上海交通大学微生物实验课件实验七污水中噬菌体的分离与效价测定
微生物实验课件
实验四 细菌的染色法和光学显微镜的使用 实验原理
油镜头的识别和重要参数
• 放大倍数
• 数值口径 • 工作距离
基础生物学实验教学中心
教师：姚璐晔
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实验四 细菌的染色法和光学显微镜的使用 实验原理
2. 革兰氏染色原理
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽 聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增 加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗 出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经 脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因 此细菌仍保留初染时的颜色。
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实验一
培养基的配置、分装与灭菌 实验方法
培养基的制备过程：
称 量 溶 解 定容，调pH 分装，包扎 灭菌 若有不溶物 则要求过滤
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实验一
培养基的配置、分装与灭菌 实验方法
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实验二
环境中微生物的监测与菌落识别 实验方法
斜面接种
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实验二
环境中微生物的监测与菌落识别 实验方法
液体接种
接种环
斜面
液体培养基
将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接 触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再 轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培 养基中时，一般用移液管或滴管接种。
噬菌体效价的测定
实验器材
• 菌种
大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体裂解液原液
• 培养基
LB培养基，素琼脂
• 试剂仪器
Eppendorf管，移液器，水浴锅 振荡器，煤气灯等
实验步骤
• 稀释噬菌体原液 取0.1ml噬菌体原 液于0.9mlLB液体 培养基，得到10-1噬 菌体稀释液。依此类 推，稀释到10-7。
• 噬菌体与菌液混合: 取0.5ml大肠杆菌液 至50℃保温素琼脂培 养基中， 另取0.5ml 噬菌体稀释液混合。 做10-5，10-6，10-7 梯度。 。
• 手搓快速混合。
• 将已接种的上层培养基倒入底层培养基上 • 静置凝固后37℃培养24小时 • 观察噬菌斑并计数
实验结果
• 记录平板中每稀释浓度的PFU数于下表中： • 计算噬菌体效价
噬菌体稀释度 PFU数 10-2 10-3 10-4 10-5 对照
思考题
• 什么因素决定噬菌斑的大小？ • 测定噬菌体的效价，操作时要注意什么才能测定 准确？ • 计算噬菌体效价时，选择30～300个PFU的平板 计数较好，为什么？ • 在测定平板上出现其它细菌的菌落是否影响你的 效价测定？
实验 7 噬菌体效价的测定
实验目的
• 学习噬菌体效价测定的基本方法
实验原理
• 噬菌体的效价就是1ml培养液中所含活噬菌体的数量。 • 效价的测定方法一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特 异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑， 因此能进行噬菌体的计数。 • 噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100％（一般偏低， 因为有少数菌体可能未引起感染），所以为了准确地表达 病毒悬液的浓度（效价或滴度）一般不用病毒粒子的绝对 数量而是用噬菌斑形成单位（Plague-Formin
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
上海交通大学医学院教案：微生物学和微生物学
6、抵抗力：常用消毒剂敏感。
（二）临床意义
致病机理及毒素类型，引起疾病霍乱的病程及临床症状。
（三）微生物学检测
标本采集、分离培养、生化反应及血清学鉴定。
二、非O1群霍乱弧菌
与O1群不凝集，生化特征与O1群无法区分。
三、O139型霍乱弧菌
临床症状与霍乱无法区分，有引起世界大流行的可能。
（2）培养特性
HP为微需氧菌，
