植物组织培养—第一章

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实验室设计
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一、准备室
作用：材料、培养器械的清洗、培养基准备、灭菌等的 准备工作。
✓ 普通化学实验室：仪器及设备、化学药品。 纯水仪、冰箱、移液枪、过滤灭菌器、电炉、微波炉、 磁力搅拌器、低速台式离心机、电脑等 。 作用：配制培养基。
✓ 洗涤室：清洗、贮存器皿设施、鼓风干燥箱等。 作用：玻璃器皿、用具和培养材料的洗涤。
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⑤ 马铃薯萃取液：多用于壮苗的培养，在使用时可将马铃薯 去皮、切碎、水煮20一30分钟，然后将滤液加入培养基中， 其用量通常为100—200g/L。当培养基中添加了马铃薯萃 取液后，可以对pH产生缓冲作用，试管苗也生长得更为健 壮。
⑥香蕉：多用于兰花的组织培养，将成熟香蕉果肉捣烂后， 添加到培养基中，用量150—200g/L。香蕉果泥可缓冲培 养基的pH，对外植体的分化有着较为明显的促进作用。
2. 继代培养基： 诱导出愈伤组织后，使愈伤组织 能不断地生长下去的培养基。
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3. 分化培养： 由愈伤组织诱导形成小苗（幼芽或胚状体）
的培养基。
• ① 不加任何激素的基本培养基，即可诱导分化。 如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。
• ② 加较高浓度细胞分裂素和少量生长素培养基。 如烟草、矮牵牛、四季海棠、天竺葵、菊花、 倒挂金钟等组织的分化。
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三、无菌操作：
1. 接种室以及工作台灭菌：紫外灯30分钟，用时一 定要关闭它。
2. 工作台消毒：70%乙醇，用小型喷壶消毒或棉球 擦拭。
3. 点燃酒精灯，开启灭菌器,对使用器械进行烧烤灭 菌。器械冷却后方可使用。
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第三节 培养基的配置
一、培养基成分
（ culture medium：维持离体细胞生存和生长的溶液）
新的玻璃器皿：0.1﹪HCl浸泡12小时，洗衣粉、自来水洗、蒸馏水冲。 污染的玻璃器皿：要先高压灭菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。
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二、灭菌方法：
1. 干热灭菌： 利用鼓风干燥箱（烘箱）进行烘烤灭菌的方法。箱内温度控 制在150℃，120min。玻璃器皿.
2. 湿热灭菌： 利用高压蒸汽灭菌的方法。一般温度为121℃，压力0.1MPa， 消毒15～20min。培养基灭菌.
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4、 附加物类 常用附加物类有: ① 琼脂(Agar): 组织培养支持物.本身并不提供任何营养，
它是一种高分子的碳水化合物，从红藻等海藻中提取， 仅溶解于热水，成为溶胶，冷后(40℃以下)即凝固为固 体状的凝胶。在固体培养方式中不可缺少。一般用量为 0.5%～1.0%，有固体条状和粉状两种。 ② 琼脂糖(Agerose):可改善培养物的供氧状况。 ③ 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、维生素C（Vc）以及硝酸银 等，可防止培养材料的褐变. ④ 活性碳(AC)：具有吸附能力，减少有害物质的影响，如 可防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。也有利于某 些植物生根 .用量1-5%.
