流式细胞术实验方法及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术是通过一种名为流式细胞仪的仪器完成的，它能够以非常
高的精确度进行分析和检测。
流式细胞仪通过一根轴，从这个轴上有三根
弹性管，细胞进行注射，从而使细胞在管中行进，细胞同时也受到外界信
号的影响，这种信号可以来自磁场、电场或光场。
当细胞运行到仪器的另
一端时，它们会被照亮，通过一台摄像机可以拍摄到高清晰度的照片，然
后在计算机上进行分析处理。
流式细胞术广泛应用于早筛检、医学诊断、药物发现、药理学实验和
抗生素耐药性研究等方面，它能够更加精确、快速地进行细胞分析。
此外，流式细胞术也可以用于分析抗原抗体，免疫细胞介导的反应，以及细胞因
子如细胞因子和表面受体等的表达情况。
这种技术还可以用来监测血液中细胞水平的变化，如血小板、红细胞、白细胞等。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术
流式细胞术检测淋巴细胞表面标记一、实验目的1.了解流式细胞仪的组成、原理及应用：初步了解流式细胞仪的工作元件及基本应用原理；能够认识流式细胞术的应用，特别是常用的一些功能。
2. 熟悉用流式细胞术检测小鼠脾脏T细胞表面标志的基本流程3. 学习并掌握流式细胞术结果的分析：能够基本看懂结果图，重点掌握“门”和“补偿”两个概念。
二、实验原理1.流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选。
特点：可检测的样本种类多样，大小范围较广（0.2~50µm）；检测速度快，分析样本量大（快速、大量）；细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏；采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度10000个细胞(微粒)/秒与统计分析精确性。
2. 流式细胞仪组成及原理Fluidics (液流系统)——流体动力学聚焦样本形成单细胞流。
鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液。
主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
匀速流动，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。
Optics (光学系统)——激发和收集光信号。
激发系统包括：激光器、透镜和反射镜，将激光聚焦到检测区收集系统包括：光学镜片和滤光片、光信号检测器流式细胞仪收集的信号：（1）散射光信号：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光(信号强弱与细胞体积大小成正比)和侧向散射光(检测细胞粒度和细胞内相对复杂性)。
流式细胞术实验方法
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
微生物检测技术中的流式细胞术的应用教程
微生物检测技术中的流式细胞术的应用教程流式细胞术是一种广泛应用于微生物检测技术的高效、准确的方法。
它利用流式细胞仪对微生物细胞进行快速而准确的检测和分析，为微生物学研究、病原体诊断和环境监测等领域提供了重要的工具。
本文将为读者介绍流式细胞术的基本原理、实验步骤和常见应用。
流式细胞术的基本原理是利用流式细胞仪的光学系统将待测样品中的微生物细胞逐个通过一个狭窄的流道，并通过激光束照射细胞，然后测量经过细胞的散射和荧光信号。
利用这些信号，流式细胞仪可以快速确定微生物细胞的数量、大小、形态以及特定标记物的表达情况，从而对样品进行定性和定量分析。
在进行流式细胞术前，首先需要准备样品。
样品可以是来自培养基中生长的微生物细胞、环境样品（如水、土壤）中的微生物细胞，或者是体内组织、血液等样品中的微生物细胞。
样品通常需要进行处理，如细胞固定、细胞染色或荧光标记等，以便流式细胞仪可以准确识别和测量细胞。
接下来是样品的处理和染色步骤。
在流式细胞术中，常用的样品处理方法包括离心、过滤等，以获得单个细胞的悬浮液。
然后，可以通过荧光染色或标记物标记细胞，以便流式细胞仪可以进行荧光检测。
染色既可以针对整个样品中的细胞，也可以特异性染色，以检测感兴趣的微生物细胞。
样品处理和荧光染色完成后，就可以开始使用流式细胞仪进行细胞检测和分析了。
将样品注入流式细胞仪的进样室中，仪器会将细胞逐个引入流道，并通过激光照射细胞。
细胞与激光相互作用后，产生的信号会被流式细胞仪捕捉和测量。
流式细胞术常用的参数有三个：前向散射光（forward scatter, FSC）、侧向散射光（side scatter, SSC）和荧光信号。
