Northern实验方法
Northern杂交技术
Northern?blot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。
含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。
尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。
1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛μlDMSO μlL磷酸μlRNA（多达10μl）μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。
由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。
每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。
L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将1mol/L磷酸二氢钠、1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用D EPC处理上述溶液后高压灭菌。
每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加poly(A)+RNA。
2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。
3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用％琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。
用0mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。
northern印迹杂交
简介
简介
Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在上样前用甲基氢氧化银、乙 二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤 维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱， 否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶 上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方 法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相 机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。
northern印迹杂交
将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法
01 简介
目录
02
RNA甲醛凝胶电泳和 吸印方法
基本信息
Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA 印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为 Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。
琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用 甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。
原理：
整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，则转化植株细胞内有其转录产物——特异mRNA的生成。将 提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上；将他们原 位转移到固定膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；然后通过探针的标记性质检测出杂交体。
northern印迹杂交操作步骤
northern印迹杂交操作步骤
Northern 印迹杂交是一种用于检测 RNA 的技术，以下是一般的 Northern 印迹杂交操作步骤：
1. RNA 提取：从样品中提取 RNA，可以使用适当的 RNA 提取方法，如苯酚-氯仿提取或商业化的 RNA 提取试剂盒。
2. RNA 质量评估：通过琼脂糖凝胶电泳或分光光度计等方法，评估 RNA 的完整性和浓度。
3. RNA 变性：将 RNA 样品在加热的缓冲液中进行变性，使其变成单链形式。
4. 凝胶电泳：将变性的 RNA 样品加载到琼脂糖凝胶上进行电泳，根据 RNA 的大小分离不同的 RNA 分子。
5. 转膜：将电泳后的 RNA 转移到固相支持物上，通常使用硝酸纤维素膜或尼龙膜。
6. 杂交：将带有 RNA 的膜与放射性或荧光标记的探针进行杂交，探针是与目标 RNA 互补的核酸序列。
7. 洗膜：在杂交后，进行洗膜步骤，以去除未结合的探针，降低背景信号。
8. 信号检测：使用放射性自显影或荧光检测方法，检测杂交信号，并进行图像分析。
9. 数据分析：根据杂交信号的强度和分布，分析 RNA 的表达水平和特异性。
需要注意的是，Northern 印迹杂交是一项技术要求较高的实验方法，操作过程中需要严格控制实验条件和避免 RNA 的降解。
此外，探针的设计和选择也对实验结果有重要影响。
在进行 Northern 印迹杂交实验之前，建议详细阅读相关的实验方案和参考文献，并根据具体的实验需求进行适当的优化和改进。
如果你对具体的实验操作有更详细的问题，建议参考相关的实验手册或向专业的实验室技术人员咨询。
希望这些信息对你有所帮助！如果你还有其他问题，欢迎随时提问。
southern 印迹法 northern印迹法名词解释
