苦碟子注射液用于肝纤维化大鼠疗效观察及其作用机制探讨

基础研究
[基金项目]贵州省科学技术厅项目(N 36)。

苦碟子注射液用于肝纤维化大鼠疗效观察及其作用机制探讨
钱　宁,郭科男,董小君,吴曙光,李术钗,张志勇
(贵阳中医学院,贵州贵阳550002)
[摘要]　对10只肝纤维化大鼠模型(苦蝶子组),采用苦碟子注射液腹腔注射(0.4m l/100g,1次/d),连用2周后检测大鼠血清谷丙转氨酶(A LT )、谷草转氨酶(AST )、白蛋白(A lb )含量,肝组织丙二醛(MDA )和超氧化物歧
化酶(SO D )水平,并观察其肝脏内α2平滑肌蛋白(
α2S MA )表达。

结果与模型组比较,观察组显著降低肝血清ALT 、AST 含量及肝组织中MDA 水平明显降低,使血清A l b 含量及肝组织中S OD 活性显著升高(P <0.01);肝脏内α2S MA 阳性细胞数明显减少(P <0.01),认为苦碟子注射液具有抗肝纤维化的作用,其机制可能为抗脂质过氧化及
降低HSC 活化。

[关键词]　苦碟子注射液;肝纤维化;肝星状细胞;脂质过氧化;α2平滑肌肌动蛋白
[中图分类号]　R 333.4 [文献标示码]　B [文章编号]　10022266X (2008)2020024202
肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理状态。

肝
星状细胞(HSC )激活并转化为肌成纤维细胞(MFC)是肝纤维化发生发展的中心环节,而HS C 的活化与脂质过氧化密切相关。

本研究以肝细胞脂质过氧化及HS C 活化为主要指标,观察了苦碟子注射液用于肝纤维化大鼠的疗效,并探讨其机制。

1　材料与方法
1.1　材料　S D 雄性大鼠(重庆市中药研究所动物室提供)36只,体质量220～250g 。

苦碟子注射液(沈阳双鼎制药有限公司);无水乙醇(分析纯),用时以蒸馏水稀释至20%备用。

ALT 、AST 、Alb 、考马斯亮兰蛋白、S OD 、MDA 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);α2S MA 小鼠抗大鼠抗体及S ABC 试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2　实验方法1.
2.1　模型建立[1]与用药　将36只大鼠随机抽取10只作为对照组,其余26只制作肝纤维化模型,以40%CC L 4橄榄油溶液0.15m l /100g 腹腔注射,2次/周。

实验第2周开始予20%酒精灌胃1m l /100g,隔天1次;第6周起每周末从造模动物中随机处死1只大鼠作肝纤维化病理学检查,按照陆伦根等[2]
肝纤维化分期标准判断肝纤维化程度,直到有2期以上肝纤维化形成,即确定肝纤维化模型复制成功,造模共8周。

造模结束时大鼠死亡3只,将剩
余20只大鼠随机分为:模型组10只和苦碟子组10只。

从第9周起开始,苦碟子组以苦碟子注射液0.4m l /100g 腹腔注射,1次/d;对照组和模型组用生理盐水腹腔注射,0.4m l /100g,1次/d,均连续2周。

1.2.2　组织标本采集及检测指标　用药2周后处死大鼠,股动脉取血制备血清检测肝功能指标A LT 、AST 、A lb 含量。

取肝左叶相同部位组织置于冰生理盐水中充分洗涤后取肝组织,采用化学比色法检测脂质过氧化指标肝组织中S OD 活性及MD A 含量;采用免疫组织化学染色观察肝组织α2S MA 表达,以胞质/胞核内出现棕黄色颗粒视为阳性细胞,每张切片选取四周及中央区域共5个视野进行染色结果判定,采用H I P AS 22000型计算机图像分析系统,通过显维摄影系统放大200倍,摄取图像输入图像分析系统进行灰度变换,使染色阳性区域与背景分开,自动记录着色面积和视野内肝组织总面积,阳性率=着色面积/总面积×100%,取平均值作为该切片的着色面积。

1.3　统计学方法　数据以x ±s 表示,采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。

各组数据间比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2　结果
2.1　各组一般情况　实验期间对照组饮食、活动及二便无明显变化,精神状态佳,皮毛正常光泽。

用药前模型组和苦碟子组均逐渐出现饮食及活动减少,
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时有稀便,腹部膨隆,精神不振,反应迟钝、皮毛凌乱缺乏光泽。

