实验技术路线

表达蛋白的活性检测
sema4e免疫磁珠的制作 sema4e与plxnd1 免疫共沉淀
sema4e与plxnd1在斑马鱼脊髓损伤修复中的作用研究：
细胞水平 转染的仓鼠肾细胞与神经元共培 养,观察轴突生长情况，并通过相 应抗议抑制sema4e与plxnd1可 能的相互作用后观察轴突生长情 况 转染的仓鼠肾细胞与血管内皮 细胞共培养，观察血管内皮细 胞增殖情况，并通过相应抗议 抑制sema4e与plxnd1可能的相 互作用后观察血管内皮细胞的 增殖情况
技术路线
双光子激光建立斑马鱼脊髓损伤模型的探索：
14dpf 幼年斑马鱼 0.033%MS222麻醉 明场下对脊髓定位，利用双光子强 激光对脊髓进行深度扫描切割损伤
对损伤后的斑马鱼 进行解剖，观察扫 描处的脊髓及周围 组织的损伤情况
同时在损伤位点以下 2mm注射反向示踪剂 生物胞素 12小时后做纵切切片， 利用生物胞素抗体做 免疫染色
组织水平
损伤6周后做神经轴突来自百度文库向追踪， 损伤6周后，做组织切片，血管 观察轴突生长通过损伤面情况 免疫染色，统计损伤处的血管 密度
损伤6周后，于第一次损伤位点 以下5mm显微注射示踪剂Alexa Fluor Red Dextran,12小时后活 体观察神经元轴突的生长通过损 伤面情况 损伤6周后，活体观察在血管内 皮细胞内表达GFP的转基因斑 马鱼的脊髓损伤处血管密度
12小时后做纵切切 片，利用GAFP抗 体和纤连蛋白抗体 做免疫染色
5小时后通过行为 学软件分析损伤 后的运动能力， 判断损伤程度
判断胶质斑痕的位 置与大小是否符合
判断损伤的位置与大 小是否与符合
前期实验：
手术建模： 手术组（n=68） 假手术组（n=68）
建模成功性分析：每周分析术 后运动能力，连续跟踪7周 取脊髓（损伤位点以下1cm）： 术后4hour, 12hour, 6day, 11day组
Real time PCR
change folds
time points
sema4e:
10X anti-sense probes plxnd1: sham
10X 4hour
10X
10X 12hour 11day
10X
10X anti-sense probes
10X sham
10X 4hour
10X 12hour 11day
10X
通过双光子显微镜活体观察斑马鱼 脊髓内的血管
plxnd1 在血管内皮细胞上表达
10X
20X
sema4e与plxnd1关系研究：
sema4e活性片段 DNA的扩增 sema4e表达载体的构建 表达载体的导入
sema4e特异性肽段的 设计与合成 噬菌体展示技术淘选抗体
转染细胞的筛选与培养 表达蛋白的提取
ELISA检测抗体活性 ELISA检测抗体专一性 sema4e与plxnd1 免疫共定位
活体水平
整体水平
手术后给sema4e; plxnd1; control morpholino. 6周后做运动能力分 析，统计比较修复速度
前期结果
图1：斑马鱼脊髓损伤后的运动能力的变化
Before lesion
Red: sham operation (n=10) Blue: operation (n=10)
基因芯片分析： 提总RNA 分析全部基因 的表达水平， 统计分析各个 基因表达变化
定量PCR： 提总RNA 反转录 检测sema4e 和plxnd1 相 对内参 GADPH表达 水平的变化
原位杂交： 制作切片 制作探针 检测sema4e和 plxnd1 mRNA的 表达水平变化及 表达细胞
Westen Bolt： 提总蛋白 检测sema4e 和plxnd1蛋 白表达水平 的变化