茶树CsPLt基因的荧光定量PCR分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
茶树CsGPX基因全基因组鉴定和表达分析
热带作物学报2019, 40(6): 1130 1137 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2018-10-11；修回日期 2019-02-21基金项目 福建农林大学科技创新专项基金项目“乌龙茶工艺生理分析”（No. CXZX2016102）；“乌龙茶加工体系技术创新及茶类创衍应用研究”（No. CXZX2017350）。
作者简介 王 赞（1992—），男，硕士研究生，研究方向：茶叶加工和综合利用。
*通信作者（Corresponding author ）：郭雅玲（GUO Yaling ），E-mail ：******************。
茶树CsGPX 基因全基因组鉴定和表达分析王 赞，曹红利，岳 川，郭雅玲*福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建福州 350002摘 要 为明确茶树谷胱甘肽过氧化物酶（CsGPX ）基因与非生物胁迫的关系，本研究利用生物信息学手段在茶树基因组中筛选得到3条CsGPX 基因，对其编码蛋白理化性质、基因结构、系统进化树、顺式作用元件进行了分析。
结果表明，CsGPX 包含完整GPX 结构域和3段保守序列，都具6个外显子。
预测启动子上有参与植物激素和非生物胁迫响应的顺式作用元件。
使用实时荧光定量PCR 测定该基因的表达谱，发现它们在不同组织中的表达有显著差异。
进一步分析表明，CsGPX 被低温、ABA 、盐以及干旱处理上调表达，但CsGPX 2和CsGPX 3的表达受低温抑制。
本研究为茶树CsGPX 家族基因克隆和功能验证提供基础。
关键词 茶树；谷胱甘肽过氧化物酶（GPX ）；非生物胁迫 中图分类号 S571.1 文献标识码 AGenome-wide Identification and Expression Analysis of CsGPX Gene in Tea Plant (Camellia sinensis )WANG Zan, CAO Hongli, YUE Chuan, GUO Yaling *College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University / Key Laboratory of Tea Science in Universities in Fujian, Fuzhou, Fujian 350002, ChinaAbstract To reveal the possible involvement of glutathione peroxidase genes (CsGPX ) in the responses of tea plants to abiotic stresses, three CsGPX genes were identified by bioinformatics tools from the tea genome data, and the gene structures, the cis-elements on their promoters, the physiochemical characteristics of the encoded proteins and the phy-logenetic trees were also studied. The results showed that all the CsGPX genes contained 6 exons and shared the gene family-specific GPX domain in addition to three other conserved domains. Cis-elements for the responses of plants to hormones and abiotic stresses were identified on the promoters. Quantitative real-time PCR analysis of the expression profiles revealed that they were significantly different in expression in different tissues. Further analysis showed that the three