实验八 DNA的限制性内切酶酶切和鉴定
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一．原理质粒是双链环状DNA，有多个限制性内切核酸酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。
二．材料（1）重组质粒；（2）所需的限制性内切核酸酶和其反应缓冲液；（3）琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备。
三．方案1．单酶切反应（1）按下表加入试剂。
反应所需试剂体积（单位：ul）质粒10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7（2）将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（3）琼脂糖凝胶电泳观察结果。
2.双酶切反应若两个酶反应条件相同时，参照上述方法进行，反应条件不同时，需分别进行酶解反应。
（1）第一步酶解反应：质粒DNA 1-2 ug（1ug/ul） 2 ul缓冲液 2 ul内切酶 1 ul双蒸水15 ul总体积20 ul离心混匀，37℃,1h。
（2）乙醇沉淀法沉淀线性化的DNA，再重建下一步的反应体系。
（3）第二步酶解反应：沉淀的DNA17中加双蒸水17ul。
双蒸水（含上一步沉淀的DNA）17 ul缓冲液 2 ul内切酶 1 ul总体积20 ul离心混匀，37℃，1h。
电泳鉴定。
四．注意事项（1）限制性内切核酸酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于冰箱外；酶最后加入到反应体系中。
（2）限制性内切核酸酶溶液通常含有50%的甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分摇匀（可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。
切忌振荡混匀！）。
（3）注意酶的用量，酶量并不是越多越好。
一般可参照说明书来确定。
酶量过大（酶：DNA ≥25U／μg）时，有产生所谓星号活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割；为避免星号活性，甘油浓度应< 5 %。
此外，反应体系中甘油的质量分数大于12%，以及缺少NaCl和存在Mn2+等情况下，都有可能出现星号活性。
（4）互补性的黏末端在用DNA连接酶连接后，不能再用限制酶切割。
酶切验证的原理
酶切验证的原理酶切验证是一种常用的分子生物学技术，主要用于确认DNA序列是否正确。
其原理基于酶切作用和凝胶电泳技术，通过对DNA进行限制性内切酶切割并在凝胶中进行电泳分离，最终可以得到所需的DNA片段。
以下将详细介绍酶切验证的原理。
一、限制性内切酶的作用原理限制性内切酶是一类特殊的酶，它能够识别并切割特定的DNA序列，从而产生具有特定长度的DNA片段。
这些限制性内切酶通常由细菌产生，并且被广泛应用于分子生物学领域。
限制性内切酶的作用基于其与DNA序列之间的互作。
具体来说，当一个限制性内切酶遇到其所识别的特定DNA序列时，它会在该序列上结合并发生水解反应，将该DNA序列剪断成两个互补的单链DNA片段。
这种水解反应通常发生在两个特定碱基之间，并且遵循着不同种类限制性内切酶所具有不同的识别和剪断规律。
二、凝胶电泳的作用原理凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA片段的技术，其基本原理是将DNA片段在电场作用下沿着凝胶中的孔隙移动，从而实现对DNA片段的分离和检测。
凝胶电泳通常使用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质。
这种凝胶具有一定的孔隙大小和形状，可以让不同大小的DNA片段通过，并且能够阻止大分子物质通过。
在进行凝胶电泳实验时，将待检测的DNA样品加入到含有缓冲液和染料的孔隙中，在加上电场后，DNA片段会沿着电场方向移动，并逐渐被分离出来。
最终，通过染色或其他方法可以显示出不同长度的DNA片段，并进行定量或比较分析。
三、酶切验证实验步骤1. DNA提取：从细菌、植物或动物组织中提取所需的DNA样品。
2. 限制性内切酶切割：选择合适的限制性内切酶并按照其所需条件进行反应，在反应结束后通过电泳检测是否得到所需的DNA片段。
3. 凝胶电泳：将切割后的DNA样品加入到凝胶中，并在加上适当的电场后进行分离和检测。
4. 染色和可视化：使用染料或其他方法将分离出来的DNA片段染色，并通过紫外线照射或其他方法进行可视化。
5. 分析和确认：根据实验结果进行分析和确认，确定所需的DNA序列是否正确。
实验八 重组克隆筛选(酶切鉴定)
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
DNA限制性内切酶酶切反应
一、核酸限制性内切酶
• II型酶就是通常基因工程中使用的DNA限制性内 切酶。II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶 组成。II型限制酶需要Mg2+作为催化反应辅助因 子，能识别双链DNA的特定序列，一般为4-6个碱 基的反转重复序列。II型限制酶一般在识别序列内 进行切割，产生特异的DNA片断。
切割下来，装入1.5ml微量离心管中。 ⑦ 置-20℃保存。
• 本周实验报告： 1. 实验原理 2. 实验步骤 3. 实验结果 4. 实验结果分析 • 下周请预习：离心吸附柱法从琼脂糖凝胶
中回收DNA
0.5μl
④ Xho I (10Units/μl)
0.5μl
2. 混匀试剂。将离心管置37℃水浴，反应1小 时。