苦碟子组自用药起大便逐渐正常,进食量、摄水量增加,精神状态亦随之好转。

2.2　各组血清A L T、AST、A lb水平比较　见表1。

表1　各组血清A L T、AST、Alb水平……(x±s)
组别n ALT(I U/L)AST(I U/L)A lb(g/L)
模型组1065.43±21.31378.55±18.97332.58±7.893苦碟子组1036.19±12.143△48.87±19.01△38.25±7.213△对照组1020.03±7.1341.40±12.2542.03±3.69
注:与对照组比较,3P<0.01;与模型组比较,△P<0.01
2.3　各组肝组织中S OD、MD A水平变化及α2S MA 表达　见表2。

表2　各组肝组织中SOD、M DA水平及α2S M A表达(x±s)
组别n
S OD
(U/mg p ro)
MDA
(n mol/mg p ro)
α2S MA
(%)
模型组1050.31±21.563316.89±4.1233 2.71±0.6433苦碟子组1074.69±19.213△8.01±3.273△ 1.31±0.383△对照组1094.75±22.15 6.12±0.97 1.02±0.14
注:与对照组比较,3P<0.05,33P<0.01;与模型组比较,△P
<0.01
3　讨论
肝纤维化形成的诱因包括肝细胞损伤、细胞免疫反应、胶原刺激因子、乙醇和脂肪变性、瘀血和胆汁淤积等,其中肝细胞损伤刺激诱导纤维增殖的作用最强烈。

肝细胞损伤是肝纤维化的重要启动因素,受损伤的肝组织发生炎症反应,浸润嗜中性粒细胞能产生大量活性氧簇(ROS),ROS可在体外刺激HS C活化,促其增殖及合成大量的胶原[3]。

另外,受损伤的肝细胞膜通透性增加,释放出脂质过氧化物,通过旁分泌作用激活HSC,激活后的HS C经旁分泌和自分泌机制维持活化,从而导致胶原基因转录上调。

氧化应激(OS)发生在细胞内及细胞周围氧化相关性分子超过细胞抗氧化能力时,OS相关分子可作为调节肝纤维化进展的细胞和分子事件。

正常肝脏有酶和非酶抗氧化能力,多数肝脏抗氧化能力仅限于实质细胞、HSC、内皮细胞,这些细胞对ROS相关分子更易暴露且更敏感,肝脏的抗氧化能力在慢性肝病时常常下降;且不论慢性肝病的病因和肝纤维化进展速度,几乎所有的临床和实验性慢性肝病中均发现OS存在。

近来体外研究发现,培养的HSC可以被自由基激活而被抗氧化剂阻断。

MDA 在组织中的含量间接反映自由基反应时组织的破坏程度。

体内自由基清除机制以S OD作用最重要。

S OD活性愈高,自由基清除速度愈快[4]。

HS C分布于汇管区和窦周间隙,急性或慢性肝细胞损伤可导致从静止状态转化为MFC的活化状态,其以表达α2S MA为特征,作为H S C的一个激活标志。

本研究中大鼠肝纤维化形成的同时,肝组织中S O D明显下降、MDA明显上升,表明肝纤维化形成与O S有关,肝纤维化大鼠体内抗氧化能力下降,存在氧化应激损伤。

对照组肝组织α2S MA表达仅存在于血管周围内皮细胞,提示HS C处于静止状态,与报道一致[5];模型组肝组织α2S MA阳性细胞数明显增多,提示HSC被大量激活。

苦碟子为菊科植物抱茎苦荬菜的全草,味苦、辛、性寒,具有清热解毒、凉血活血、排脓止痛的功效。

苦碟子注射液以苦碟子为原料提取精制而成的注射液,临床上多用于缺血性心脑血管疾病、血管神经性头痛,并取得较好疗效。

本研究中苦碟子组肝纤维血清转氨酶、血清白蛋白恢复,S OD水平基本恢复,MDA增高得以纠正,肝脏内α2S MA阳性表达亦随之减少,证实苦碟子注射液具有抗肝纤维化的作用,其机制可能为抗脂质过氧化及降低HS C增殖活化。

[参考文献]
[1]施新献.现代医学实验动物学[M].北京:人民军医出版社,
2000:3352358.
[2]陆伦根,曾民德,万漠彬,等.肝纤维化病理学分级分期及与非创
伤性诊断检测关系的初步研究[J],肝脏,2000,5(4):1942197. [3]Ts ukamot o H,R ippe R,N ie m el a O.R oles of oxi dative stres s in ac2
ti vati on of Kupffer and It o cells in liver fi b r ogenesis[J].J Gastro2 enterol Hep at ol,1995,10(1):50253.
[4]宋娟,张洪,黄徐英.枳具子对肝纤维化大鼠脂质过氧化的动态
影响[J].山东医药,2006,46(14):24226.
[5]崔霞,王磊,付春生,等.TGF2β1、α2S MA在慢性乙肝患者肝组织
中的表达及意义[J].山东医药,2003,43(4):18220.
(收稿日期:2008202216)
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