southern 印迹法 northern印迹法名词解释Southern印迹法和Northern印迹法都是用于检测DNA或RNA的方法。
1. Southern印迹法是一种将DNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上
的方法，常用于特定DNA序列的定位。
具体来说，该方法首先利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性核酸内切酶消化的DNA片段，然后将单链DNA片
段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，再进行杂交，最后用放射自显影或酶反应显色检测特定DNA分子是否存在及其含量。
2. Northern印迹法是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上
的方法，常用于检测特定RNA序列。
具体来说，该方法首先将RNA样品
通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后将其转移到尼龙膜等固相膜载体上。
再利用放射性或非放射性标记的探针对固相膜上的mRNA进行杂交，通过
放射性自显影或显色反应对杂交信号进行分析，主要用于检测不同组织、器官和检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。
以上内容仅供参考，如需获取更多信息，建议查阅生物学书籍或咨询相关学者。
northern印迹杂交操作步骤
northern印迹杂交操作步骤标题：Northern印迹杂交技术的操作步骤详解Northern印迹杂交是一种研究基因表达的分子生物学技术，主要用于检测细胞中特定mRNA的存在和数量。
其基本原理是利用核酸之间的碱基配对原则，将放射性或非放射性的DNA探针与固定在硝酸纤维素膜上的RNA进行杂交，然后通过显影、放射自显影或者化学发光等方式显示结果。
以下是Northern印迹杂交的基本操作步骤：1. RNA的提取：首先从待测样本中提取总RNA。
常用的RNA提取方法有酚氯仿法、Trizol法等。
提取后的RNA需要进行定量和质量检查，以确保后续实验的准确性。
2. RNA的电泳分离：将提取到的总RNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。
根据RNA的大小不同，会在凝胶上形成不同的条带。
通常情况下，28S rRNA的迁移速度比18S rRNA慢，因此可以根据这两个条带的位置和强度来判断RNA的质量。
3. RNA的转移：将电泳分离后的RNA通过毛细管作用转移到硝酸纤维素膜上。
这个过程称为“转膜”。
转膜时需要注意的是，硝酸纤维素膜的正反两面不能混淆，因为转膜后要进行的杂交反应只在膜的一面上进行。
4. RNA的固定：转膜后的RNA需要被固定在硝酸纤维素膜上，防止其在后面的杂交过程中脱落。
常用的固定方法是在高盐溶液中进行热处理。
5. 杂交：将标记好的DNA探针与固定的RNA进行杂交。
杂交过程一般在恒温水浴中进行，温度应设定在Tm值以下5℃左右。
杂交的时间视探针的长度和浓度而定，一般为过夜。
6. 洗脱：杂交后的硝酸纤维素膜需要进行洗涤，目的是洗去未与RNA杂交的游离探针。
常用的洗涤液是SSC缓冲液，洗涤次数视具体情况而定。
7. 显影：将洗涤后的硝酸纤维素膜用X光片覆盖，并放置在暗盒中曝光一段时间，然后进行显影。
如果使用的是放射性标记的探针，则需要进行放射自显影；如果是非放射性标记的探针，则可以采用化学发光的方式进行显影。
总的来说，Northern印迹杂交是一种相对传统的分子生物学技术，虽然操作步骤较为繁琐，但因其能够直接反映mRNA的存在和量的变化，因此在基因表达的研究中仍具有重要的地位。
northern印迹原理和步骤
northern印迹原理和步骤Northern印迹是一种常用的分子生物学技术，用于研究RNA的存在和表达量。
其原理基于互补配对的特性和电泳的分离效应，可以准确检测目标RNA的存在和表达情况。
步骤如下：1. 根据研究需要选择适当的细胞、组织或生物样品，并在合适的条件下提取总RNA，保证RNA质量和纯度。
2. 将RNA经过甲醛缩合处理，使RNA中的核苷酸形成共价交联，避免其受到外界的酶降解和脱失。
3. 制备探针：制备DNA探针，用于与目标RNA靶点区域互补杂交。
探针一般使用同样长度的cDNA序列，但这需要穿过RNA反转录产生。
再用放射性、化学荧光或染料等方法加标记，在杂交反应中可快速和准确检测目标RNA的存在和表达量。
4. Northern杂交：在杂交反应的过程中，将RNA和DNA探针混合，在一定的温度和盐度下引发杂交反应。
随后将样品脱去无关核酸后，进行电泳分离。
将RNA在琼脂糖凝胶上分离、定量、转移、烘干后，使用辐射计数器与基带仪等检测仪器读取辐射信号及光信号，即可得到RNA的存在性和定量水平。
5. 数据分析：根据北方杂交后探针与RNA核酸的比例，再结合标准曲线，可以定量测定RNA表达量，用以比较样本之间的差异或验证RNA在各种生物过程中的变化情况。
总之，Northern印迹作为分子生物学的基础技术手段，被广泛应用于RNA研究领域。
通过一定的实验操作，能够检测目标RNA是否存在、表达水平的高低及变化规律，以便进一步推断其在生长发育、生理代谢和疾病发生发展等方面的作用和机制。
同时，随着生物技术的发展，也对Northern印迹技术进行了不断地改进和完善，进一步拓宽了其应用范围和提高了实验效率和精准度。
Northern杂交实验步骤
Northern杂交实验步骤第17章 Northern杂交技术Northern杂交技术（Northern blot）是一种用于检测分析RNA 的核酸杂交技术，因为其基本原理和操作过程与Southern blot十分类似，所以称为Northern blot。
常用于检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
17.1主要内容1. Northern Blot方法的原理和操作步骤。
2. RNA琼脂糖凝胶电泳。
3. RNA转移至硝酸纤维膜及膜处理。
17.2目的要求掌握Northern blot方法的原理和操作步骤；掌握RNA电泳，RNA转膜及膜处理方法。
