高效液相色谱法同时测定紫草素及其衍生物
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分析与检测
中国酿造
2011 年 第 1 期
总第 226 期 ·173·
高效液相色谱法同时测定紫草素及其衍生物
刘玉梅
（新疆大学 化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046）
摘 要：建立了高效液相色谱法同时测定紫草中的紫草素、去氧紫草素、异丁酰基紫草素、β，β-二甲基丙烯酰基紫草素、异戊酰基紫
草素和2-甲基正丁酰基紫草素等萘醌类衍生物含量的方法。该方法简便、快速、线性范围宽、适应性好，可用于对紫草药材及紫草提
紫草为常用中药，以根入药，因其根呈紫色而得名[1]。 目 前 ，我 国 药 典 收 入 的 品 种 有 3 种 ，新 疆 紫 草 Arnebia euchroma（Royle）Johnst，紫草Lithospermum erythrorhizoh sieb.et Zuce.和内蒙紫草Amebia guttata Bunge的干燥根[2]。 作为传统中药，紫草的药用始载于《神农本草经》中，其味 苦、性寒，具有凉血活血，清热解毒，消炎透疹等功效，用于 血热毒盛，班疹紫黑，麻疹不透、疮疡、湿疹、吐血尿血、水 火烫伤等症[3-5]。现代药理学研究表明，新疆紫草含有多种 生理活性成分，其中以紫草素及其衍生物研究最为集中， 不仅具有抗菌、抗氧、抗癌、抗生育、抗甲状腺、降血糖、保 肝护肝和提高免疫力等多种作用，而且还是一种高品质的 天然色素，因此已广泛应用于医药、酿造、化妆品和印染 工业中[6-8]。紫草中萘醌类色素的测定方法有比色法、重量 法、分光光度法、薄层扫描法和高效液相色谱法，中国药典 2010版收录以紫外-可见分光光度法测定紫草中的羟基萘 醌类总色素的含量，以高效液相色谱法在275nm检测波长 下，采用C18柱测定其中β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量[9]。 对于紫草素中多种萘醌类色素的同时测定已有部分文献 报道，韩洁等[10]建立了HPLC法同时测定紫草中紫草素、异 丁 酰 基 紫 草 素 和 β，β- 二 甲 基 丙 烯 酰 基 紫 草 素 ，ASSIMOPOULOU N等 采 [11] 用HPLC/PDA/MS对53个不同来源 的紫草属植物中的主要羟基萘醌类物质的相对含量进行 了分析，HU YN等[12]报道了采用HPLC-DAD分析了9个不 同产地的紫草中的8种主要萘醌类色素成分，施玉峰等[13] 采用反相高效液相色谱法，以乙腈-四氢呋喃-水为流动相
紫草原料：购自新疆医药公司；紫草CO2浸膏：以新疆 紫草为原料采用超临界CO2萃取技术在实验室制得。
标准对照品：紫草素，中国药品监督检验所；去氧紫草 素、异戊酰基紫草素、2-甲基正丁酰基紫草素、β，β-二甲基 丙烯酰紫草素，上海阿达玛斯（Adamas-Beta）试剂有限公 司；异丁酰基紫草素，梯希爱（上海）化成工业发展有限公 司；甲醇、氯仿、乙腈等试剂，购自化学试剂公司，高效液相 色谱用试剂为色谱纯，其余试剂为分析纯。 1.2 标准样品溶液的配制
实验数据还表明，当紫草中2-甲基正丁酰基紫草素和 异戊酰基紫草素的含量相对较低时的测定误差会增大， 当样品浓度＞100μg/mL时3种方法定量测定的相对标准 偏差基本保持一致。 2.3 分析方法的方法学评价
分析与检测
中国酿造
2011 年 第 1 期
总第 226 期 ·175·
表1 异戊酰基紫草素和2-甲基正丁酰基紫草素的定量问题(n=3) Table 1. Quantitative analysis of Isovalerylshikonin and 2-Methyl-n-butylshikonin (n=3)
4.26
紫草素对照品
210.00
224.12
232.94
214.40
9.28
4.14
525.00
523.74
535.95
491.97
wenku.baidu.com
22.70
4.39
55.50
52.49
59.38
55.41
3.53
6.20
2-甲基正丁酰基