最适生长温度35℃～37℃，30℃和42℃均生长不良，此点可与其他弯曲菌相区别，pH5.5～8.5均能生长；营养要求高，哥伦比亚琼脂等，培养基中需补充一些特殊物质如血液、血清、淀粉、活性炭等。选择培养基可用改良的Skirrow琼脂培养基加入万古霉素、两性霉素和cefsulodin，本菌在非选择性血平板上经3～5天孵育后形成小的半透明灰色菌落，有微弱的溶血环，革兰染色很浅。
四、副溶血弧菌（20分）
为嗜盐菌
1、生物学性状
革兰阴性、单鞭毛、嗜盐，TCBS培养基上生长特性，对不同浓度NaCl耐受情况，神奈川现象，抵抗力耐碱怕酸，对一般消毒剂敏感。
2、临床意义
菌毛、毒素及其作用。
3、微生物学检查
标本采集、检验程序。
五、气单胞菌属（10分）
1.生物学性状
2.临床意义
六、弯曲菌属（20分）
4．微生物学检验
检验程序、鉴定、耐药性
七、螺杆菌属（20分）
1．螺杆菌属的主要特点及分类
螺杆菌属是一群氧化酶和触酶阳性、微需氧、37℃能够生长、在25℃和42℃均生长不良的革兰阴性弯曲菌。
2．幽门螺杆菌的细菌特性
（1）形态染色HP为革兰阴性、无芽孢、呈螺旋状弯曲的杆菌，尤其在胃黏膜环境中，HP具有典型的螺旋形或弯曲形形态，但在陈旧培养物中菌体可呈圆球状；大多数细菌具有位于菌体一端的多根带鞘鞭毛，运动活泼。
上海交通大学微生物课件第1章
法国人巴斯德（Louis Pasteur） 德国人柯赫（Robert Koch）
2021/2/23 （1822～1895）
（ 1843～1910）
二、微生物的发现和微生物学的建立与发展
（二）微生物学的奠基
1.巴斯德 (1) 发现并证实发酵是由微生物引起的； 化学家出生的巴斯德涉足微生物学是为了治疗“酒病”和“蚕病 (2) 彻底否定了“自然发生”学说； 著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，空气内确实含有微生物， 是它们引起有机质的腐败。 (3) 免疫学——预防接种 首次制成狂犬疫苗 (4) 2巴021/2斯/23 德消毒法：60～65℃作短时间加热处理，杀死有害微生物
抗热： 有些细菌的芽孢，需加热煮沸8小时才被杀死；
抗寒：有些微生物可以在―12℃ ~ ―30℃的低温生长； 抗酸碱：细菌能耐受并生长的pH范围：pH 0.5 ~ 13； 耐渗透压：蜜饯、腌制品，饱和盐水（NaCl, 32%)中
都有微生物生长； 抗压力：有些细菌可在1400个大气压下生长；
2021/2/23
很多细菌都可以非常方便地进行人工培养！
数量大：
在自然界中（土壤、水体、空气，动植物体内和体表） 都生存有大量的微生物！
2021/2/23
级界宽：
Woese三原界分类系统
2021/2/23
变异易：
SARA病毒 流感病毒 细菌耐药性
2021/2/23
细菌抗药性的产生：
2021/2/23
抗（逆）性强：
2021/2/23
个体小:
测量单位：微米、纳米 病毒：纳米 球菌：直径（微米） 杆菌：长、宽（微米） 当然也有很大的肉眼可见的微生物：蘑菇
2021/2/23
食谱广：
微生物获取营养的方式多种多样，其食谱之广 是动植物完全无法相比的！
噬菌体PPT课件
Infection of host cell by T2 phage
噬菌体的生物学性状
抗原性
噬菌体具有抗 原性，能刺激机体 产生抗体，抑制相 应噬菌体感染细菌 。但对已吸附或进 入宿主菌的噬菌体 不起作用。
抵抗力
大于一般细菌
抵抗乙醚、氯仿和乙醇
75℃ 30min或更久才能 被灭活 耐受低温和冰冻 但对紫外和X射线敏感， 一般经紫外照射 10~15min即失去活性。
噬菌体与细菌的关系
裂解作用
增殖方式：复制 增殖过程： 吸附 穿入 生物合成 成熟和释放
吸附和穿入
有尾噬菌体通过尾刺或尾丝特异地 吸附在敏感细菌表面的相应受体上（是Pr 或多糖），两者接触后，噬菌体尾板上 的少量水解酶溶解宿主细胞壁肽聚糖形 成小孔，然后尾鞘收缩，将头部中核酸 经尾鞘小孔注入细菌细胞内，Pr外壳留在 菌体外。
溶源作用
噬菌体基因与宿主菌染色体整合，不 产生子代噬菌体，但噬菌体 DNA 能随细菌 DNA 复制，并随细菌分裂而传代。这种随 细菌分裂而传代的状态称为溶源状态。能 形成溶源状态的噬菌体称温和性噬菌体。 整合在 DNA 上的噬菌体基因称前噬菌体。 带有前噬菌体的细菌称溶源性细菌。
prophage: 整合在细菌基 因组中的噬菌体基因组
噬菌体的应用
细菌的鉴定与分型 分子生物学研究的工具 依据：结构简单，基因数目少，培 养方便，生长迅速，遗传和变异易于控制 和辨认。 细菌感染的诊断与治疗 若在某一标本中检出某种噬菌体数 量较多，表明有相应的细菌存在。
复习思考题
一、名词解释： 温和噬菌体、毒性噬菌体、前噬菌 体、溶源性细菌 二、问题： 1、简述两种不同噬菌体的生活史。
毒性噬菌体的溶菌现象
毒性噬菌体感染敏感菌后可出现溶菌 现象，如果细菌在液体培养基中生长繁殖 成半透明的菌悬液，感染后，便澄清。 在固体培养基中，若用适量噬菌体和宿主 菌液混合后接种培养，培养基表面可有透 亮的溶菌空斑出现。一个空斑系由一个噬 菌体复制增殖并裂解细菌后形成的，称为 噬斑.