17.3实验原理在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交、显色检测，以确定待检RNA样品中是否含有目的基因的转录产物（mRNA）及其含量。
17.4材料、试剂及器材17.4.1材料、试剂1.总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(至少25ng)，DIG Easy Hyb杂交液(Roche公司)，10×nucleotide mix (10mmol/L each dA TP, dGTP, dCTP , DIG-11-dUTP)，琼脂糖，DEPC，Random Primer，KlenowⅠ酶，SDS，双氧水，DEPC处理水；EDTA (0.2mol/L pH 8.0)，RNA-free water (含40 U RNase inhibitor)。
2.试剂配制：1) 5×MOPS: 0.1mol/L MOPS，0.04mol/L NaAc，0.005mol/L EDTA。
使用时用DEPC水稀释5×倍使用。
在400ml的DEPC水中溶解10.46g MOPS，用HAc或NaOH 调节pH至7.0，然后加入1.64g NaAc 及5ml 0.5mol/L EDTA，用DEPC水定容至500ml，用0.22μm的滤膜过滤除菌，避光保存。
northern印迹法原理和流程
northern印迹法原理和流程英文回答：The Northern Blot technique is a widely used method for detecting the presence of a specific RNA molecule in a sample. The principle behind this technique is to separate RNA molecules based on their size using gel electrophoresis and then transfer them onto a membrane for hybridization with a labeled probe. The labeled probe will bind to the specific RNA molecule of interest, allowing for its detection and quantification.The Northern Blot technique involves several key steps. First, RNA is extracted from the sample of interest, typically using a method such as phenol-chloroform extraction. The extracted RNA is then separated by size using gel electrophoresis, which involves applying an electric field to the gel matrix to separate the RNA molecules based on their size. The separated RNA molecules are then transferred from the gel onto a membrane,typically a nylon membrane, through a process called capillary or vacuum transfer.After the transfer, the membrane is cross-linked to immobilize the RNA, making it available for hybridization with a labeled probe. The labeled probe is a single-stranded DNA or RNA molecule that is complementary to the target RNA of interest. This probe is typically labeled with a radioactive or fluorescent tag for detection. The membrane is then incubated with the labeled probe, allowing it to hybridize specifically to the target RNA molecule.Following hybridization, the membrane is washed to remove any unbound probe, and then it is exposed to X-ray film or scanned using a fluorescent scanner to visualize the labeled RNA molecule. The intensity of the signal on the film or scanner corresponds to the abundance of the target RNA molecule in the original sample.Overall, the Northern Blot technique provides a valuable tool for studying gene expression and RNA abundance in biological samples.中文回答：北方印迹法是一种用于检测样本中特定RNA分子存在的常用方法。
northern印迹杂交原理
northern印迹杂交原理北方印迹杂交（Northern blot）是一种用于检测和分离特定RNA序列的实验技术。
它是南方印迹技术的衍生物，南方印迹技术是用于检测和分离DNA序列的一种实验技术。
北方印迹技术常用于研究基因的表达调控机制和RNA水平的变化。
北方印迹杂交的原理基本上与南方杂交的原理相似，但有一些具体差异。