111.00
109.45
116.99
108.18
3.46
4.27
紫草素对照品
222.00
收稿日期：2010-10-05 基金项目：新疆大学博士启动基金项目（BS080114） 作者简介：刘玉梅（1965-），女，新疆乌鲁木齐人，教授级高级工程师，主要从事天然产物功能因子研究。
2011 No．1
· 174 · Serial No．226
China Brewing
Analysis and Examination
取物中的萘醌类衍生物的含量测定和质量控制。
关 键 词：紫草；紫草素；紫草素萘醌类衍生物；高效液相色谱法
中图分类号：TS264.4
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2011）01-0173-04
Simultaneous determination of shikonin and its derivatives in Arnebia Euchroma (Royle) Johnst by HPLC
准确称取上述紫草素衍生物的标准对照品适量，用 乙腈溶解并定容，得到浓度为1.06mg/mL紫草素、1.06mg/mL 去氧紫草素、1.17mg/mL异丁酰基紫草素、1.12mg/mL β，β二 甲 基 丙 烯 酰 紫 草 素 、1.05mg/mL 异 戊 酰 基 紫 草 素 、 1.11mg/mL 2-甲基正丁酰基紫草素的对照品储备液，冰箱 中4℃储存备用。 1.3 色谱条件的选择
色谱柱：Hypersil Gold-C18柱，250 mm×4.6mm，填料粒 径5μm；流动相：乙腈∶水=85∶15（v/v）；色谱柱温度：30℃； 流速：0.8mL/min；进样量：10μL；检测波长：516nm；峰面积 外标法定量。 1.4 样品的处理与测定
紫草样品的处理方法参考2010版药典的方法处理。 将紫草样品在50℃干燥3h，粉碎（过3号筛），准称约0.5g 样 品 ，置 于 100mL 具 塞 三 角 瓶 中 ，精 密 加 入 25mL 石 油 醚 （60℃~90℃），超声波辅助萃取30min，冷却，再称定重量， 用石油醚（60℃~90℃）补足减失的重量，摇匀，过滤。精密 量取续滤液10mL，置旋转蒸发仪上蒸干溶剂，残渣用少量 流动相小心溶解，转移至10mL容量瓶中，加流动相定容至 刻度，即得紫草样品待测液备用。紫草CO2提取物准称约 0.05g用乙腈溶解并定容至10mL容量瓶中。测定前将上述 配制好的样品液混合均匀并过0.45μm的滤膜，取续滤液进 样分析。 1.5 统计分析
大连依利特分析仪器有限公司P200II高压液相色谱 系统，UV200II紫外-可见检测器，EC2000双通道色谱工作 站；WFZ-25型紫外光谱仪：天津市光学仪器厂；电子天平： 德国赛多利斯BS210S型；超声波清洗机：天鹏电子新技术 （北京）有限公司；超临界CO2流体萃取实验装置：江苏海 安石油科研仪器厂生产，HA121-50-02型，萃取器容积2L， 操作温度为室温~60℃，压力为0MPa~45MPa。
项目
样品含量（/ μg·mL-1） 方法1（/ μg·mL-1） 方法2（/ μg·mL-1） 方法3（/ μg·mL-1） 方法标准偏差（/ μg·mL-1） 3种方法的RSD/%
52.50
52.69
59.59
55.60
3.46
6.18
异戊酰基
105.00
109.97
117.52
108.66
4.78
进样量的选择：通过比较进样量分别为5μL、10μL和
20μL的分离效果发现，当进样量过大时，去氧紫草素和异 丁酰基紫草素不能达到基线分离，而且总体的分离效果不 佳。如果进样量太少，由于不同产地的样品其中各组分的 含量有差异，会使得个别组分有时捡测不到。因此，最终 选定进样量为10μL。
色谱条件的确定：通过上述实验，最终确定了分离紫 草 中 几 种 萘 醌 类 色 素 的 条 件 ：采用Hypersil Gold-C18柱 （250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈∶水=85∶15（v/v），等 度洗脱；柱温30℃；检测波长516nm；流速0.8mL/min，进样 量10μL。在此色谱条件下，对混合标准对照样（样品为等体 积混合）和超临界CO2提取的紫草样品的色谱分析图见附图。