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③ 赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）和多效唑（PP333）等 生长调节物质也在组织培养中应用。
GA3—主要用于促进试管苗的生长。 ABA—体胚的发育成熟。 PP333—促进壮苗。
在组织培养中，生长素的主要作用是诱导外植体脱分化产生 愈伤组织及促进培养物生长，诱导根器官的分化。
细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂和分化，诱导不定 芽和胚状体的分化和形成，延缓组织衰老，增加蛋白质合 成。
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自动双重纯水蒸馏器
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✓灭菌室： ①高压蒸气灭菌装置：如立式、卧式和手提式灭菌器。
作用：培养基、器械、棉塞、无菌纸等灭菌消毒
USING THE AUTOCLAVE TO STERILIZE MEDIA, GLASSWARE OR OTHER LAB UTENSILS
高压灭菌设备 7
② 细菌过滤器：用于液体培养基灭菌装置。
主要有： 1、无机盐(inorganic elements)：包括大量元素（N，P， K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn、B、Mo、 Cu、Cl、Co、I）。 2、 有机化合物（organic compounds) ：碳源（糖类）， 维生素类，有机含氮化合物。 3、植物生长调节物质：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱 落酸等。 4、 附加物类：琼脂，活性炭，椰乳，硝酸银等。
工作原理:
利用鼓风机驱动空气 遁过高效过滤器除去 空气中的尘埃颗粒， 使空气得到净化。 净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
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三、培养室
作用： 进行材料的培养的场所。 其大小、规模可根据工作性质设定。以充分利用空间和 节能为原则。
设备： 可调控光、温、湿度等设备。 还有固定式培养架、转床、摇床。 适用于器官（芽、茎、花药等）、愈伤组织、细胞和原 生质体的固体培养和液体培养。
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生长素和细胞分裂素对拟南芥愈伤组织器官分化的影响
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生长素和细胞分裂素对褐斑伽蓝叶片器官分化的影响
6-BA 0.5mg/L
NAA 0.5mg/L
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（三）培养基按其物理性质划分为：
• 固体培养 在培养基中加入一定量的凝固剂，使液体培养基固化,一般 用于组织或器官培养.
3. 熏蒸灭菌： 利用药物熏蒸以达到灭菌的目的。用甲醛内加入高锰酸钾、 百菌清、硫磺熏蒸。用3%来苏尔溶液或1%漂白粉水溶液， 或0.2%过氧乙酸溶液喷洒、拖擦地板。培养室、接种室灭 菌.
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4. 过滤灭菌： 使溶液通过夹有微孔滤膜的漏斗，滤膜孔径需选用0.3～ 0.45μm。在无菌环境下，用真空泵抽滤，其滤液为无菌。 液体培养（不耐高温活性物质）
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培养细胞或组织的各种器皿
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四、细胞学实验室：
作用：细胞学和组织学观察。 需备有高倍显微镜、体视显微镜、倒置显微镜、各种相机、 恒温箱、切片机、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻 片等。
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五、温室： 作用：培育组织与细胞培养出来的材料，组培苗的移栽锻炼。
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第二节 基本操作
• B5培养基 铵的含量较低。在豆科植物上应用最多。 培养大豆细胞和组织培养设计。
• White培养基 成分比较简单，无机盐和糖的用量低。
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（二）培养基按试验目的分为：
诱导培养基，继代培养基，分化培养基，生根培养基。
1. 诱导培养基 （脱分化培养基）： 外植体诱导发 生愈伤组织的培养基。
水稻诱导愈伤组织时加2.4-D；而烟草、胡萝卜 既需生长素，又需细胞分裂素。
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② 维生素类
作用：直接参与生物催化剂（酶）的形成、蛋白质、脂肪代谢等重要生 命活动。
VB1（Thiamine-HCl, 盐酸硫胺素）参与碳水化合物等有机物转化，促进 生长素诱导不定根的发育。用量10mg/L。
VB5 (Nicotinic Acid，烟酸 )，可促进培养物生长。烟酸是尼克酰胺的前 体，尼克酰胺核苷酸是脱氢酶辅酶NAD+、NADP+的成分。用量 1mg/L。
5. 药剂灭菌： 用70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸钠、新 洁尔灭、Clorox等药剂灭菌的方法。培养材料灭菌。
6. 烧灼灭菌： 用酒精灯烧灼达到灭菌的目的。接种器具灭菌。
7. 射线灭菌： 用紫外线照射的方法灭菌。照射时间一般为15～30min。 接种时应关闭紫外灯。室内灭菌。
大家好
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第一章 实验室与基本操作
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第一节 实验室及其基本设备
• 实验室的大小取决于工作的目的和规模： 1. 以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则