实验七 噬菌体效价的测定
实验七噬菌体效价的测定实验七噬菌体效价的测定杨明轩生物111 1102040128一、实验目的1、学习并掌握噬菌体效价的含义及其测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属于细菌病毒，侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞溶解死亡，并在琼脂培养基表面形成空斑，即为噬菌斑。
人们可以根据噬菌斑来判断噬菌体的存在。
噬菌体的效价指的是每毫升培养液中含有的具感染性的噬菌体的数量。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此法得到的噬菌斑形态、大小较为一致，且清晰度高，计算准确。
该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层，然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附后，加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖，迅速混匀后铺平板，作为上层，最后倒置培养。
只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
公式为：噬菌斑形成单位（pfu/ml）＝噬菌斑数×稀释倍数×10（注：需要说明的是，“×10”表示换算单位，根据本实验步骤，因为加入的是100ul噬菌体原液，换算成1000ul，即1ml，因此“×10”，如有变动更改则需另行计算）本实验选择的是λ噬菌体EA94，它是一种被改造过的烈性噬菌体。
三、实验材料1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）LE392；2、噬菌体：λ噬菌体EA94；3、培养基：300ml三角瓶中分装100ml LB培养基，15×150mm试管分装4ml 0.7%琼脂糖；4、灭菌物品：20%麦芽糖，1mol/L MgSO4，10mmol/L MgSO4，18×180mm试管分装4.5ml和20ml噬菌体缓冲液，100ml离心管，500μl枪头，200μl枪头，微离心管，培养皿；5、仪器：取样器，恒温水浴锅，恒温培养箱，台式离心机。
四、实验方法1、感受态的大肠杆菌菌悬液的制备：将活化的大肠杆菌接种于50ml牛肉膏蛋白冻培养液（内含0.5ml20% 8磅灭菌麦芽糖和500ul1mol/L灭菌 MgSO4・7H20）中，经37℃过夜培养后，4000转/分，15min离心收集菌体细胞，然后悬于20ml10mmol/L MgSO4中，备用。
噬菌体分离实验报告
1. 学习噬菌体的分离方法。
2. 掌握噬菌体纯化技术。
3. 了解噬菌体形态和生物特性的观察。
二、实验原理噬菌体是一种感染细菌的病毒，具有高度的特异性。
噬菌体分离实验是通过在含有细菌的培养基上加入噬菌体，观察噬菌体对细菌的裂解作用，从而分离出纯化的噬菌体。
三、实验材料1. 实验组：大肠杆菌（Escherichia coli）菌种、噬菌体培养液、琼脂平板、无菌镊子、无菌滴管等。
2. 对照组：大肠杆菌菌种、无菌水、琼脂平板、无菌镊子、无菌滴管等。
四、实验步骤1. 制备培养基：将大肠杆菌菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养18小时。
2. 分离噬菌体：取一定量的噬菌体培养液，加入适量的无菌水进行稀释，取一定量的稀释液加入琼脂平板中，轻轻摇匀。
3. 制备平板：将制备好的培养基倒入平板中，待凝固后，用无菌镊子取适量的大肠杆菌菌液均匀涂布在平板表面。
4. 孵育平板：将平板倒置，37℃恒温培养24小时。
5. 观察结果：观察平板上的菌落，找出裂解斑，即噬菌体感染后的菌落。
6. 纯化噬菌体：用无菌镊子夹取裂解斑边缘的菌落，接种于新的琼脂平板中，37℃恒温培养24小时。
7. 观察纯化结果：观察平板上的菌落，若出现单菌落，则表明噬菌体已纯化。
8. 观察噬菌体形态和生物特性：将纯化的噬菌体培养液置于透射电镜下观察，观察噬菌体的形态。
同时，进行噬菌体的吸附实验、裂解实验等，了解噬菌体的生物特性。
1. 分离噬菌体：平板上出现裂解斑，表明噬菌体已成功分离。
2. 纯化噬菌体：平板上出现单菌落，表明噬菌体已纯化。
3. 噬菌体形态：透射电镜下观察到噬菌体呈长圆柱形，具有尾丝。
4. 噬菌体生物特性：吸附实验和裂解实验均表明噬菌体具有感染大肠杆菌的能力。
六、实验讨论1. 实验过程中，要注意无菌操作，避免污染。
2. 噬菌体分离实验的关键是裂解斑的观察，裂解斑的出现表明噬菌体已成功分离。
3. 噬菌体纯化过程中，要注意纯化程度的判断，避免杂菌污染。
上海交通大学微生物实验课件实验七污水中噬菌体的分离与效价测定
噬菌体的分离操作程序