LIU Yumei
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Urmuqi 830046, China)
Abstract: A determination of method of shikonin, deoxyshikonin, isobutyrylshikonin, β, β′-dimethylacrylshikonin, isovalerylshikonin and 2-Methyln-butylshikonin in Arnebia euchroma(Royle) Johnst by HPLC was established in this paper. The RSD of the method ranged from 0.95% to 5.42% and the average recoveries ranged from 96.79% to 108.71%. The method is simple, rapid, accurate and reproducible, which can be used to determine the content of crude drugs or extracts of Arnebia euchroma. In addition, it can be applied in the quality control. Key words: Arnebia euchroma (Royle) Johnst; shikonin; shikonin derivatives of naphthoquinones; HPLC
实验数据的统计分析结果均是采用Microsoft Excel或 OriginPro7.0专业软件来处理的，试验中的所有样品提取和 测定次数均为n≥3。 2 结果与讨论 2.1 色谱条件的建立和优化
流动相、柱温和流速的影响：考察了不同的色谱柱、不 同比例的甲醇-乙腈-水体系、70%~85%的甲醇-水和70%~ 90%的乙腈-水体系，结果发现85%的乙腈-水体系的分离效 果较好，当流动相中加入0.5%~2.0%的不同比例乙酸水溶 液后，随乙酸含量的增加，色谱曲线的峰形和分离效果均 有所改善，但不显著。对柱温和流速的考察发现，当室温 条件下流速为1.0mL/min时，去氧紫草素和异丁酰基紫草素 不能达到基线分离，在30℃柱温、流速为0.8mL/min等度洗 脱条件下，紫草素、去氧紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草 素和异丁酰基紫草素基本达到基线分离，异戊酰基紫草素 和2-甲基正丁酰基紫草素由于为异构体显示为一合峰。考 虑到长期使用酸性流动相会损坏色谱柱而导致柱效降 低，而且会引起基线漂移，故最终选定85%的乙腈水溶液 作流动性，与已有文献报道的方法相比，该方法不仅简化 了色谱分析流程，且分离时间和分离效果也都得到了改善， 分析时间在12min以内，操作简单，适用性强。
2.2 异戊酰基紫草素和2-甲基正丁酰基紫草素的定量测定 由于异戊酰基紫草素和2-甲基正丁酰基紫草素是异
构体，在目前的分离条件下只能将二者混合定量，因此对 这两个化合物的定量问题又进行了详细的分析。实验数 据表明，对照品即可以采用异戊酰基紫草素或2-甲基正丁 酰基紫草素的单体，也可以采用异戊酰基紫草素或2-甲基 正丁酰基紫草素的混合物进行定量，增加了分析的方便和 实用性，结果见表1。
分析了紫草中的6个成分。 本试验采用HPLC方法对紫草中6个萘醌类成分紫草
素、去氧紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素、异丁酰基紫 草素、异戊酰基紫草素和2-甲基正丁酰基紫草素的含量进 行了同时测定，旨在建立一种简单、快速的紫草中多种色 素成分的定量方法，以期为紫草药材和紫草提取物的含量 测定和质量控制提供快速有效并方便实用的检测方法。 1 实验部分 1.1 仪器、材料与试剂