三、实验步骤
3. 琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段
① 制备1%琼脂糖凝胶。 ② 在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓
冲液，混匀。 ③ 将样品平均加入2个加样孔内，每个孔加样
27.5μl。 ④ 135V衡压电泳30-40分钟。 ⑤ 在紫外灯下观察酶切条带。 ⑥ 将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中
二、限制性内切酶酶切反应
2. 酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应 温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星 活性。
– 星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在某 些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的现 象。其结果是酶切条带增多。
– 星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘 油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切 时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星 活性。
DNA的限制性内切酶酶切
DNA的限制性内切酶酶切实验目的1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理与实验方法。
2.了解限制性内切酶的特点。
实验原理限制性内切酶是基因工程中剪切DNA分子常用的工具酶，它能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。
根据限制性内切酶的组成、所需因子及裂解DNA的方式不同可分为三类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
重组DNA技术中所说的限制性内切酶通常指Ⅱ型酶。
绝大多数Ⅱ型酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。
实验器材移液器、移液器吸头、1.5ml离心管、离心管架、水浴锅、离心机、制冰机、漂浮板等。
实验试剂（1）DNA样品：质粒pUC19和基因3055。
（2）限制性内切酶、BamH I和EcoR I。
（3）通用型DNA纯化回收试剂盒（试剂盒组成见本篇“实验四DNA片段的纯化与回收”）。
实验操作（1）取2支离心管，在冰上按以下顺序分别配制酶切反应体系（50μl）：质粒pUC19/基因3055 43μl限制性内切酶5μlBamH I 1μlEcoR I 1μl（2）加完反应体系后，用手指弹管壁混匀，短暂离心，使反应液甩入离心管底部。
（3）将离心管插入漂浮板上，放置于水浴锅中，37℃水浴15min，然后80℃加热20min终止反应。
（4）使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物。
注意事项（1）注意要在冰上操作。
（2）加入限制性内切酶时，移液器吸头应贴着离心管壁沿着液面加入。
实验意义限制性内切酶是重组DNA技术中常用的工具酶，在体外构建重组载体时，用于特异性切割载体及目的基因。
思考题如何根据载体和目的基因选取合适的限制性内切酶？。
分子生物学实验思考题答案
分子生物学实验思考题答案实验一、基因组DNA的提取1、为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA?答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。
而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。
所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的DNA片段.2、如何检测和保证DNA的质量？答、用凝胶电泳看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断，当OD260/OD280< 1.8，表示蛋白质含量较高当OD260/OD280> 2.0，表示RNA含量较高当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯。
实验二、植物总RNA的提取1、RNA酶的变性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？答、有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。
答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？答、A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。
C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；E）所使用的器皿必须干净。
DNA 的限制性内切酶酶切分析
在处显绿色荧光条带 ，观察酶切后与未酶
切质粒的DNA带位置。
100bp DNA 未酶切
Marker
质粒
已酶切 质粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁， 用掌型离心机离心到底部!
