
(1)氨苄青霉素抗性基因 (ampr apr) (2)卡那霉素抗性基因 (kanr kmr)
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3.构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆 子的标记基因。
4.构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。
5.根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中 组装各种元件，构建成不同用途的质粒克 隆载体。
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质粒的命名
用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字 母后用两个或三个大写字母代表发现这一质粒 的作者或实验室名称，再加上质粒编号。
拷贝数少，为1～5个 2 ）松散型质粒(relaxed plasmid)
拷贝数多，可达10个拷贝以上
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某种质粒属于严谨型或是松散型的，与 宿主有一定的关系。
例子：质粒ColE1-K30在大肠杆菌中属 于松散型的，在奇异变形杆菌中是严谨型 的。
一般来说，希望构建的质粒克隆载体是 松散型的，所以在构建的克隆载体中应含 有松散型的复制起始位点和调控复制拷贝 数的基因。
(3)四环素抗性基因 （tcr tetr）
(4)氯霉素抗性基因 (cmpr cmr)
(5)新霉素抗性基因（neor）
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pBR322
pBR322的大小是4361bp的环状双链DNA，其碱基序列 已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。
含有24种限制酶的单一识别位点，具有四环素抗性基 因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。