中国酿造
2011 年 第 1 期
总第 226 期 ·173·
高效液相色谱法同时测定紫草素及其衍生物
刘玉梅
（新疆大学 化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046）
摘 要：建立了高效液相色谱法同时测定紫草中的紫草素、去氧紫草素、异丁酰基紫草素、β，β-二甲基丙烯酰基紫草素、异戊酰基紫
草素和2-甲基正丁酰基紫草素等萘醌类衍生物含量的方法。该方法简便、快速、线性范围宽、适应性好，可用于对紫草药材及紫草提
紫草为常用中药，以根入药，因其根呈紫色而得名[1]。 目 前 ，我 国 药 典 收 入 的 品 种 有 3 种 ，新 疆 紫 草 Arnebia euchroma（Royle）Johnst，紫草Lithospermum erythrorhizoh sieb.et Zuce.和内蒙紫草Amebia guttata Bunge的干燥根[2]。 作为传统中药，紫草的药用始载于《神农本草经》中，其味 苦、性寒，具有凉血活血，清热解毒，消炎透疹等功效，用于 血热毒盛，班疹紫黑，麻疹不透、疮疡、湿疹、吐血尿血、水 火烫伤等症[3-5]。现代药理学研究表明，新疆紫草含有多种 生理活性成分，其中以紫草素及其衍生物研究最为集中， 不仅具有抗菌、抗氧、抗癌、抗生育、抗甲状腺、降血糖、保 肝护肝和提高免疫力等多种作用，而且还是一种高品质的 天然色素，因此已广泛应用于医药、酿造、化妆品和印染 工业中[6-8]。紫草中萘醌类色素的测定方法有比色法、重量 法、分光光度法、薄层扫描法和高效液相色谱法，中国药典 2010版收录以紫外-可见分光光度法测定紫草中的羟基萘 醌类总色素的含量，以高效液相色谱法在275nm检测波长 下，采用C18柱测定其中β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量[9]。 对于紫草素中多种萘醌类色素的同时测定已有部分文献 报道，韩洁等[10]建立了HPLC法同时测定紫草中紫草素、异 丁 酰 基 紫 草 素 和 β，β- 二 甲 基 丙 烯 酰 基 紫 草 素 ，ASSIMOPOULOU N等 采 [11] 用HPLC/PDA/MS对53个不同来源 的紫草属植物中的主要羟基萘醌类物质的相对含量进行 了分析，HU YN等[12]报道了采用HPLC-DAD分析了9个不 同产地的紫草中的8种主要萘醌类色素成分，施玉峰等[13] 采用反相高效液相色谱法，以乙腈-四氢呋喃-水为流动相
紫草原料：购自新疆医药公司；紫草CO2浸膏：以新疆 紫草为原料采用超临界CO2萃取技术在实验室制得。
标准对照品：紫草素，中国药品监督检验所；去氧紫草 素、异戊酰基紫草素、2-甲基正丁酰基紫草素、β，β-二甲基 丙烯酰紫草素，上海阿达玛斯（Adamas-Beta）试剂有限公 司；异丁酰基紫草素，梯希爱（上海）化成工业发展有限公 司；甲醇、氯仿、乙腈等试剂，购自化学试剂公司，高效液相 色谱用试剂为色谱纯，其余试剂为分析纯。 1.2 标准样品溶液的配制
实验数据还表明，当紫草中2-甲基正丁酰基紫草素和 异戊酰基紫草素的含量相对较低时的测定误差会增大， 当样品浓度＞100μg/mL时3种方法定量测定的相对标准 偏差基本保持一致。 2.3 分析方法的方法学评价
分析与检测
中国酿造
2011 年 第 1 期
总第 226 期 ·175·
表1 异戊酰基紫草素和2-甲基正丁酰基紫草素的定量问题(n=3) Table 1. Quantitative analysis of Isovalerylshikonin and 2-Methyl-n-butylshikonin (n=3)
4.26
紫草素对照品
210.00
224.12
232.94
214.40
9.28
4.14
525.00
523.74
535.95
491.97
wenku.baidu.com
22.70
4.39
55.50
52.49
59.38
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3.53
6.20
2-甲基正丁酰基
111.00
109.45