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水 汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切 失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘 油) ，每次吸取后应放在冰盒，用完后立即放在 -20℃，新购的大包装酶应先分装
4.倒胶时不能有气泡，若有需立刻用枪尖吸掉 或牙签挑破
5.点样孔置负极一端，点样时也应检查点样孔 中有无气泡，电泳前正确连接正负极
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入 电泳槽 (先胶布封口，放好梳子)。
4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer +5ul酶切产物
或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示剂) 移动至胶前沿2cm处停止电泳(约30min)。 （不超过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？ 如果会，请说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳 图谱，综合前两个实验，分析可能的原 因
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒作业指导书
限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒作业指导书实验目的掌握单、双酶切的技术，理解酶切法进行重组质粒进行鉴定的原理。
实验原理(一)酶切各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序，例如，Eco R Ⅰ酶的识别顺序为：GAATTC；Scal I酶的识别顺序为：AGTACT，用Eco R I和Scal I同时酶解含有这两个单一酶切位点的环状双链DNA分子，就产生两条带有相应酶切位点的线性DNA分子。
当Eco R I和Scal I同时酶切一个质粒DNA时，酶切反应必须完全。
不同酶切反应都需要Mg2+并要求一定的盐离子浓度，但不同的酶达到最佳酶切效率所需的盐浓度不同。
因此生产厂商在销售酶的同时往往附带专门的缓冲液。
如果盐离子浓度使用不当，会使酶的识别位点发生改变，例如当盐离子浓度低于50mmol／L时，Eco R I内切酶的专一性就降低，只能识别中间的4个核苷酸序列(称该酶为Eco R I*)。
绝大多数酶的反应温度是在370C，酶切反应时间需30min、60min以至2h以上。
一般来说，如酶的纯度不佳，酶切时间不能太长。
终止酶切反应时，大多数可在65℃水浴中，保温10min，就可使大部分酶失活。
Eco R I酶置65℃水浴中，保温10min，丧失95％的酶活性。
内切酶一般都保存在50％甘油的缓冲液中。
当保存在10％甘油中时，酶活力丧失更快。
少数较耐热的酶，在加热前先加pH7.5的EDTA，至终浓度为10mmol／L。
EDTA螯合了反应系统中所有的二价阳离子，就更便于终止酶切反应。
酶切要完全，酶解的数量也要适当。
设计酶解DNA的数量时，除了根据连接与转化的要求外，还要按照DNA浓度的高低，酶液单位的高低等具体情况而定。
同时还要考虑到DNA每经一步处理，就得重新纯化，这样DNA浓度的损失量几乎达到50％。
并且每经一步操作后，都要取一定量的DNA样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品。
因此，在设计酶解数量时，不能用量太少，但是酶解数量过多，势必要消耗大量限制性内切酶和DNA，这也是不必要的。
实验九、DNA的限制性内切酶酶切
实验九、DNA的限制性内切酶酶切一、实验目的1、了解核酸限制性内切酶的特点及其对DNA的酶切过程。
2、学会设计构建体外重组DNA分子的方法，并根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶以及DNA的酶切技术。
二、实验原理EcoR I限制性内切酶的识别与切割顺序为：5’……G↓AATTC……3’3’……CTTAA↑G……5’Xho I限制性内切酶的识别与切割顺序为：5’……C↓TCGAG……3’3’……TAGCT↑C……5’三、实验材料1、仪器：水浴锅、制冰机、离心机、电泳设备、各式移液枪、核酸紫外检测仪等。
2、1.5ml离心管、移液枪枪头等。
3、DNA样品：上一个实验获得的质粒DNA4、限制性内切酶Xho I和EcoR I（Takara）四、实验步骤酶切体系：质粒DNA 5ulEcoRⅠ 1ulXhol Ⅰ 1ul2×Buffer H 2ulSw 11ulTotal 20ul1、用微量移液枪（20微升）依次吸取SW、10倍酶切缓冲液、DNA、EcoR I、Xhol I。
2、盖紧上述两个1.5ml离心管的盖子，在振荡器上充分混匀2秒钟，立即于离心机内离心一下，以将管壁上的液体集中于管底。
3、将离心管放置37℃水浴锅中反应3小时。
在酶切反应的同时，制备1.0%的琼脂糖凝胶，并准备好电泳装置。
五、实验结果很明显17组由于样品里的目的片段DNA量太少，所以没有检测到。
观察其他组的结果可知，酶切后产生2条条带，由于质粒DNA是一种环状闭合双链DNA，这与质粒DNA被两不同的限制性核酸内切酶酶切后的DNA数符合。
酶切鉴定实验报告
酶切鉴定实验报告酶切鉴定实验报告引言：酶切鉴定是一种常用的分子生物学技术，通过酶切作用将DNA分子切割成特定的片段，从而确定DNA的序列和结构。
本实验旨在通过酶切鉴定技术，对DNA进行切割并进行分析，以进一步了解DNA的特性和应用。
材料与方法：实验所需材料包括DNA样品、限制性内切酶、缓冲液、电泳仪等。
首先，将DNA样品与限制性内切酶和缓冲液混合，反应一段时间后，将反应产物进行电泳分离。
接着，通过电泳仪观察DNA片段的迁移距离，并与已知的DNA标准进行对比，从而确定DNA的大小和序列。
结果与讨论：实验结果显示，经过酶切作用后，DNA样品被切割成多个片段。
通过电泳分离，我们观察到这些片段在凝胶上形成了明显的条带。
根据条带的迁移距离，我们可以初步确定DNA片段的大小。
进一步分析发现，不同的限制性内切酶对DNA的切割方式各不相同。
有些酶会将DNA切割成等长的片段，而有些酶则会产生不等长的片段。