会限制生产影响效率。 2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程
序来设计避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。 • 植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做 到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同 时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
VB6（Pyridoxine-HCl，盐酸吡哆醇）参与植物氮代谢,促进愈伤组织生长、 提高愈伤组织分化能力、促进培养物生长。用量1mg/L。
叶酸（VB9）促进培养物生长，参与嘌呤、嘧啶合成。
VB12（生物素VH）培养物也有促进作用。
肌醇（Myo-insotol , 环己六醇）：具有帮助活性物质发挥作用的效果，可 提高VB1的效应。同时对促进培养物的生长，胚状体及芽的形成有良好 作用。
• ③ 只加细胞分裂素的培养基。如豌豆、油菜、 小麦等。
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4. 生根培养基： 诱导再生小苗生根的培养基。
① 在无任何生长激素的基本培养基中就可生出良 好的根系。如烟草、红薯、草莓、枸杞等。
② 有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以诱导根。
③ 有些需要减低培养基中无机盐的浓度。如用MS 培养基中1/2或1/4的无机盐诱导生根，常可获 得良好的效果。
细菌过滤器
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二、无菌操作室
作用： 进行植物材料分离接种的重要场所，需长时间的无菌操 作，对组织培养成功起关键作用。
试验设施： 超净工作台 紫外灯 固定式和移动式载物台 消毒器、广口瓶、酒精灯、酒精棉、机械支架 手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等
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超净工作台 (a laminar flow hood)
用量：一般50～100mg/L。
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③有机含氮化合物
氨基酸：常用的为：甘氨酸及酰胺类物质。 如谷氨酰胺（Glutamine），天冬酰胺和多种氨基酸 混合物。水解乳蛋白（Lactalbumin hydrolysate, LH）、 水解酪蛋白（Casein hydrolysate，CH）。
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3、植物生长调节物质
① 有机碳源：即糖类。 作用： 维持培养基的合适渗透压对初生细胞和原生质体的完整性有 十分重要作用。另外，糖类也是合成有机物的碳源。
最常用有：蔗糖、葡萄糖、果糖、多糖、可溶性淀粉和糊精。 作为氮源，蔗糖一般浓度为2%～3%。
糖的浓度影响组织分化类型： 在高浓度（3%～4%）的蔗糖有利于韧皮组织分化； 低糖浓度（1.5%～2.5%）时，仅生长出木质部； 适中浓度时形成具有木质部和韧皮部。
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微量元素 主要包括Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I
等。 植物对这些元素需要量甚微，稍多会发生毒害。
Fe是用量较多的一种微量元素，对组织中叶绿素的 合成和延伸生长起重要作用。
铁常以FeSO4和乙二胺四乙酸钠(Na2-EDTA)的螯 合物存在于培养基中。
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2、 有机化合物（organic compounds)
一、洗涤方法
1、重铬酸钾洗液：
饱和的重铬酸钾洗液：43克重铬酸钾溶于1000毫升蒸馏水中（饱和溶 液）。按1：1体积比将浓硫酸缓慢地倒入饱和重铬酸钾水溶液中。
流程：
（12h）
水洗 → 晾干 → 重铬酸钾洗液 → 自来水冲净 、蒸馏水洗两次 → 干燥
2、洗涤剂：洗衣粉、洗液
3、超声波洗净器：小型玻璃器皿，顽固性污渍。超声波除污。 （要加水）
⑦椰乳：Coconut milk, CM。用于较难培养的植物材料的 培养基中。可将椰子的液态胚乳取出、或高压灭菌，或无 菌过滤。使用浓度100-200mL／L。
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二、培养基的种类
（一）常用的培养基 • MS培养基
无机盐数量适宜，硝酸盐、钾和铵盐的含量比其他培养基 高。
应用最广泛。主要用于园艺植物、木来自百度文库植物、花卉、蔬菜 等的组织培养。
①生长素： 吲哚乙酸（IAA）：在培养组织中有吲哚乙酸氧化酶，可使IAA解 体，而且也可在光下分解，用量稍高。 吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA），人工合成化学物质，用量 低（0.1～2mg/L）。 2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），作用比IBA和NAA强。
②细胞分裂素： 激动素（Kinetin, KT） 6-苄基腺嘌呤（6-Benzyladenine, 6-BA） 玉米素（Zeatin, ZT） 2-异戊烯基腺嘌呤（2-Isopentenyl adenine, 2iP） 噻重氮苯基脲（Thidiaznron, TDZ）（噻苯隆）
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1、无机盐(inorganic elements)——大量元素和微量元素
大量元素 ① N：用量最多。常用的有硝态氮和铵态氮，KNO3、
NH4NO3植物组织 从培养基中吸收氮后形成蛋白质。 ② P：在植物组织培养在的细胞增殖分化大量需要。主要 从NaH2PO4、 KH2PO4供应。磷参与核酸、能量代谢。 ③ K：直接影响培养物中酶的活性。主要由KCl、KNO3或 KH2PO4供应。 ④ Ca、S、Mg： CaCl2、Ca(NO3)2作为Ca来源， MgSO4作为S和Mg的来源。