116.99
108.18
3.46
4.27
紫草素对照品
222.00
收稿日期：2010-10-05 基金项目：新疆大学博士启动基金项目（BS080114） 作者简介：刘玉梅（1965-），女，新疆乌鲁木齐人，教授级高级工程师，主要从事天然产物功能因子研究。
2011 No．1
· 174 · Serial No．226
China Brewing
Analysis and Examination
取物中的萘醌类衍生物的含量测定和质量控制。
关 键 词：紫草；紫草素；紫草素萘醌类衍生物；高效液相色谱法
中图分类号：TS264.4
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2011）01-0173-04
Simultaneous determination of shikonin and its derivatives in Arnebia Euchroma (Royle) Johnst by HPLC
准确称取上述紫草素衍生物的标准对照品适量，用 乙腈溶解并定容，得到浓度为1.06mg/mL紫草素、1.06mg/mL 去氧紫草素、1.17mg/mL异丁酰基紫草素、1.12mg/mL β，β二 甲 基 丙 烯 酰 紫 草 素 、1.05mg/mL 异 戊 酰 基 紫 草 素 、 1.11mg/mL 2-甲基正丁酰基紫草素的对照品储备液，冰箱 中4℃储存备用。 1.3 色谱条件的选择
色谱柱：Hypersil Gold-C18柱，250 mm×4.6mm，填料粒 径5μm；流动相：乙腈∶水=85∶15（v/v）；色谱柱温度：30℃； 流速：0.8mL/min；进样量：10μL；检测波长：516nm；峰面积 外标法定量。 1.4 样品的处理与测定
紫草样品的处理方法参考2010版药典的方法处理。 将紫草样品在50℃干燥3h，粉碎（过3号筛），准称约0.5g 样 品 ，置 于 100mL 具 塞 三 角 瓶 中 ，精 密 加 入 25mL 石 油 醚 （60℃~90℃），超声波辅助萃取30min，冷却，再称定重量， 用石油醚（60℃~90℃）补足减失的重量，摇匀，过滤。精密 量取续滤液10mL，置旋转蒸发仪上蒸干溶剂，残渣用少量 流动相小心溶解，转移至10mL容量瓶中，加流动相定容至 刻度，即得紫草样品待测液备用。紫草CO2提取物准称约 0.05g用乙腈溶解并定容至10mL容量瓶中。测定前将上述 配制好的样品液混合均匀并过0.45μm的滤膜，取续滤液进 样分析。 1.5 统计分析
大连依利特分析仪器有限公司P200II高压液相色谱 系统，UV200II紫外-可见检测器，EC2000双通道色谱工作 站；WFZ-25型紫外光谱仪：天津市光学仪器厂；电子天平： 德国赛多利斯BS210S型；超声波清洗机：天鹏电子新技术 （北京）有限公司；超临界CO2流体萃取实验装置：江苏海 安石油科研仪器厂生产，HA121-50-02型，萃取器容积2L， 操作温度为室温~60℃，压力为0MPa~45MPa。
项目
样品含量（/ μg·mL-1） 方法1（/ μg·mL-1） 方法2（/ μg·mL-1） 方法3（/ μg·mL-1） 方法标准偏差（/ μg·mL-1） 3种方法的RSD/%
52.50
52.69
59.59
55.60
3.46
6.18
异戊酰基
105.00
109.97
117.52
108.66
4.78
进样量的选择：通过比较进样量分别为5μL、10μL和
20μL的分离效果发现，当进样量过大时，去氧紫草素和异 丁酰基紫草素不能达到基线分离，而且总体的分离效果不 佳。如果进样量太少，由于不同产地的样品其中各组分的 含量有差异，会使得个别组分有时捡测不到。因此，最终 选定进样量为10μL。
色谱条件的确定：通过上述实验，最终确定了分离紫 草 中 几 种 萘 醌 类 色 素 的 条 件 ：采用Hypersil Gold-C18柱 （250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈∶水=85∶15（v/v），等 度洗脱；柱温30℃；检测波长516nm；流速0.8mL/min，进样 量10μL。在此色谱条件下，对混合标准对照样（样品为等体 积混合）和超临界CO2提取的紫草样品的色谱分析图见附图。