这是由于限制性内切酶对DNA的特定序列具有识别和切割的能力。
通过比较不同酶切产生的片段大小，我们可以推断出DNA的序列和结构。
此外，我们还发现不同的DNA样品在酶切鉴定实验中表现出不同的特点。
有些DNA样品在特定的酶切条件下会产生多个片段，而有些则只会产生少数片段。
这可能是由于DNA样品中存在不同的限制性内切酶切割位点或序列变异导致的。
通过进一步的研究，我们可以深入了解这些DNA样品的特性和变异情况。
酶切鉴定技术在生物学研究和医学诊断中具有广泛的应用。
例如，在基因工程领域，科学家们可以利用酶切鉴定技术对重组DNA进行构建和验证。
通过切割和连接不同的DNA片段，他们可以构建出具有特定功能的重组DNA，并用于生物制药和基因治疗等领域。
此外，酶切鉴定技术还可以用于检测和鉴定病原微生物的DNA，从而帮助医生进行疾病的诊断和治疗。
结论：本实验通过酶切鉴定技术对DNA进行了切割和分析，初步确定了DNA的大小和序列。
通过观察不同酶切产生的DNA片段，并与已知的DNA标准进行对比，我们可以进一步了解DNA的特性和应用。
DNA的限制性酶切实验原理
（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 （如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
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Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；
NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl)
中盐（50mM NaCl）
高盐（100mM NaCl）
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
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五、注意事项——限制性内切酶酶切
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其 杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的 强度，应有选择地使用。
• 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽 中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避 免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出 现气泡，以免影响电泳结果。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能
实验八_DNA的限制性内切酶酶切和鉴定
5´GAATTC EcoRⅠ CTTAAG 5´
AAGCTT HindⅢ 5´ TTCGAA5 5´
质粒pUC18的物理图谱 的物理图谱 质粒
三、材料
重组质粒； EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购 买成品； HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购 买成品;琼脂糖(Agarose) 。 四、仪器 移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液 枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。
五、试剂
1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液
六、操作步骤 1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml) 编号,用微量移液枪分别加入质粒DNA （5---14 µl）和 相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2µl,再加入重蒸水 使 总 体 积 为 18µl, 将 管 内 溶 液 混 匀 后 加 入 EcoRI 和 HindⅢ 各1µl,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量 d 离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验 成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应 尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支 持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1-3小时, 使酶切反应完全。 3、 每管加入2µl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停 止反应,置于冰箱中保存备用。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
三、操作步骤1．限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中进行。
2. 酶切反应体系（10ul）：酶解缓冲液（10×buffer） 1 ul限制性内切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U) 底物DNA（质粒） x ul（依质粒浓度而定）灭菌ddH2O 加至10 ul限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后6000 r/min，离心15s。
DNA的限制性内切酶酶切分析
DNA的限制性内切酶酶切分析DNA限制性内切酶酶切分析（restriction enzyme digestion analysis）是一种常用的实验方法，用于分析DNA片段的长度及其在不同DNA样本中的存在与否。
本文将介绍DNA限制性内切酶的定义和分类、酶切分析的原理、实验步骤和结果的分析等内容。
DNA限制性内切酶（restriction enzyme）是一种能够识别特定的DNA序列并酶切它们的酶类。