前向散射光与细胞的大小和形态相关，侧向散射光与细胞的复杂度和颗粒含量相关，而荧光信号则与标记物的特异性结合情况相关。
通过测量和分析这些参数，可以获得关于细胞数量、大小、形态和特定标记物表达的信息。
除了基本的细胞检测和分析，流式细胞术还可以进行更加复杂的功能性分析和分选操作。
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
流式细胞术实验方法及应用
2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时， 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。
流式细胞术的应用范围
细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
加OptiLyes C溶血素250ul
PBS洗一次
抗体:
上机分析
CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体
CD19-PE/CD3-FITC二标抗体 CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体
IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照
淋巴细胞亚群检测临床意义：
育15-30min → 溶血素→ 室温10min → PBS洗1次
→上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
室温，15 min 室温，15 min
洗涤
PBS洗涤1次
上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记
流式细胞术的基本原理及其应用
流式细胞术的基本原理及其应用流式细胞术的基本原理是通过将携带荧光标记物的细胞单个穿过一个经过纳米级微孔的流动细胞仪中，在仪器静止状态下，用激光束照射细胞，测量细胞散射光强度和荧光素（荧光标记物）发射光强度，并对荧光标记物进行定量和定性分析。
流式细胞术有多个功能模块来实现这些原理，包括样本处理和采集、检测光源、光学系统、示波器、计算机控制和数据分析软件等。
应用方面，流式细胞术在免疫学、细胞生物学和药物研发等领域具有广泛的应用。
以下是几个流式细胞术的应用举例：1.免疫细胞表型分析：可以通过流式细胞术对白细胞表面的特定抗体标记物进行检测和分析，了解免疫细胞的分布、组成和功能状态。
这种技术在临床用于诊断和监测疾病，例如血液肿瘤的分型和监测、感染和免疫疾病的诊断。
2.DNA细胞周期分析：流式细胞术可以通过染色体分析来检测细胞周期的不同阶段，并评估细胞的增殖和DNA损伤。
通过分析细胞周期，可以确定干细胞、肿瘤细胞和其他细胞类型的比例，从而研究生物学和疾病发展过程中的细胞生长和增殖。
3.细胞凋亡分析：流式细胞术可以用荧光标记物来检测和分析细胞凋亡（程序性细胞死亡）的过程。
凋亡是正常生理和病理过程中的重要事件，例如生长发育和肿瘤发生。
通过分析细胞表面和内部标记物的表达和活性变化，可以了解细胞凋亡的诱导和调控机制。
4.细胞分选和分离:流式细胞术可以通过荧光标记物和细胞大小、复杂性等参数来识别和分选特定类型的细胞。
这种细胞分选技术在基因表达、单细胞转录组学、干细胞研究等领域具有重要应用，可以帮助研究者对细胞进行单个细胞水平的分析。
5.离子指示染料测定：通过使用与细胞膜融合的离子指示染料，流式细胞术可以测定细胞内离子浓度和动态变化。
例如，钙离子（Ca2+）作为重要的细胞信号分子，流式细胞术可以实时监测细胞内钙浓度的变化，并研究其与细胞功能和相应生理过程的关联。
总之，流式细胞术作为一种高通量、高灵敏度和多参数的细胞分析技术，在免疫学、细胞生物学和疾病研究中起着至关重要的作用，不仅可以提供定量的细胞信息，还可以为深入理解细胞生命活动和机制提供有效的实验手段。
流式细胞术在成熟淋巴细胞肿瘤诊断中的应用
01 引言
03 参考内容
目录
02 实验方法
引言
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在医学领域中广泛应用的技术， 具有高效、快速、敏感等优点。它通过将细胞悬浮在流水中，并利用特定的抗体 对细胞进行标记，从而对细胞进行种类、功能等方面的分析和检测。在淋巴细胞 肿瘤诊断中，流式细胞术能够通过对成熟淋巴细胞的表面标志物进行检测，为临 床提供更准确、更快速的诊断结果。
参考内容三
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的 技术。它已经成为免疫学研究中的重要工具，并被广泛应用于免疫细胞的分型、 功能和活性测量。