于100ml 3倍浓缩肉汤加入污水样本200ml和大肠杆 菌指示菌2ml 37°C培养8小时 取上述混悬液5ml接种到20ml的新鲜的LB液体培养 基，并加入125ul丝裂霉素，37 °C培养18小时。
无菌取上述培养液1ml于1.5ml Eppendrof管中，加 入200ul氯仿后振荡15min，4 °C 4000g离心20min， 0.22um滤膜过滤。
操作程序
取上层琼脂，融化并孵育在48°C（已经融化）， 每人1支，加入上述10-3 、 10-2、10-1、 100其中一 个稀释度的噬菌体与细菌的混悬液，轻轻混匀。 （特别注意琼脂不能离开水浴时间太长，否则琼脂 会凝固，但琼脂不能太烫，不能剧烈振荡） 立即倒入底层琼脂平板，室温5－10分钟，待上层 凝固后，将平板倒置，作好标记。
实验七 污水中噬菌体的分离与效价测定
实验目的
掌握噬菌体分离的基本原理和方法 学会观察噬菌斑
了解噬菌斑的效价测定方法
大肠菌群的鉴定（EMB培养基上的典型菌落的 革兰氏染色）
噬菌体效价的测定方法
噬菌体效价的测定方法噬菌体效价的测定方法1. 引言噬菌体效价的测定方法是研究噬菌体杀菌能力的重要手段。
本文将详细介绍几种常用的噬菌体效价测定方法。
2. 噬菌体效价测定方法斑点法斑点法是最常用的测定噬菌体效价的方法之一。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.在琼脂平板上均匀涂敷被测细菌悬浮液。
3.取一定体积的已知浓度的噬菌体溶液滴在已涂敷的平板上，静置一段时间。
4.观察液滴周围是否出现菌落溶解区，根据出现溶解区的数量和大小，推断噬菌体的效价。
流式细胞术法流式细胞术法是一种快速测定噬菌体效价的方法，适合大规模实验。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将被测细菌悬浮液加入流式细胞仪中，通过光散射和荧光信号检测细菌的状态。
3.依据细菌的状态判断噬菌体的效价。
确定感染能力的法确定感染能力的法是一种精确测定噬菌体效价的方法，可以测定细菌在固定时间内被噬菌体感染的能力。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将细菌与噬菌体溶液接触一定时间后，离心沉淀细菌。
3.通过对沉淀细菌进行计数或直接培养识别，确定细菌被感染的数量。
4.根据感染数量和噬菌体浓度计算噬菌体的效价。
3. 结论本文介绍了斑点法、流式细胞术法和确定感染能力的法三种常用的噬菌体效价测定方法。
这些方法各有优缺点，研究者可以根据实际需求选择合适的方法进行噬菌体效价的测定。
4. 斑点法的优点和缺点优点•斑点法操作简单，易于掌握。
•可以同时测定多个噬菌体效价，提高效率。
•结果直观，通过观察菌落溶解区可以准确判断噬菌体效价。
缺点•斑点法需要较长的时间来观察菌落溶解区的形成，耗时较长。
•结果的定量分析相对不准确，只能通过观察溶解区数量和大小来推测效价。
•受到环境因素的影响较大，如温度、湿度等。
5. 流式细胞术法的优点和缺点优点•流式细胞术法速度快，可对大量样本进行高通量分析。
•结果定量准确，可以精确地获得细菌的状态信息。
噬菌体的分离与纯化
噬菌体的分离纯化及一步生长曲线的绘制前言噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。
目前对于噬菌体的研究大多数集中在人和动物传染性疾病的防治方面，在环境的治理方面的研究报道较少，因此我们试图分离纯化污水中的噬菌体，掌握其生物学性质，应用所得噬菌体处理、净化生活污水，减少生活污水中病原性细菌的危害。
本研究以从小鹅中提取的大肠杆菌为宿主菌，从污水中分离噬菌体并进行纯化，最后绘制一步生长曲线。
1材料与方法1.1材料1.1.1菌种及样品菌种：从小鹅中提取的大肠杆菌，由老师提供。
污水来源：主要来自于农大出水口。
1.1.2试剂1mmol/L CaCl2溶液1.1.3试剂的配制(1) 液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨5g，牛肉膏1.5 g，NaCl 2.5g，加H2O至500mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(2) 3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl 1.5g，加H2O 至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(3) 固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌。
(4) 半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌。