它的发现和应用让分子生物学和遗传学研究取得了重要的突破。
限制性内切酶按照它们识别的DNA序列和酶切的方式可以分为以下几类：1. 四切酶（Type I）：这类酶不仅有切割DNA的酶活性，还有甲基转移酶活性。
它们通常是多亚基复合物，需同时与子基的甲基转移酶活性合作。
2. 六切酶（Type II）：这类酶是最常用的限制性内切酶，它们能够识别特定的DNA序列，并在识别序列中特定的位置切割DNA链。
这类酶可以以精确的方式酶切DNA，生成具有粘性末端或平滑末端的DNA片段。
3. 四切酶（Type III）：这类酶也是多亚基复合物，通常需要其中一种辅助因子才能发挥酶切活性。
4. 五切酶（Type IV）：这类酶的酶切方式和高度特异性尚不清楚。
在酶切分析实验中，我们通常选用能够产生可检测到的DNA片段的限制性内切酶进行反应。
实验步骤如下：1.提取DNA样本：从要分析的细胞或组织中提取总DNA。
2. 选择限制性内切酶：根据需求选择一种适合的限制性内切酶。
常用的限制性内切酶有EcoRI、HindIII、BamHI等。
3.DNA酶切反应体系的设置：配置适当的酶切反应缓冲液，加入所选的限制性内切酶和总DNA，进行适当的搅拌反应。
4.酶切反应的条件调整：根据所选酶切酶的最佳工作条件进行反应温度、反应时间等参数的调整。
5.停止酶切反应：加入适当的制动剂（如酶切反应停止缓冲液）终止酶切反应。
6.扩增和可视化：对酶切后的DNA样品进行聚合酶链反应（PCR）扩增或直接进行凝胶电泳检测，以确定DNA片段的长度和存在与否。
质粒DNA的限制性内切酶酶切分析讲解
质粒 DNA 的限制性内切酶酶切分析实验目的学习和掌握限制性内切酶的特性掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法重组技术的关键工具。
并理解限制性内切酶是 DNA 重组技术的关键工具。
2. 相关基础知识限制性核酸内切酶：是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶。
它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。
上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。
首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的 EcoR I 和 EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的 Hind II 和 Hind III。
这些酶可在特定位点切开 DNA，产生可体外连接的基因片段。
研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。
1) 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割 DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 DNA 存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的 DNA 不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA 进行了修饰，限制性酶对修饰过的 DNA 不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三类：Ⅰ型Ⅱ型* Ⅲ型第一类（I 型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割 DNA 链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。
这类酶如 EcoB、EcoK 等。
第三类（III 型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。
但这几个核苷酸对也不是特异性的。
因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末端。
实验八 限制性内切酶酶切DNA及分析
5.结果观察与分析 5.结果观察与分析 关闭电源，取出凝胶，在凝胶成像仪中观察DNA 关闭电源，取出凝胶，在凝胶成像仪中观察DNA 的迁移位置，并讨论实验结果。判断CS与哪一个DNA CS与哪一个 的迁移位置，并讨论实验结果。判断CS与哪一个DNA 样品是同一个样品，找出罪犯。 样品是同一个样品，找出罪犯。
4.酶切产物的琼脂糖电泳 4.酶切产物的琼脂糖电泳 （１）琼脂糖凝胶制备（１％）：称0.2g琼脂糖粉，加入20ml 琼脂糖凝胶制备（ ％）：称0.2g琼脂糖粉，加入20ml 琼脂糖粉 0.5XTBE电极缓冲液 水浴加热融化，冷却至50 60℃时 电极缓冲液， 500.5XTBE电极缓冲液，水浴加热融化，冷却至50-60℃时，加入 适量EB 混匀倒入铸胶盘中，冷却后凝胶即形成。 EB， 适量EB，混匀倒入铸胶盘中，冷却后凝胶即形成。(注：现在 所用胶模每块胶只需20ml即可) 20ml即可 所用胶模每块胶只需20ml即可)。 取已制备好的酶切DNA样品， DNA样品 （２）取已制备好的酶切DNA样品，用移液器将样品小心地加 入点样孔。 入点样孔。 盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用120 120伏 （３）盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用120伏）， 电泳40分钟。 40分钟 电泳40分钟。
操作步骤： 操作步骤： 1.DNA样品的制备 含样品序列的质粒DNA提取（CS,S1-S4)； 样品的制备： DNA提取 1.DNA样品的制备：含样品序列的质粒DNA提取（CS,S1-S4)； 2.质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测； 2.质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测； DNA样品的酶切反应 3. DNA样品的酶切反应 设置DNA样品的双酶切反应，按下列顺序加样（体积：μl）： DNA样品的双酶切反应 设置DNA样品的双酶切反应，按下列顺序加样（体积：μl）： 反应管 样品DNA 样品DNA 10 反应缓冲液（10X） 反应缓冲液（10X） 2 双蒸水 6 EcoRⅠ 1 PstⅠ 1 总体积 20 加完反应液，温和混匀，置于37℃水浴中反应1. 小时， 37℃水浴中反应1.５ 加完反应液，温和混匀，置于37℃水浴中反应1.５小时， 取出后瞬时离心， 4ul上样缓冲液 混匀， 上样缓冲液， 取出后瞬时离心，加4ul上样缓冲液，混匀，所有样品加入上 样孔。 样孔。