1、细胞分型：流式细胞术可以用来对免疫细胞进行精细的分型。通过使用 不同的抗体标记，可以识别和区分各种类型的淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细 胞等。同时，对于细胞亚群的识别和计数，流式细胞术也具有高灵敏度和高精度 性。
4、疾病诊断：流式细胞术在免疫学中的应用也扩展到了临床诊断。例如， 流式细胞术可以用来检测自身免疫疾病、癌症和感染等疾病中的异常免疫反应。
5、疫苗开发：流式细胞术可以帮助科学家们研究免疫反应的机制，从而为 疫苗开发提供重要的信息。例如，通过流式细胞术，科学家们可以跟踪疫苗接种 后免疫细胞的反应，以便优化疫苗设计和接种方案。
1、免疫分型：流式细胞术能够通过对细胞表面抗原的检测，对淋巴细胞、 白血病、骨髓瘤等免疫相关疾病进行分型和诊断。例如，通过检测T细胞亚群的 分布和功能，可以对自身免疫性疾病、感染性疾病等进行诊断和鉴别诊断。
2、感染诊断：流式细胞术能够快速准确地检测病毒、细菌和其他微生物等 感染引起的特异性免疫反应。例如，通过检测抗原特异性抗体水平，可以快速诊 断流感、肺炎等感染性疾病。
流式细胞术标准操作规程,1200字
流式细胞术标准操作规程流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞学研究技术，广泛应用于细胞表型分析、细胞分选、免疫学研究等领域。
为了确保流式细胞术的准确性和可靠性，需要遵循一系列的标准操作规程。
1. 实验前准备- 确保流式细胞仪、计算机和相关设备正常工作，包括保证激光器、光学系统等的正常运行。
- 确保光谱校准及标定的准确性，包括日常监测仪器的性能、定期校准补偿参数等。
- 准备所需试剂和标记抗体，确保其质量良好并符合实验要求。
2. 样本处理- 根据实验目的选择合适的细胞来源和取样方式，并保持细胞的完整性及活性。
- 根据细胞类型和实验需要选择适当的预处理方法，如细胞固定、细胞膜穿透等。
- 对于固定样本，要避免过度固定和过度穿透，以免影响细胞染色和光学性能。
3. 样品标记- 预先优化标记抗体的浓度和反应时间，确保准确的抗原检测和最大的靶向效率。
- 避免标记抗体和细胞表面抗原的非特异性结合，应加入相应的负对照组和等位控制。
- 合理选择荧光染料和标记方法，避免光谱重叠和串扰，以确保标记物的准确检测。
4. 流式细胞仪调试及仪器设置- 根据样本类型和实验需求，选择适当的仪器设置，包括选择合适的激光器、滤光片和检测参数等。
- 对于多色染色，进行补偿设置以消除光谱重叠和仪器漂移带来的影响。
- 定期校准和检验仪器的参数，确保仪器性能和数据稳定性。
5. 流式细胞术操作- 严格控制实验要求的温度、湿度和光照等环境条件，避免对细胞和染料的影响。
- 合理设置流速和事件采集数目，以确保准确且充分的样本分析。
- 避免空管事件和双重事件的发生，及时清理堵塞和冲洗流式细胞仪采集管路。
- 对于稀有事件和低频事件，需要增加采集数目和合理的补偿设置，以提高检测敏感性。
- 及时保存数据和相应的控制实验数据，以备后续数据分析和结果验证。
6. 数据分析和结果解释- 使用专业的流式细胞术分析软件进行数据处理和结果分析。
- 对于多色染色，应进行合理的补偿和背景校正，确保数据的准确性和可靠性。
流式细胞术多色荧光分析指南
流式细胞术多色荧光分析指南流式细胞术多色荧光分析是一种用于细胞表型、功能和状态分析的重要方法。
利用流式细胞仪和多色荧光标记的抗体，可以同时检测多个细胞表面分子、胞内蛋白、核酸等分子的表达水平和活性状态，为研究细胞的功能和疾病发生机制提供了强大的技术支持。
本文将详细介绍流式细胞术多色荧光分析的实验步骤、注意事项和数据分析方法。
一、实验步骤1.细胞样品的制备首先，需要准备良好生长状态的细胞样品。
细胞可以来自体外培养的细胞系、原代细胞、细胞悬液、血液或组织样本等。
将细胞样品离心收集，并用适当的生理盐水或细胞培养基洗涤细胞，去除杂质和细胞培养基中的药物或抗体。
2.细胞荧光标记在合适的体积中加入细胞样品，使细胞浓度适宜（一般为10^6 ~10^7个/ml）。
接下来，根据研究需求，在细胞样品中加入适当浓度的荧光标记抗体，进行免疫反应。
免疫反应一般需要在室温下进行20 ~ 30分钟。
为了防止非特异性结合，可以添加适当浓度的不相干（Isotype）控制抗体。
3.洗涤和固定免疫反应结束后，需要用生理盐水或缓冲液进行洗涤，去除未结合抗体。
洗涤时可以采用离心沉淀法或流式细胞术仪器自带的洗涤功能。
洗涤后，用合适的细胞固定液对细胞进行固定。
常见的细胞固定液有甲醛、乙醛、琼脂糖等，可以依据实验设计选择适当的固定液。
4.流式细胞仪检测固定后的细胞样品可以在流式细胞仪上进行数据采集和分析。