北方印迹的主要步骤包括RNA提取、转印到膜上、固定RNA到膜上、杂交和检测。
首先，从细胞或组织中提取总RNA。
通常使用酚-氯仿法或商业RNA 提取试剂盒进行提取。
在提取过程中，应严格遵循消毒和无RNase污染的条件。
接下来，将提取的RNA样品加载到琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
通过电泳可以将RNA按分子大小进行分离，从而得到RNA带。
在电泳结束后，在凝胶上用碱性溶液溶解凝胶，将RNA转移到尼龙或硝酸纤维膜上。
然后，固定RNA到膜上。
这通常是通过使RNA与膜上的阳离子进行静电相互作用来实现的。
可以使用UV交联来增强RNA与膜的结合。
在固定RNA后，开始进行杂交。
杂交是将与目标RNA序列具有互补序列的DNA或RNA探针与膜上的RNA进行配对。
探针可以是标记有荧光物质或放射性同位素的分子探针。
探针的选择应根据研究的具体目的来确定。
杂交的条件包括温度、时间和杂交液的组成。
温度通常选择在50-65摄氏度之间，时间通常在几小时到一夜之间。
杂交液中通常包含盐、DENHART's溶液、聚丙烯醇等。
最后，进行检测。
检测的方法可以是放射自显影、化学发光或荧光检测。
如果使用放射性标记的探针，可以使用放射自显影技术来检测。
如果使用化学发光或荧光标记的探针，可以使用相应的检测仪器进行检测。
北方印迹杂交技术可以用于许多研究领域，例如研究基因表达的调控机制、RNA的稳定性和降解等。
它的优点包括对RNA分子的特异性检测和分离，以及对研究RNA变化的敏感性和定量性。
它的局限性在于需要较长的处理时间和较大的RNA样品量，以及需要较高的实验技术要求。
Northern杂交检测样本收集注意事项
Northern杂交检测样本收集注意事项
1. 新鲜组织：
用解剖刀等迅速切成小碎块，约30-100 mg，放入2.0 mL离心管中，开盖液氮速冻15 min，-80℃保存，干冰运输。
每个northern blot泳道提供2-3管样品。
注：解剖刀处理组织的时间尽量控制在1 min以内。
液氮速冻时必须开盖，以防炸裂。
2. 细胞样品：
悬浮细胞1000-1500 rpm，5 min，常温离心收集细胞。
贴壁细胞用胰蛋白酶消化后，吹打收集，PBS洗涤细胞，去除多余培养基和胰蛋白酶。
开盖液氮速冻15 min，-80℃保存，干冰运输。
一般情况下，细胞培养的6孔板，每孔细胞数量约为0.5~2×106个。
每个离心管中的细胞数量控制在5×106个左右！每个northern blot泳道提供2-3管样品。
3. RNA样品：
RNA溶液（DEPC-treated water溶解）：-80℃保存，干冰运输。
RNA沉淀：保存在75%乙醇（无核酶）中的RNA沉淀，2~8℃保存一周，-20℃保存一年；加冰块低温运输。
质量检测:
取1-2 μL的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，5s，18s，28s清晰可见，28s的亮度应为18s的1.5~2倍；无基因组污染。
纯度、浓度检测:
OD260/280=1.9~2.2；浓度≥300 ng/μL。
northern杂交的基本步骤
northern杂交的基本步骤
嘿，朋友们！今天咱来聊聊 northern 杂交那些事儿哈。
你知道不，northern 杂交就像是一场精心编排的舞蹈，每个步骤都得恰到好处呢！首先啊，得准备好咱的“舞台”，也就是提取高质量的RNA。
这可不能马虎，就好比建房子得有牢固的地基一样。
要是 RNA 质量不行，那后面的步骤可就都白搭啦！这提取 RNA 就像是挑选最甜的水果，得仔细着呢！
然后呢，就是电泳啦！把 RNA 放到凝胶上，让它们在电场里欢快地奔跑起来。
这凝胶就像是一条跑道，RNA 分子们在上面你追我赶，展示着自己的独特魅力。
这时候可得瞪大了眼睛，好好观察它们的表现哟！
跑完电泳，接下来就是转膜啦！就像是把跑道上的选手们转移到另一个更舒适的场地一样。
这个过程要小心再小心，可不能把咱的“宝贝”RNA 给弄丢了或者弄伤了呀。
之后呢，就是预杂交和杂交啦！这就像是给 RNA 们举办一场盛大的派对，让它们和特定的探针尽情地交流、结合。
这可需要合适的温度和条件，就像派对得有合适的氛围一样。
最后，就是检测啦！看看咱的 RNA 们和探针结合得怎么样，有没有成功地完成这场“约会”。
这检测就像是看一场精彩的演出，等待着最后的惊喜和成果。
哎呀呀，这 northern 杂交的步骤虽然听起来挺复杂，但只要咱一步一步认真去做，肯定能得到满意的结果呀！就像学骑自行车一样，刚开始可能会摇摇晃晃，但多练习几次，不就稳稳当当啦！咱搞科研也是这个理儿，别怕困难，勇往直前！大家加油哇，让我们在 northern 杂交的世界里尽情探索，发现更多的奥秘哟！。
Northern实验方法
Northern Blot实验方法[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment 和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
3．制胶：1）称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)2）在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3）将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。
注：胶的厚度不能超过0.5cm。
4）胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。
（配制250ml 1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。
Northern实验方法
Northern?Blot实验方法[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
3．制胶：1）称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)2）在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3）将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。