DNA限制性内切酶酶切分析
DNA限制性内切酶酶切分析一、原理限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。
限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。
与核酸外切酶相比，该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断，产生带有粘性或平头末端的DNA片段。
把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割，即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。
如果同时用两种不同的酶切割，则可产生带不同粘性末端的片段，通过电泳分离出所需要的目的基因片段。
把目的基因与切开的载体DN A混合，再经过DNA连接酶处理，转化和筛选即可得到希望的重组子。
进行DNA酶切时，根据具体情况可用单酶切或双酶切。
特定的酶有其配套的缓冲液。
进行双酶切时，应选用两种酶都适合的缓冲液；如果两种酶要求的温度不同时，先在较低温度下酶切，然后在较高的温度下酶切。
二、目的了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构，掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。
三、材料、试剂与器具1、DNA样品。
2、限制性内切酶。
3、10×限制性内切酶反应缓冲液。
4、无菌双蒸水。
5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。
6、10×TBE buffer。
7、琼脂糖。
8、溴化乙锭溶液。
9、上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚兰）。
10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。
11、10mg/ml Rnase。
四、操作步骤1、将在－20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出，放在冰浴上融化待用。
2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分：DNA样品 0.1-2mg10×内切酶反应缓冲液 1ml内切酶1 1ml内切酶2 1ml加无菌水至 10ml3、离心1秒钟，使管壁上的溶液集中到管底。
用手指轻弹管底部位使之混合，再离心一次，使管壁上的溶液集中到一起。
4、在37℃温育60－120分钟。
DNA的限制性酶切及电泳分析
DNA的限制性酶切及电泳分析DNA的限制性酶切及电泳分析实验目的：1．掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。
2．掌握重组质粒DNA的酶切鉴定方法。
3．掌握琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。
基本原理限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。
根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。
主要试剂:重组质粒DNA 插入片段300bp本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：5′----G↓AATT C----3′3′----C TTAA↑G----5′磷酸二脂键断裂产生5′粘性末端。
操作步骤1. 反应体系的建立：⑴在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：无菌双蒸水7 μl10×酶切缓冲液2 μl质粒DNA(100 ng/μl) 10 μlEcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl总体积为20μl⑵轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。
2. 37 ℃水浴1 h。
3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。
4. 12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。
5. 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。
6 结果观察。
操作注意事项：1. 吸样量一定要准确2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶3. 要求在冰上操作，并充分混匀，4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。
5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。
限制性内切酶酶解中常见的问题和原因1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。
质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定
质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定［实验目的］训练学生正确使用加样器；了解限制性内切酶及酶切条；学会分析质粒DNA 的酶切图谱；系统掌握琼脂凝胶电泳的基本技术。
［实验原理］限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。
细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。