LIU Yumei
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Urmuqi 830046, China)
Abstract: A determination of method of shikonin, deoxyshikonin, isobutyrylshikonin, β, β′-dimethylacrylshikonin, isovalerylshikonin and 2-Methyln-butylshikonin in Arnebia euchroma(Royle) Johnst by HPLC was established in this paper. The RSD of the method ranged from 0.95% to 5.42% and the average recoveries ranged from 96.79% to 108.71%. The method is simple, rapid, accurate and reproducible, which can be used to determine the content of crude drugs or extracts of Arnebia euchroma. In addition, it can be applied in the quality control. Key words: Arnebia euchroma (Royle) Johnst; shikonin; shikonin derivatives of naphthoquinones; HPLC
实验数据的统计分析结果均是采用Microsoft Excel或 OriginPro7.0专业软件来处理的，试验中的所有样品提取和 测定次数均为n≥3。 2 结果与讨论 2.1 色谱条件的建立和优化
流动相、柱温和流速的影响：考察了不同的色谱柱、不 同比例的甲醇-乙腈-水体系、70%~85%的甲醇-水和70%~ 90%的乙腈-水体系，结果发现85%的乙腈-水体系的分离效 果较好，当流动相中加入0.5%~2.0%的不同比例乙酸水溶 液后，随乙酸含量的增加，色谱曲线的峰形和分离效果均 有所改善，但不显著。对柱温和流速的考察发现，当室温 条件下流速为1.0mL/min时，去氧紫草素和异丁酰基紫草素 不能达到基线分离，在30℃柱温、流速为0.8mL/min等度洗 脱条件下，紫草素、去氧紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草 素和异丁酰基紫草素基本达到基线分离，异戊酰基紫草素 和2-甲基正丁酰基紫草素由于为异构体显示为一合峰。考 虑到长期使用酸性流动相会损坏色谱柱而导致柱效降 低，而且会引起基线漂移，故最终选定85%的乙腈水溶液 作流动性，与已有文献报道的方法相比，该方法不仅简化 了色谱分析流程，且分离时间和分离效果也都得到了改善， 分析时间在12min以内，操作简单，适用性强。
2.2 异戊酰基紫草素和2-甲基正丁酰基紫草素的定量测定 由于异戊酰基紫草素和2-甲基正丁酰基紫草素是异
构体，在目前的分离条件下只能将二者混合定量，因此对 这两个化合物的定量问题又进行了详细的分析。实验数 据表明，对照品即可以采用异戊酰基紫草素或2-甲基正丁 酰基紫草素的单体，也可以采用异戊酰基紫草素或2-甲基 正丁酰基紫草素的混合物进行定量，增加了分析的方便和 实用性，结果见表1。
分析了紫草中的6个成分。 本试验采用HPLC方法对紫草中6个萘醌类成分紫草
素、去氧紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素、异丁酰基紫 草素、异戊酰基紫草素和2-甲基正丁酰基紫草素的含量进 行了同时测定，旨在建立一种简单、快速的紫草中多种色 素成分的定量方法，以期为紫草药材和紫草提取物的含量 测定和质量控制提供快速有效并方便实用的检测方法。 1 实验部分 1.1 仪器、材料与试剂