实验八 DNA的限制性内切酶酶切和鉴定

5´GAATTC EcoRⅠ CTTAAG 5´
HindⅢ
5´AAGCTT TTCGAA5´
质粒pUC18的物理图谱
三、材料
重组质粒； EcoRI 酶及其酶切缓冲液 : 购 买成品； HindⅢ酶及其酶切缓冲液 : 购 买成品;琼脂糖(Agarose) 。 四、仪器 移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液 枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。
实验八来自百度文库
DNA的限制性内切酶 酶切和鉴定
一、实验目的
1. 掌握限制性内切酶的特性。 2. 了解限制性内切酶的用途。
二 、 DNA 限 制 性 内 切 酶 概 述 和 分 析
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶 识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上 ,并切 割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白 质分子中兼有切割和修饰 ( 甲基化 ) 作用且依赖于 ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位 点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割 DNA分 子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成 : 一种为限 制性内切核酸酶 (限制酶 ),它切割某一特异的核苷酸序 列; 另一种为独立的甲基化酶 , 它修饰同一识别序列。 Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用， 它们是重组DNA的基础。 绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4至 8个核苷酸的 回文对称特异核苷酸序列。
五、试剂
1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液
六、操作步骤 1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml) 编号, 用微量移液枪分别加入质粒 DNA （5---14 μl ）和 相应的限制性内切酶反应 10×缓冲液 2μl, 再加入重蒸水 使 总 体 积 为 18μl, 将 管 内 溶 液 混 匀 后 加 入 EcoRI 和 HindⅢ 各 1μl, 用手指轻弹管壁使溶液混匀 , 也可用微量 离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验 成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应 尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、 混匀反应体系后 ,将eppendorf管置于适当的支 持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1-3小时, 使酶切反应完全。 3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停 止反应,置于冰箱中保存备用。
七、电泳检测 在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，EB染色，紫外 透射 仪下观察或拍照。
思考题： 1. 写出EcoRI和 HindⅢ两种内切酶消化产物的末 端序列。 2. 什么是粘性末端和平末端？ 3. 限制性内切酶在基因工程中有什么作用？