1.1.4主要仪器电热恒温培养箱（SHEL·LAB）、电热恒温水温箱（HHW21·Cu600，XMTD）、恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）、通风柜（M·TFG-A）、医用净化工作台（苏净集团安泰公司）、台式离心机（eppendorf）、台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER）、超低温冰箱（Forma Scientific）、YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器、针头式细菌过滤器、0.22μm微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）、微量移液器（GILSON）、UVette(Eppendorf)。
1.2方法1.2.1噬菌体的分离1.2.1.1摇菌老师提供的大肠杆菌液加入5mL1×牛肉膏液体培养基，混合后，37℃振荡（120rpm）14h，此时大肠杆菌达到了对数生长期，取出4℃保存。
污水处理微生物PPT课件
进水氨氮过高，C/N比过低；
池温过高，超过40；
合建式曝气沉淀池回流比过大，造成沉淀不稳定，曝 气池内气泡带入沉淀区；
絮体破碎。
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谢谢！
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感谢您的观看！
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活性污泥膨胀的原因
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废水水质和污泥膨胀的发生
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水温和污泥膨胀的发生
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溶解氧和污泥膨胀的发生
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pH和污泥膨胀的发生
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负荷率和污泥膨胀的发生
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反应器的混合液流态与污泥膨胀的发生
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丝状细菌图示
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多个丝状细菌在池塘表面
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大量丝状细菌
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游仆虫属
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游仆虫属
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游仆虫属捕食
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鳞可虫属1
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鳞可虫属2
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漂流状态下的表壳虫
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表壳虫属
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旋口虫属
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有毒物质流入时微生物的变化
• 现象： 原生动物和轮虫等后生动物减少 楯纤属急剧减少
• 解决措施：增加曝气池微生物浓度，去除有毒物质
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活性污泥从恶化恢复到正常时出现的微生物
• 指示生物：慢速游动的微生物 如漫游虫属、斜叶虫等，不会 出现优势种属
• 观察时间：运行5-10天
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漫游虫属