它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。
由于细胞每存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化而被切割破坏。
所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA甲基化酶一齐构成了保护自己、抵抗外源入侵的DNA防御机制。
目前已发现的限制性内切酶有数百种。
EcoRⅠ和Hind Ⅲ都属于Ⅱ型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA 片断。
EcoRⅠ和Hind Ⅲ的识别序列的切口是：EcoRⅠ: G↓AATTCHind Ⅲ: A↓AGCTTG,A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段，因此鉴定酶切后的片断在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片断的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
［实验器材］1.仪器和材料电泳仪、电泳槽，样品槽横板（梳子），有机玻璃内槽，橡皮膏，锥形瓶（100mL 或50mL），玻璃纸，一次性塑料手套。
pUC19（市售和自提），EcoRⅠ酶，λDNA- Hind Ⅲ酶切的分子量标准、琼脂糖。
2.试剂（1）TAE缓冲液（1×TAE）：称取Tris 4.9g、EDTA-Na2－2H2O0.74g，用900ml蒸馏水分别溶解后，添加冰醋酸1.14ml，最终用蒸馏水定容至1L。
DNA 的限制性内切酶酶切分析讲解
1. DNA中的中的DNase,蛋白,RNA, SDS ,EDTA,酚, 中的 ,蛋白, , , 氯仿和乙醇等
杂质都会影响酶切效果. 氯仿和乙醇等杂质都会影响酶切效果. 2. DNA中的杂中的杂DNA,蛋白可与非专一性结合使酶活中的杂 ,蛋白可与RE非专一性结合使
酶活性降低,另外杂DNA 也竞争酶的切口,往往造成切不也竞争酶的切口, 性降低,另外杂动. 3. DNA中的盐离子(如Mn2+,Cu2+,Co2+和Zn2+等) 中的盐离子( 中的盐离子与有机溶剂(如酚,氯仿和乙醇等) 与有机溶剂(如酚,氯仿和乙醇等)都可抑制限制酶的活性或使限制酶失活或造成DNA切不动或使限制酶的活性或使限制酶失活或造成切不动或使限制酶切割一些非特异序列(*活性活性) 切割一些非特异序列(*活性).
分子克隆
个体克隆多莉羊的克隆。
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5´GAATTC EcoRⅠ CTTAT TTCGAA5´
质粒pUC18的物理图谱
三、材料
重组质粒； EcoRI 酶及其酶切缓冲液 : 购 买成品； HindⅢ酶及其酶切缓冲液 : 购 买成品;琼脂糖(Agarose) 。 四、仪器 移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液 枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。
五、试剂
1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液
六、操作步骤 1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml) 编号, 用微量移液枪分别加入质粒 DNA （5---14 μl ）和 相应的限制性内切酶反应 10×缓冲液 2μl, 再加入重蒸水 使 总 体 积 为 18μl, 将 管 内 溶 液 混 匀 后 加 入 EcoRI 和 HindⅢ 各 1μl, 用手指轻弹管壁使溶液混匀 , 也可用微量 离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验 成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应 尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、 混匀反应体系后 ,将eppendorf管置于适当的支 持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1-3小时, 使酶切反应完全。 3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停 止反应,置于冰箱中保存备用。
实验八
DNA的限制性内切酶 酶切和鉴定
一、实验目的
1. 掌握限制性内切酶的特性。 2. 了解限制性内切酶的用途。
二 、 DNA 限 制 性 内 切 酶 概 述 和 分 析
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶 识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上 ,并切 割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白 质分子中兼有切割和修饰 ( 甲基化 ) 作用且依赖于 ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位 点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割 DNA分 子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成 : 一种为限 制性内切核酸酶 (限制酶 ),它切割某一特异的核苷酸序 列; 另一种为独立的甲基化酶 , 它修饰同一识别序列。 Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用， 它们是重组DNA的基础。 绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4至 8个核苷酸的 回文对称特异核苷酸序列。
七、电泳检测 在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，EB染色，紫外 透射 仪下观察或拍照。
思考题： 1. 写出EcoRI和 HindⅢ两种内切酶消化产物的末 端序列。 2. 什么是粘性末端和平末端？ 3. 限制性内切酶在基因工程中有什么作用？