补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响

见表1。

3　讨论

子宫肌瘤育龄期妇女患病率高达20%～25%。我科根据子宫肌瘤“肝郁”、“脾虚”、“血瘀”的病机特点,以疏肝健脾、益气养血、化瘀散结组方制成子胞康胶囊,分别于月经前和月经后服用,不仅能够显著缩小或消除子宫肌瘤瘤体,且能明显降低患者血清雌、孕激素水平[3]。子宫肌瘤的发生主要与长期、大量的雌、孕激素刺激有关[4],本文结果显示:雌激素能使大鼠子宫肌层增厚,肌纤维肥大,结构紊乱;而子胞康胶囊鼠子宫肌层细长,排列规则,肌层厚度亦显著低于模型组,表明其可拮抗雌激素的作用,使子宫肌层的改变全部或部分恢复正常。同时,子胞康胶囊还能明显降低大鼠血清E2、P浓度,以上结果提示,调节雌、孕激素水平为子胞康胶囊治疗子宫肌瘤的作用机理之一。另外,从组织学观察中可见,模型组部分大鼠子宫积水、淤血,子宫内膜及卵巢有较明显的化脓性感染,并有大小不一的脓肿形成。而子胞康胶囊大剂量组完全无此现象,小剂量组偶尔可见脓肿形成,提示子胞康胶囊可能同时具有抗炎、抗菌及改善微循环作用,具体情况有待我们进一步研究。

参考文献

1　香卫红.消瘤丸对雌性激素负荷大鼠子宫肌层影响的实验研究.中医杂志,1998;39(6)∶346

2　盛一方.40例子宫肌瘤外周血和卵巢血的五项激素变化.上海医科大学学报,1995;22(1)∶69～71

3　王永林,苏旭春.雌激素高峰期以中医药治疗子宫肌瘤40例临床观察.湖南中医药导报,2000;6(3)∶23～24

4　孙梅.子宫肌瘤的病因学研究进展.国外医学妇产科分册,1997;24 (3)∶160～163

补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响Ξ

李冬华,朱飞鹏1

(首都医科大学中医药学院,北京　100013;1国家食品药品监督管理局药品审评中心,北京　100038)

摘　要　目的:观察补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响。方法:体外培养成骨细胞,观察补肾中药含药血清对成骨细胞增殖率和AL P活性的影响。结果:补肾中药含药血清对成骨细胞增殖能力和AL P活性有增强作用。结论:补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞的增殖和功能有促进作用。

关键词　成骨细胞;增殖和功能;补肾中药

由肾主骨理论指导下的补肾法在骨代谢疾病的治疗中占有重要地位。现代医学的发展使得我们得以从细胞、分子水平揭示肾在骨代谢中的重要地位。本文通过体外培养成骨细胞,观察补肾中药活性成分对成骨细胞增殖和功能的影响,为补肾中药治疗骨代谢疾病提供实验依据。

1　材料和方法

1.1　试验药物　补肾中药由菟丝子、何首乌等提取的活性部位组成,由复旦大学药学院提供。

1.2　试剂和仪器　M EM培养基干粉(美国GIBCO 公司产);新生小牛血清(NCS,美国GIBCO公司产);胶原酶Ⅱ(CollagenaseⅡ,Sigma公司产);胰蛋白酶(华美生物公司)。二氧化碳培养箱(德国产),倒置相差显微镜(日本Olympus公司产);光学显微镜(日本Nikon 公司产);酶标仪(美国Bio2Tek公司产)。

1.3　方法1.3.1　大鼠成骨细胞分离培养　出生24h内小鼠10只雌雄兼用,自来水冲洗后放入75%酒精内5min,无菌剪开头部皮肤,手术刀切下颅盖骨,清除骨表面的结缔组织,PBS反复冲洗至骨组织发白,用剪刀将骨组织剪碎至1mm×1mm大小的骨片,0.25%胰蛋白酶5ml 37℃预消化20min,弃消化液,0.1%Ⅱ型胶原酶5ml 37℃消化60min,移取消化液,离心1000rpm×10min,弃上清,加入适量培养液;将骨片再次用0.1%Ⅱ型胶原酶5ml37℃消化60min,移取消化液,离心1000rpm ×10min,弃上清,加入培养液适量;混匀二次消化的细胞,接种于25cm2培养瓶(3×105/瓶),在5%CO2、95%空气、37℃条件下培养24h后换液一次,以后每3天换液一次,细胞汇合后,0.25%胰蛋白酶消化,3×105/瓶分瓶接种于25cm2培养瓶(第一代细胞),继续培养,汇合后用于测定成骨细胞的增殖及功能等。

1.3.2　补肾中药含药血清制备　3月龄雄性SD大鼠30只分为3组:中药组、空白组和CMC对照组。中药

23中药药理与临床2005;21(2)Ξ北京市优秀人才培养专项经费资助

组按照体型系数公式计算给药量的5倍,给予补肾中药活性成分1.5g/kg・d(21.4g生药/kg・d)用1%CMC 混悬给药,2次/d,间隔6h,连续2天,第3天给药2h 后再次给药。对照组给予同容积的1%CMC。空白对照组不处理。末次给药1h后采血,离心3000rmp×20min,吸取上清,56℃30min灭活,微孔滤膜过滤除菌,分装后220℃保存备用。