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管叶虫属
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操作程序
取上层琼脂，融化并孵育在48°C（已经融化）， 每人1支，加入上述10-3 、 10-2、10-1、 100其中一 个稀释度的噬菌体与细菌的混悬液，轻轻混匀。 （特别注意琼脂不能离开水浴时间太长，否则琼脂 会凝固，但琼脂不能太烫，不能剧烈振荡） 立即倒入底层琼脂平板，室温5－10分钟，待上层 凝观察时间为明天
11:30-12:30
记录噬菌斑的数量 与先前的噬菌体裂解液的稀释度相对应，计算噬菌 体的含量 每个初次分离的噬菌斑可能含有多种噬菌体，要获 得单一的噬菌体，必需进行噬菌体的纯化
污水中大肠菌群的测定 接种乳糖胆盐发酵管 产酸产气的试管接种EMB培养基
噬菌斑的形成 在固体琼脂培养基上，噬菌体感染细菌后，在 宿主细胞内进行核酸和蛋白质的生物合成，最后装 配成噬菌体完整的颗粒，通过裂解宿主细胞释放出 来，使感染的细菌不能生长，从而形成肉眼可以观 察到的透明或浑浊的空斑，称为噬菌斑。
如何进行噬菌体的纯化 挑取单一清晰可见的单个噬菌斑，接种液体培 养基，并加入相同指示菌，铺平板,得噬菌斑 重复多次，可以得到由一个噬菌体的后代形成 的噬菌斑，即获得了纯化的噬菌斑。 观测噬菌斑的特征
实验七 污水中噬菌体的分离与效价测定
实验目的
掌握噬菌体分离的基本原理和方法 学会观察噬菌斑
了解噬菌斑的效价测定方法
大肠菌群的鉴定（EMB培养基上的典型菌落的 革兰氏染色）
基本原理
噬菌体是专性寄生物，必需寄生细菌才能繁殖，伴随 细菌的分布而分布，只要有细菌的地方，就有噬菌体 噬菌体颗粒可以在环境中独立存活，但不能繁殖 噬菌体对宿主的寄生通常具有特异性 温和噬菌体和烈性噬菌体 烈性噬菌体在液体中，可以使浑浊的菌液变为澄清 烈性噬菌体在固体琼脂平板，可以形成透明的噬菌斑 利用噬菌体斑的特征可以分离、纯化、效价滴定
操作程序
滤液收集在一个无菌的1.5ml Eppendrof管中，获得 噬菌体的滤液
培养指示菌大肠杆菌MC1061 18小时（已经培养）
LB 培养基(在试管中)
每组取4个1.5ml 的Eppendrof离心管，分别标注 100、10-1、 10-2 、 10-3 。 4个Eppendrof离心管分别各加900ul LB，从噬菌体裂 解液中取100ul 于100离心管中，混匀后，取100ul 于 10-1离心管中，依次类推10倍倍比递减稀释至10-3 。 （一个移液枪头用到底）
另取4支无菌的Eppendrof离心管，分别标记10-3 、 10-2、10-1、 100 （注意次序）， 从上述相对应的各稀释管中分别取300ul 噬菌体液， 然后各管加200ul 指示菌MC1061，CaCl2 50ul混匀 后，37 °C温箱孵育20min。（每组可以使用3个移 液枪头，注意次序，不能混淆 ）
经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌 为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗 脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革 兰氏阴性菌。
实验报告
实验目的
实验原理
实验步骤 结果与分析 思考题
• p39 (1) 、 (2)、 (4) 、 (5)
下次实验
• 实验 9 质粒的提取与电泳 p141
噬菌体的分离操作程序
于100ml 3倍浓缩肉汤加入污水样本200ml和大肠杆 菌指示菌2ml 37°C培养8小时 取上述混悬液5ml接种到20ml的新鲜的LB液体培养 基，并加入125ul丝裂霉素，37 °C培养18小时。
无菌取上述培养液1ml于1.5ml Eppendrof管中，加 入200ul氯仿后振荡15min，4 °C 4000g离心20min， 0.22um滤膜过滤。
典型菌落的革兰氏染色
• 描述菌落和细菌的特征
革兰氏染色步骤
涂片：载玻片中心加水一滴，无菌操作挑菌， 混于水中，从中心涂开
自然干燥
火焰固定：玻片在酒精灯上加热
初染剂结晶紫染色：结晶紫液1分钟－水洗 碘液媒染：加碘液1分钟－水洗
革兰氏染色步骤
乙醇脱色：滴洗至玻片下端刚不显紫色止－水洗 （关键） 复染剂(如番红)复染：番红染液1分钟－水洗－吸 干－显微镜观察。
如何测定噬菌体的效价
效价指1ml培养液中所含有活的噬菌体的数量 采用双层琼脂平板法，进行噬菌斑的计数，计量单位 为pfu，即plaque forming unit(噬菌斑形成单位）。 获得的噬菌体滤液作10倍的倍比递减稀释 取每个稀释度噬菌体0.1ml加入0.9ml的指示菌，混匀 后，加入到上层琼脂，倾注平皿，选择30－300个pfu 的平皿计算每毫升未稀释的噬菌体原液的效价。