在操作流式细胞仪之前，需要对仪器进行标定，确保仪器的精度和准确性。
将固定细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，设置适当的流速和相关参数。
流式细胞仪会激发标记物的荧光信号，并检测细胞产生的荧光信号。
根据标记物的不同荧光波长，可以设置相应的滤光片和探测器。
二、注意事项1.细胞保存和操作温度细胞样品的保存温度和操作温度对实验结果具有影响。
一般细胞样品需要在4℃冷藏保存，防止细胞的失活和变性。
在实验过程中，保持适宜的操作温度（一般为室温）是重要的，避免细胞过热或过冷。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、 细胞亚群分类和功能分析等。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎发育监测等 。
血液学研究
用于检测白血病、淋巴瘤等血液 肿瘤细胞的表面抗原和基因表达 。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的生长、凋亡 和转移等生物学特性。
流式细胞术实验技巧 及数据分析
日期：
• 流式细胞术简介 • 流式细胞术实验技巧 • 流式细胞术数据分析 • 流式细胞术实验问题与解决 • 流式细胞术实验案例分享
目录
Part
01
流式细胞术简介
流式细胞术定义
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分离单个细胞的生物技术。通过将细胞悬 浮在液流中，并使用激光束照射细胞，可以测量细胞的物理和化学特性，如细胞 大小、颗粒质量和荧光标记等。
物的群体结构、进化关系和生态分布等方面。
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准确性，避免丢失或重复 采集数据。
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03
流式细胞术数据分析
流式细胞术数据分析
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04
流式细胞术实验问题与解决
荧光补偿设置问题
总结词
荧光补偿设置是流式细胞术实验中的 重要环节，用于消除不同荧光染料间 的光谱重叠。
细胞群体识别问题
总结词
细胞群体识别是流式细胞术实验的重要环节，直接影响实验 结果的分析和解读。
详细描述
在流式细胞术实验中，需要准确识别和区分不同的细胞群体 。通过优化抗体标记组合、采用多参数分析等方法，可以提 高细胞群体识别的准确性和可靠性，为后续的数据分析和解 读提供有力支持。
流式细胞术实验步骤
流式细胞术实验步骤流式细胞术（flow cytometry）是一项非常常用的细胞生物学研究技术，在许多领域都有着广泛的应用。
本文将为您介绍流式细胞术实验步骤，帮助您更好地掌握这一技术。
1. 细胞样品制备首先需要一个合适的细胞样品进行实验。
样品的选取要考虑细胞类型、细胞密度、细胞状态等因素，以保证实验结果的准确性和可靠性。
对于非粘附生长的细胞，先用PBS洗涤一次，离心沉淀，将上清液倒掉，然后用PBS冲洗沉淀细胞一次，离心沉淀，去掉上清液，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的PBS中消化脱落细胞。
之后用PBS洗涤脱落细胞，离心沉淀，去掉上清液，最后加入凝胶化培养基冻存备用。
2. 细胞计数在流式细胞术中，细胞计数非常重要。
可以使用hemocytometer或自动计数器进行计数。
计数完毕后，将细胞密度调整到准确的浓度，以免在后续实验中出现杂质和误差。
3. 细胞标记细胞标记可使用fluorescently-labeled antibodies或其他的探针，标记细胞表面分子或胞内分子。
标记的目的是识别和区分样品中的不同细胞类别。
处理方法：向细胞样品中加入适量标记抗体或荧光素等探针，使其与样品中的目标分子发生特异性结合。
4. 细胞过筛将经过标记的样品通过过滤网口，筛去大于0.22um的细胞碎片等杂质，以获得单个细胞进行后续实验。
5. 流式细胞术分析使用流式细胞仪进行分析，将样品喷入细胞术的流管中，在激光束之下，测量样品中标记细胞的荧光强度、散射度等参数。
通过比较样品与对照组，分析细胞类型、浓度和状态，建立起荧光相关表达式，以判定目标细胞类别。
6. 数据解析在流式细胞术分析的过程中采集了大量的数据，需要使用专业的软件进行数据解析、图形和表格生成。
数据解析的准确性和可靠性，对于实验结果和结论的推导有着至关重要的作用。
流式细胞术是一项详细的实验过程，需要严格遵守操作规范，才能获取可重复的实验结果。