注：胶的厚度不能超过0.5cm。
4）胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。
（配制250ml1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。
Northern杂交试验指导手册
Northern杂交试验指导手册Northern杂交试验指导手册DIG标记的Northern杂交试验指导一、 RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液：贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。
贮存液室温保存备用（不超过3个月）。
工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。
工作液于室温下保存不超过1个月。
工作液各成分的终浓度为：4mol/L异硫氰酸胍25mol/L柠檬酸钠pH 7.00.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)其它溶液：2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)水饱和酚（pH 3.5）49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇100%异丙醇70%乙醇（用DEPC处理水配制）DEPC处理后高压灭菌水试验程序1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。
3．顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。
4．4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
5．4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
6．4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。
Northern杂交（Northernlotting）
Northern 杂交（Northern blotting）1979年，J.C.Alwine等提出：将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用使它们结合，因其方法同Southern杂交十分相似，故称之为Northern杂交。
1 原理Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。
2实验流程RNA混合物进行琼制糖凝胶电泳→分离得到的RNA转膜→与放射性标记的探针杂交→结果分析3 特点Northern杂交与Southern杂交相比，条件要严格些，特别是RNA容易降解，前期制备和转膜过程易受RNase污染，要获得较好结果，需用稳定性最差的mRNA与DNA进行杂交，对实验条件要求严格；然而有些应用中Northern杂交避免用复杂探针筛选cDNA 文库的繁琐4应用Northern杂交技术应用于特定性状基因在mRNA水平上的动态表达研究。
如应用于定位克隆中寻找新基因，寻找染色体特定区域的表达序列使大多数人类遗传疾病连锁分析和定位克隆的主要限速步骤，Northern杂交作为寻找这些序列的有效方法，有助于这些疾病候选基因的筛选；Northern杂交分析【操作】1．RNA的提取见前。
2．变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入 DEPC H2O 12.4ml，加热熔化，冷却至60℃时加入5×甲醛凝胶电泳缓冲溶液4.0 、37%甲醛3.6ml、混匀、制胶。
待胶凝固后，置于1×甲醛凝胶电泳缓冲溶液中预电泳5min。
3．样品制备取总RNA4.5 ，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲溶液4.0 、37%甲醛3.6 、甲酰胺10、于65℃温浴15分钟,水浴冷却。
加入上样缓冲液2 。
Northern Blotting反应方法步骤
Northern Blotting反应方法步骤Northern杂合反应的步骤主要包括：（1）加入核酸探针，使与固定于尼龙膜上的特定RNA 进行杂合反应；（2）待杂合反应结束后以含盐缓冲液与SDS 洗掉非专一性结合于尼龙膜上的核酸探针。
进行反应时应注意下列几个问题：a. 实验操作过程仍应尽可能避免RNase 的污染；b. 反应前应先进行杂合前置反应（prehybridization），以便减少核酸探针与尼龙膜的间的非专一性结合反应；c. 如果所使用的核酸探针是以random priming 或PCR 等方法所制备的双股DNA 探针，使用前务必先加热变性；d. 选用适当的严苛度（stringency）进行杂合反应及后续的转印膜漂洗工作，以便增强杂合反应讯息，并减少噪声，这主要可以从温度与盐浓度两个方面加以考量。
仪器用具：Crosslinker （Stratalinker 1800, Stratagene）；塑料盒；平端镊子；封口机；42℃恒温槽；60℃恒温槽药品试剂：6×SSC （0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate）尼龙膜；Hybridizati on solution [formamide, 50% （v/v）；5×SSC; blocking reagent, 2% （w/ v）；N-lauroylsarcosine, 0.1% （w/v）； SDS, 0.02% （w/v）]3MM 滤纸；2×SSC, 0.1% SDS;0.1×SSC, 0.1% SDS方法步骤：1） RNA 转印步骤结束后，移除电泳胶上的吸水纸与3M 滤纸。
2）把尼龙膜连同电泳胶一齐移置于干净卫生纸上，并请小心维持电泳胶与尼龙膜的相对位置。
3）以防水笔在尼龙膜上标出电泳胶样本孔的位置，并以剪刀剪掉尼龙膜左上角，以便标记电泳胶的左右方位。