1.2.3　增殖率测定(M TT法)　成骨细胞2×103 cell/200μl×孔接种于96孔细胞培养板,培养24h后换含补肾中药活性成分1.0g×1026浓度培养液,对照组加等量PBS,培养72h,弃上清液,每孔加无血清M EM培养液100μl、M TT10μl,37℃孵育4h,加入20%的SDS(十二烷基硫酸钠)150μl,37℃温育2h,酶标仪570nm波长检测吸光度值。另取接种于96孔细胞培养板培养24h后的成骨细胞,中药组用含药血清,对照组用空白血清,CMC组用给予1%CMC的血清代替NCS制备M EM培养液,继续培养72h,M TT法测定成骨细胞增殖率。

1.3.4　碱性磷酸酶(AL P)活性测定(PNPP法)　成骨细胞2×103cell/200μl×孔接种于96孔细胞培养板,培养24h后,换含补肾中药活性成分1.0g×1026浓度培养液,对照组加等量PBS,培养72h,弃上清液, PBS冲洗,每孔加50mM的DEA(二乙醇胺)100μl, PNPP(对硝基苯磷酸盐)50μl,37℃孵育30min,加入0.2M的NaOH50μl,酶标仪405nm波长检测吸光度值(OD),样品OD值在AL P标准曲线上读取活性值(单位:u/L,PNP浓度梯度5、10、20、40μmol/L相当于AL P20、40、80、160u/L),判断细胞AL P活性。另取接种于96孔细胞培养板培养24h后的成骨细胞,中药组用含药血清,对照组用空白血清,CMC组用给予1%CMC大鼠的血清代替NCS制备M EM培养液继续培养72h,PNPP法测定成骨细胞AL P活性。

2　结果

2.1　体外培养成骨细胞鉴定

2.1.1　活体观察　倒置相差显微镜下,刚接种的成骨细胞呈球形,悬浮于培养液中并逐渐沉降贴壁生长, 24h后存活细胞完全贴壁展开。展开后的成骨细胞呈三角形、多角形或不规则形,有较多长短不等的突起,细胞核呈椭圆形,含1～3个核仁,胞质丰富、清晰。生长期细胞分裂相多见,细胞多突起互相联结。培养10天左右细胞汇合,呈铺石状,并有重叠生长。

2.1.2　碱性磷酸酶(AL P)染色　成骨细胞AL P染色后活性部位呈紫色细颗粒状,分布于胞浆,细胞核染色阴性。

2.1.3　矿化结节形成　成骨细胞体外培养2周以上,经含抗坏血酸、β2甘油磷酸钠矿化诱导液培养,形成不透光的矿化结节,茜素红染色呈桔红色。

2.2　补肾中药对成骨细胞的作用

2.2.1　成骨细胞增殖能力　中药组成骨细胞增殖率较CMC组、对照组显著提高(P<0.01),CMC组与对照组增殖率无明显差别。结果见表1。

表1　成骨细胞增殖能力测定结果( x±s)

组别N M TT(OD570nm)对照组120.296±0.023

CMC组120.287±0.032

中药组120.464±0.033△△33

与对照组比较△△P<0.01;与CMC组比较33P<0.01(下同) 2.2.2　成骨细胞AL P活性　中药组成骨细胞AL P 活性较CMC组、对照组显著提高(P<0.01),CMC组与对照组比较无明显差别,结果见表2。

表2　成骨细胞AL P活性测定结果( x±s)

组别N AL P(u/L)对照组120.206±0.014

CMC组120.191±0.013

中药组120.228±0.020△△33

3　讨论

中医学认为,肾主骨生髓,一旦肾气衰微,肾精不足,则会发生骨骼疾患,正如《素问・痿论》中所说“骨枯髓减,发为骨痿”。肾中精气宜充不宜亏,治疗骨质疏松症等骨代谢疾病应以补肾益精为主,代表方剂如肾气丸、左归丸、右归丸等,药物有仙灵脾、熟地、骨碎补、杜仲、枸杞、补骨脂、牛膝等[1]。

体外培养成骨细胞属于贴壁生长的纤维母细胞型细胞,鉴定主要根据形态观察、成骨细胞的特异性分泌蛋白、因子、受体等,及体外矿化功能特征等进行检测[2],本实验24h后培养的细胞呈典型成骨细胞特点。实验结果提示,应用以菟丝子、何首乌等为主的补肾中药经植化方法提取的活性部位直接作用于体外培养的成骨细胞,对成骨细胞增殖和功能显示明显促进作用,表现在:(1)成骨细胞增殖率提高;(2)成骨细胞AL P 活性增加。上述结果表明,补肾中药可以提高成骨细胞的增殖率、增加AL P活性,因而促进成骨细胞骨形成功能。

参考文献

1　朱飞鹏,王洪复.中医药防治骨质疏松症研究进展.中国自然医学杂志,2002;4(2)∶94～96

2　王洪复,关本博,林光义.由胎鼠头盖骨培养成骨细胞的实验技术和细胞形态观察.上海医科大学学报,1991;18(6)∶475～477

33

中药药理与临床2005;21(2)