本文简单介绍了流式细胞术实验步骤，希望能够提供实验操作指导，为广大科研工作者开展实验研究提供一定的帮助。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
流式细胞实验原理及应用
流式细胞实验原理及应用首先，样品准备是流式细胞实验的关键步骤之一、细胞需处于悬浮液中才能通过流式细胞仪。
样品准备包括细胞分离、洗涤和调整浓度等步骤。
通常，细胞样品从组织或培养物中分离，离心沉淀后经过洗涤去除细胞培养液中的残留物，最后将细胞悬浮于缓冲液中。
其次，细胞标记是流式细胞实验的核心步骤之一、在流式细胞实验中，细胞表面或内部的特定分子可以通过适当的标记物进行标记，以便在流式细胞仪中进行检测。
常用的细胞标记方法包括荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和利用特定的抗体与细胞表面受体结合等。
通过流式细胞实验，我们可以通过标记特定分子表达来研究细胞的功能、状态和变化。
最后，细胞检测是流式细胞实验的最后一步。
通过流式细胞仪，可以对标记的细胞进行检测和分析。
流式细胞仪通过激光束照射样品中的细胞，测量细胞发射的荧光信号和散射光等物理性质，从而获得与细胞特性有关的数据。
这些数据可以用于定量和定性分析，例如分析细胞表面标记物的表达水平、颗粒物的大小和形状等。
流式细胞实验在生命科学研究中有着广泛的应用。
它可以用于研究细胞的免疫表型，例如探究免疫细胞亚型的分布和功能状态。
同时，流式细胞实验还可用于分析细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖和细胞分化等生理过程。
此外，流式细胞实验还可应用于肿瘤学研究和临床诊断，如肿瘤细胞表面标记物的检测和癌症患者的免疫监测等。
总之，流式细胞实验是一种快速、准确的细胞检测和分析技术。
它通过针对特定分子的标记和仪器的测量，实现对单个细胞的定量和定性分析。
由于其高通量、高灵敏度和高特异性的特点，流式细胞实验被广泛应用于细胞学、免疫学、遗传学等领域，并为相关研究提供了有力的工具和方法。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，它可以用来检测和分析细胞表面标记物、细胞数量、细胞分布等信息。
以下是一份流式细胞术操作规程，详细介绍了该技术的操作步骤和注意事项。
一、实验前准备1. 准备所需的实验材料，包括流式细胞仪、标记抗体、孵育培养基、样本组织、显微镜片等。
2. 检查流式细胞仪的功能是否正常，确认仪器能够正常运行。
3. 清洁实验台面，确保操作环境干净整洁。
4. 准备所需的试剂和溶液，如PBS缓冲液、抗体染色溶液等。
二、样本处理1. 准备样本组织，将其转移到离心管中，并添加适量的孵育培养基使其完全浸泡。
2. 使用离心机将样本离心，去除上清液。
3. 重悬样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
4. 重复洗涤过程，直到样本完全洗净。
三、标记抗体染色1. 取出经过洗涤的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的标记抗体溶液。
2. 在黑暗条件下孵育样本，使其与标记抗体充分结合。
3. 静置反应15-30分钟，确保充分染色。
4. 在光线和温度适宜的条件下冰冻样本，避免抗体的结合。
5. 根据实验需求，可以选择单标记或多标记抗体。
四、样本准备1. 取出经过标记抗体染色的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
2. 将样本离心并去除上清液。
3. 重悬样本，并根据实验需要加入适量的PBS缓冲液进行稀释。
4. 检查样本的细胞数目和活性是否符合实验要求，如有必要，可以使用显微镜进行观察和计数。
五、流式分析1. 打开流式细胞仪，并确认仪器的设置和参数是否符合实验要求。
2. 调整仪器的流速和灵敏度，使其适应样本的特性。
3. 将样本转移至流式细胞仪的样本管中。
4. 开始流式细胞分析，记录并保存实验数据。
5. 根据实验需要，可以进行不同的数据分析和处理，包括细胞分布、细胞数量、表面标记物的表达等。
六、实验后处理1. 关闭仪器，清洁工作台和操作区域。
2. 处理和储存实验数据，可以使用相应的图像科学软件进行数据处理和结果分析。
流式细胞术基本原理与应用实验报告
流式细胞术基本原理与应用实验报告一、引言流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物学、医学和临床诊断领域的高通量技术。