4）小心地拉开尼龙膜，将的放置于6×SSC （20 mL）浸泡5 min.5）以平端镊子夹起尼龙膜，待6×SSC 滴干的后，把尼龙膜平放于卫生纸上，风干至少30 min.与电泳胶接触的那一面应朝上。
Northern杂交实验
b)在可见光下用黄色滤光片对染色的膜照像。
c)照像后，将膜放入0.2×SSC和1%（m/v）SDS中室温脱色15min。
注：用适宜的方法将RNA固定在膜上后，可直接进行杂交，也可用锡箔纸或滤纸宽松包装，真空下储存于室温。
总RNA的甲醛凝胶电泳、变性RNA的转膜及固定。
A：在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳
方法采用萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》第三版。
注：可加入溴化乙锭在甲醛凝胶中
试剂：溴化乙锭（用DEPC处理的水配制）
甲醛37%--40%
甲酰胺
试剂：
10×甲醛凝胶电泳加样缓冲液
50%甘油
10 m mol/L EDTA(Ph8.0)
转移膜的准备
5、用新的解剖刀或切纸刀裁一张长宽均大于胶1MM的尼龙膜。
6、将尼龙膜漂浮在去离子水表面直至滤膜从下往上全部湿透，然后将膜侵入10×SSC中至少5分钟，用干净的解剖刀切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。
转移系统的安装和RNA转移
7、将胶倒转后置于平台上滤纸的中央，确保厚滤纸和胶之间没有气泡滞留。
含1%SDS的0.2*SSC
20*SSC：
在800mL水中溶解175.3g NaCL和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaOH溶液调pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。
转移缓冲液：
碱性转移至带正电荷的膜：用0.01mol/L NaOH和3mol/L NaCL
中性转移至不带电荷的膜：用20*SSC
50×TAE：242克Tris碱，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA(Ph8.0)，定容至1000ml
Northern杂交试验指导手册(4)
Northern杂交试验指导手册(4)8.将样品测试条和对照测试条按下列顺序在上述准备的溶液中浸渍处理，两步骤直接让多余的溶液滴在吸水纸上。
①. 封闭，2min.→②. 抗体结合，3min.→①. 封闭，1min.→③. 洗膜, 1min. →④. 平衡，1min. →⑤. 显色反应（黑暗），5－30min.9.显色反应30min.即停止反应（延长显色反应时间，会增加背景而影响结果比较），用水漂洗测试条，将其置于3mm Whatman滤纸上空气干燥，然后在光下检测。
结果评估显色反应进行5～10min.时，对照测试条中300pg浓度的样点即会出现颜色，30min.时3pg的样点也可见颜色，随即停止颜色反应。
漂洗后比较对照与待测样品颜色，根据对照浓度与待测样品的稀释浓度计算标记物的数量。
如果标记物浓度低于10－30pg则不适宜采用这一快速检测方法。
方法二、用 DIG标记的RNA对照比较检测试剂：DIG标记的对照RNA（浓度约为100μg/ml）其它试剂同方法一试验程序1.将DIG标记的对照RNA先稀释成20ng/μl（5μl对照RNA加入20μl DEPC-H2O），取5支Eppendorf管以A、B、C、D、E、F顺序编号，将对照按下列比例稀释成一系列浓度：编号对照RNA稀释方法终浓度A 20ng/μl RNA 2μl＋RNA稀释缓冲液38μl 1ng/μlB A 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μlC B 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μlD C 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 1pg/μlE D 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.1pg/μlF E 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.01 pg/μl* 稀释后的A－E可以在-70℃下至少贮存一年。
2.按照同样的方法将待测的DIG－RNA也稀释成一系列浓度，编号用1、2、3、4、5、6以便于与对照区别。
3.取一片尼龙膜，按照前述方法一的方法点样，第一排点对照，第二排点待测样，不必从浓度A开始，只需点C－F浓度进行检测。
northern印迹法原理
northern印迹法原理Northern印迹法原理引言：Northern印迹法是一种在分子生物学研究中常用的技术，它可以用来检测DNA或RNA序列的特定区域。
本文将重点介绍Northern 印迹法的原理及其在科研中的应用。
一、Northern印迹法的原理Northern印迹法是根据亲和性的原理来实现的。
它利用DNA或RNA的亲和性与亲和剂结合，通过电泳将目标分子分离并转移到膜上，然后用探针与目标分子进行特异性的杂交，最后通过染色或放射性探针的探测来检测目标序列的存在。
1. 样本制备需要从细胞或组织中提取总RNA，并将其转录成cDNA。
这个步骤可以使用反转录酶来完成，反转录酶可将RNA转录成互补的DNA 链。
2. 准备RNA样品接下来，需要将RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，以获取目标RNA序列。
这一步骤是通过将RNA样品与琼脂糖溶液混合后，加热并加载到琼脂糖凝胶槽中进行电泳分离。
3. 转移RNA到膜上分离完成后，需要将RNA从琼脂糖凝胶上转移到膜上。
这一步骤可以通过将膜放置在琼脂糖凝胶上，并应用电流使RNA迁移到膜上。
4. 探针杂交在膜上进行杂交的目的是检测特定的RNA序列。
为了实现这一步骤，需要用探针标记的DNA序列或放射性同位素探针与RNA序列进行杂交反应。
探针的选择应该是与目标序列互补的序列。
5. 探测目标序列在探针杂交反应发生后，需要用染色剂或放射性探针来检测目标序列的存在。
这一步骤可以通过染色或使用放射性探针的放射性测量来完成。
二、Northern印迹法的应用Northern印迹法在分子生物学研究中有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 基因表达分析Northern印迹法可以用来研究特定基因的表达水平。
通过检测目标基因的mRNA在不同组织或条件下的表达情况，可以了解该基因在生物体内的功能和调控机制。
2. 疾病诊断与治疗Northern印迹法在疾病的诊断和治疗中也起到了重要的作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Northern Blot实验方法[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
3．制胶：1）称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)2）在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3）将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。
注：胶的厚度不能超过0.5cm。
4）胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。
（配制250ml 1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。
）5）检查点样孔。
4. RNA样品的制备在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。
混匀后，65℃空气浴15min。
短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。
5. 电泳：1）将RNA样品小心加到点样孔中。
2）在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。
在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。
当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。
3）紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。
注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。
6. 转膜1）用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。
2）用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。
3）连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。
4）盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。
5）将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。
6）将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。
7）打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。
每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。
8）转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。
9）用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。
10）将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。
(避免太长的紫外曝光时间) 12）将膜在-20℃保存。
7. 探针的制备1．在1.5ml离心管中配制以下反应液：模板DNA(25 ng) 1ulRandom Primer 2ul灭菌水11ul总体积：14ul2．95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。
3．在离心管中按下列顺序加入以下溶液：10×Buffer 2.5uldNTP Mixture 2.5ul111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ulExo-free Klenow Fragment 1 ul4．混匀后（25ul），37°C下反应30分钟。
短暂离心，收集溶液到管底。
5．65°C加热5min使酶失活。
8. 探针的纯化及比活性测定：1．准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。
用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。
换用新配制的TE（PH7.6）。
2．取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。
3．将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。
1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml 刻度处4．100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。
重复3次。
5．倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。
6．将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5ul点样于DE8 paper上，其余上样于层析柱上。