它可以快速地分析细胞群体的形态、数量、大小、表面分子表达和内部结构等信息，从而为科学家们提供了许多有价值的数据和见解。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和应用实验，以期为读者提供更深入的了解。
二、流式细胞术基本原理1. 光学系统流式细胞仪主要由光源、透镜系统、光谱仪和检测器等组成。
光源可以是氩离子激光器或其他激光器，它们会发射出不同波长的激光束。
透镜系统会对激光束进行聚焦和扩散，使其能够穿过样品中的单个细胞。
光谱仪则会将激光束分成不同波长的色带，并通过探测器来检测样品中各个荧光染料或标记物的信号。
2. 样品处理在进行流式细胞术之前，需要对样品进行处理。
一般来说，样品需要进行单细胞悬浮处理，以便于在流式细胞仪中进行分析。
这个过程可以通过机械分离、酶消化或超声波破碎等方法实现。
3. 荧光标记为了使细胞的某些结构或分子能够被检测到，需要将它们标记上荧光染料或其他标记物。
这些标记物可以是抗体、蛋白质、DNA探针等。
当激光束照射到样品中时，荧光染料会发出特定波长的荧光信号，从而被检测器捕捉到。
4. 数据分析流式细胞术所得到的数据通常是一个多维度的数据集合，其中包括了每个单个细胞的大小、形态、荧光强度等信息。
为了对这些数据进行更深入的分析和解释，需要使用专业软件进行数据处理和可视化。
三、应用实验1. 细胞表面抗原检测流式细胞术可以用于检测细胞表面的抗原表达情况。
通过将适当的荧光标记物与抗体结合起来，可以快速地对细胞表面的抗原进行定量和定性分析。
这种方法在肿瘤学、免疫学和感染病学等领域中得到了广泛应用。
2. 细胞周期分析流式细胞术也可以用于细胞周期分析。
通过将DNA染料与样品中的单个细胞结合，可以对不同阶段的细胞进行分类和计数。
这种方法可以用于评估细胞增殖速率、治疗药物的效果等方面。
流式细胞术实验方法及应用
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴 细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴 性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。
4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
七、荧光补偿
流式细胞分析中常需要两种或两种以上不 同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由 于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性 质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误 差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补 偿。
100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤
离心 1000r/min，5min PBS 洗2次
单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液 100目钢筛网轻搓 生理盐水
收集滤液
300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min
PBS 洗2次 单细胞悬液。
研磨法
组织块洗去血液 研磨器研至匀浆 100目钢筛网
300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS洗2次
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
异硫氰酸（FITC）
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI）
藻红蛋白偶联物（PECY5）
藻红蛋白偶联物（PECY7）
别藻青蛋白（APC）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
激发光波长（nm ）
488 488 488 488
488
633 633
物的特异性。 6. 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂
和固定剂等影响。
常用荧光探针组合
细胞表型分析： 双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5 四色分析：三色分析+ECD
流式细胞术实验报告
流式细胞术实验报告流式细胞术实验报告引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。
它通过测量细胞在流动过程中的荧光信号，可以快速、准确地分析细胞的数量、大小、形态和功能等特征。
本实验旨在利用流式细胞术对细胞进行表型分析，并研究不同条件下细胞的变化。
材料与方法1. 细胞样本准备：从培养皿中取出细胞，用PBS洗涤，离心沉淀后，再用PBS 悬浮细胞，使其浓度达到所需的范围。
2. 细胞染色：将细胞悬浮液分装于离心管中，加入适量的荧光标记染料，轻轻摇匀，避免产生气泡。
3. 流式细胞术仪器设置：根据实验需要，调整流式细胞术仪器的参数，如激光功率、荧光信号检测通道等。
4. 样本检测：将细胞悬浮液注入流式细胞术仪器，开始检测。
记录细胞的散射信号和荧光信号，并设置相应的控制样本。
5. 数据分析：利用流式细胞术软件对获得的数据进行分析，包括细胞数量、比例、荧光强度等参数。
结果与讨论通过流式细胞术实验，我们成功地对细胞进行了表型分析，并观察到不同条件下细胞的变化。
以下是我们的结果和讨论。
1. 细胞数量和比例的变化我们首先对细胞数量和比例进行了分析。
结果显示，在不同处理条件下，细胞数量和比例存在显著差异。
例如，在处理A条件下，细胞数量明显增加，而在处理B条件下，细胞数量有所下降。
这表明不同条件对细胞生长和增殖有不同的影响。
2. 细胞大小和形态的变化我们进一步分析了细胞的大小和形态的变化。
通过测量细胞的散射信号，我们可以得到细胞的大小和形态信息。
结果显示，在处理A条件下，细胞的大小明显增加，形态变得更加圆润。
而在处理B条件下，细胞的大小和形态相对稳定。
这可能与处理A条件下的细胞分化和增殖有关。
3. 荧光信号的变化我们还对细胞中特定蛋白的表达进行了分析。
通过标记特定蛋白的荧光染料，我们可以测量细胞的荧光信号强度。
结果显示，在处理A条件下，特定蛋白的表达明显上调，而在处理B条件下，特定蛋白的表达下调。
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单细胞悬液
胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝
素液，置于4℃ 冰箱中静置 6-12h
尿 液：收集24h 尿液，置4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内置 6-12h
间
标
羊抗兔
五、荧光标记
主要包括间接免疫荧光染色和直接免
疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一
二、流式细胞术的特点、优点
速度快 极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个 细胞，甚至几万个细胞。
多参数分析 可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细 胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。
定性、定量分析细胞 通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、 抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。
流式细胞术的应用范围
细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
激发光波长（nm ）
异硫氰酸（FITC） 488 发射波长(nm) 525（绿）
2500r/min，20-30min
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性（30-40min），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板
胰蛋白酶
吸去培养液
37℃，室温，3-5min
PBS洗2次
含血清的培养基
吹打
PBS洗2次
单细胞悬液。
3. 组织器官单细胞悬液的制备
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大， 散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反 映细胞颗粒性程度大小。 单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该 道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数； 双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度.