7．1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。
取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.8．测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml）。
9．预杂交：1．将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。
2．加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2 膜面积加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 hr。
10．探针变性：1．用10 mM EDTA将探针稀释10倍。
2．90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。
3．短暂离心，将溶液收集到管底。
11．杂交：1．加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。
2．42℃杂交过夜（14~24hr）。
杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。
12．洗膜：1．低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml 洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。
2．高严紧性洗膜：加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml 洗膜溶液)，42℃摇动洗膜20min两次。
13．曝光：1．将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。
2．检查膜上放射性强度，估计曝光时间3．将X光底片覆盖与膜上，曝光4．冲洗X光底片，扫描记录结果。
14．去除膜上的探针：将200ml 0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。
15．杂交结果操作应该小心，但不必紧张。
用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse 酶，以免样品的降解。
转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡Northern杂交1．在10~20 ml 预杂交液中68℃温育膜2h。
2．若使用双链探针，在100℃下加热32P标记的双链DNA 5 min，使之变性，然后迅速移至冰水中冷却。
3．把变性的或单链放射性标记的探针直接加到预杂交液中，在合适的温度下继续温育12~16h。
4．杂交后，将膜从塑料袋中取出，在室温下迅速转移到含有100~200ml 1×SSC，0.1%SDS的塑料盒内，将盒盖好，置于水平振荡器上，温和振荡10 min。
5．将膜转移至另一含有100~200ml预热至68℃、含0.1%SDS的0.5×SSC 的塑料盒中。
68℃下温和振荡10min。
6．重复步骤5，再洗涤至少2次，使68℃下共洗涤3次。
7．在印迹纸上晾干膜，然后让膜于-70℃下在含增感屏的暗盒内对X线片（Kodar XAR-5或相应的胶片）放射自显影24~48h。
此外，也可通过磷图像系统扫描得到膜上的图像。
经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。
含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。
尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA 条带更为锐利。
1）在灭菌的离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛5.4μlDMSO 16.0μl0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μlRNA（多达10μl）5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。
由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。
每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。
0.1mol/L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。
每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 细胞总RNA 进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA 含量极微，每个泳道应加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。
2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。
3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 ％琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。
用0mmol/L 磷酸钠（pH7.0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。
用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％H2O2，于室温放置10分钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。
因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。