七、荧光补偿
流式细胞分析中常需要两种或两种以上不 同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由 于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性 质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误 差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补 偿。
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI） 藻红蛋白偶联物（PECY5） 藻红蛋白偶联物（PECY7） 别藻青蛋白（APC）
488
488 488 488 633
575（橙）
610（红） 667（红） 767（红外） 660（红）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
633
767（红外）
2. 要有高的光子产量---提高信号强度。
生理盐水
1000r/min，5min
300目尼龙网过滤
研磨法
组织块洗去血液 单细胞悬液。 研磨器研至匀浆 离心 100目钢筛网 PBS洗2次 300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包 埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。
流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类 计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞 免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一 群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及 膜表面标志，主要分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋 巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个 亚群。
T淋巴细胞（CD3+） 淋巴细胞 B淋巴细胞（CD19+） NK细胞（CD16+56）+
3. 对激光有强的吸收----降低背景噪音。
4. 激发光谱和发射光谱之间差距大---减少
干扰。
5. 易与被标记的物质结合，而不影响被标记 物的特异性。 6. 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂 和固定剂等影响。
常用荧光探针组合
细胞表型分析：
双色分析：FITC与PE
三色分析：双色分析+PE-CY5
酶消化法
组织器官
机械法
单细胞制备仪 剪碎法 网搓法 研磨法
（1）、酶消化法
组织块洗去血液
37℃，15-30min
剪成小块
胰蛋白酶
100目 单
含血清的培养基 PBS 洗2次
钢筛网过滤
离心
300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
细胞悬液。
（2）、机械法
单细胞制备仪
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤
1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会， 将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划 分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群 (Cluster of Differentiation，CD)，进行编号、 命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体 群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个 分化抗体群被鉴定并命名
原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤 1.细胞表面抗原的标记法（外周血为例 ） 全血50ul（5×105）+10ul相应抗体→避光孵 育15-30min → 溶血素→ 室温10min → PBS洗1次 →上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
体时，将DNA含量直
方图分为三部分，
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
即G0/G1、S、G2/M
三个细胞峰。
G2/M G2/M
(4C) (4C)
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇
4º C ，24h
离心去固定液
30min
PBS洗2次
PI
避光,30min
RNase
上机
PBS洗1次
采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞
100目钢筛网过滤 1000r/min，5min PBS 洗2次
300目尼龙网 单细胞悬
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
置 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
剪成小块 PBS 洗2次
剪至浆状
制备仪
2-3min
300目尼龙网过滤
离心
剪碎法
1000r/min，5min
单细胞悬液。
吸管轻轻吹打
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液 收集滤液 PBS 洗2次 100目钢筛网轻搓 离心 单细胞悬液。
激光
前向散射
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
侧向散射，荧光信号
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
近30年来流式细胞术在我国得到很 快的发展，应用范围不断增大。目前， 流式细胞术作为一门生物检测技术广泛 应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞 遗传学、细胞生物学、生物化学等临床 医学和基础医学研究领域。
六、荧光染色对照设置(空白对照
同型对照 )
、阳性对照、阴性对照、
1、空白对照
用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验
2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时， 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴 细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴 性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
周期分析
G0/G1 (2C)
S (2C→4C) G2/M (4C)
当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时， 在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期 的改变（异倍体） 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断： S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5
2、 淋巴细胞亚群分析
白细胞分化抗原（CD分子）的命名：
四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记， 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
CD3+
CD3+CD8+ CD3+CD4+
NK+/CD3-
CD（16+56）+/CD3+ （T-cell）
NK细胞: CD(16+56)+/CD3-