C sGPX genes were, in general, up-regulated by treatments of low temperature, ABA, salt and drought except that CsGPX 2 and CsGPX 3 were down-regulated by treatment of low-temperature. The results should have laid down a basis for further characterization of CsGPX family genes in tea plant.Keywords tea plant (Camellia sinensis ); glutathione peroxidase (GPX); abiotic stress DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.014生长环境造成的非生物胁迫是农作物减产、品质下降的重要因素[1]。
PCR_SSCP_银染法在茶树基因突变分析中的应用
２００７年第２期ＦＵＪＩＡＮＣＨＡＹＥ实验方法ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）是一种基于ＰＣＲ的单链构象多态性分析技术，即经ＰＣＲ扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下，经高温处理使之解链呈单链状态，然后在一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。
单链ＤＮＡ的迁移率除与ＤＮＡ链的长短有关外，更主要取决于ＤＮＡ单链所形成的空间构象，相同长度的单链ＤＮＡ，可因其碱基序列的变异，导致空间构象改变，引起其在凝胶中的迁移率发生变化，从而将变异的ＤＮＡ与未变异ＤＮＡ区分开来，显示出带型的差异［１］。
该方法是广泛应用于医学领域对基因突变进行快速鉴定的重要手段［２￣６］，而在农业上的应用研究则相对较少。
多酚氧化酶（ＰＰＯ）在茶叶加工中占有极为重要的地位，不同品种ＰＰＯ活性的差异势必与其ＰＰＯ基因核苷酸序列的变异相关。
本研究将ＰＣＲ－ＳＳＣＰ－银染检测技术首次应用于茶树基因变异分析，建立了茶树ＰＣＲ－ＳＳＣＰ－银染检测技术体系，旨在为进一步发现与ＰＰＯ活性差异相关的ＤＮＡ突变提供方法基础。
１材料与方法１．１材料试验材料包括４０个茶树品种（系），采自广东省农业科学院茶叶研究所、湖南农业大学长安教学实验基地、湖南郴州茶树良种繁殖示范场等地，分别为苹云、槠叶齐、福鼎大毫、云南大叶、广西７８－２、龙井４３、黔湄８０９、长叶白毫、白毛２号、潮安大乌叶、祁门４号、金观音、英红９号、黄叶水仙、福鼎大白茶、八仙茶、云南红芽、优１８号、优１９号、优１７号、优２０号、优１５号、印６号、印５号、斯２号、斯１号、白毫早、佛手、茗丰、高桥早、福毫、福云６号、梅占、东湖早、政和大白茶、毛蟹、不知春、碧香早、迎霜、乌牛早。
对供试材料按顺序分别编号为１￣４０号，于－７０℃冰箱中保存。
１．２方法１．２．１基因组ＤＮＡ提取及质量检测基因组ＤＮＡ提取与质量检测采用文献７中的方法。
将纯度符合要求的基因组ＤＮＡ稀释成浓度为１００ｎｇ／μｌ，待用。
茶树ISSR-PCR反应体系的正交优化
Ｏ ｐ ｉ ｉ ａ ｉｎ ｆ ｒＩ Ｒ－ ｔｍ ｚ ｔｏ ｏ ＳＳ ＰＣＲ ｅ ｃ ｉｎ ｓ ｓｅ ｆｔ ａｐｌ ｎｔ ｒ ａ ｔｏ ｙ ｔ ｍ ｏ ａ ｅ
ＮＩ ｉ ｂ ＮＧＪ ｎａ Ｌ ａ Ｚ Ｏ ｎ ．ａ ｇ， Ｈ ＮＧ Ｊ ｇ，ｌ ｎ ＵＡ ａ — ， Ｉｕｎ， Ｈ ＮＧＸｉｇｇｎ Ｚ Ｕ Ｑｉ ｉ ｎ Ｊ
摘
要 ：对茶树 ＩＳ ．Ｃ ＳＲＰ Ｒ反应体系中的 ５ 因素（ ｑ Ｔ 酶浓度（／ ０ ）、 ａ Ｕ（ ） Ｍｇ 浓度（ ｍ ｌ ） 模板 Ｄ Ａ质量浓 ２ ｍ ｏ Ｌ、 ／ Ｎ
度（ ｇ ２ Ｌ ） Ｎ Ｐ浓度（ ｎ ／ ０ ）、ｄ Ｔ （ ｍｍｏ／） ｌ 、引物浓度（ｍｏ Ｌ） ４ Ｌ ｒ ｌ） ｔ ／ 在 水平上进行正交优化试验 ，筛选出各 因素的最佳水
Ｄ ＮＡ
ｐ ｌｍｅａｅ ２ ｍｏ／ ， ０ｎ／ ０ ｐ ） Ａ ｔ ｌ， ． ｏ ｙ ｒｓ， ． ｍ ｌ Ｍｇ ４ ｇ（ Ｌ ＤＮ ｍｐｅ Ｏ２ ｍｍｏ Ｌｄ Ｔ ， ．５￣ ｌ ｒ ｒＴ ｅｏ ｔ ｌ ０ Ｌ ２ ｅ ｔ ０ ｌ Ｎ Ｐ ０２ ｔ ／ ｐ ｍｅ． ｈ ｐｉ ／ ｍｏ Ｌ ｉ ｍａ
第 ３ 卷第 ４ ６ 期
２１ ０ ０年 ８月
湖南 农业 大学学 报（ 自然 科学版 ）
Ｊ ｕｎ ｌ ｆ ｎ ｎ ｒ ｕｔｒｌ ｎｖ ｒｉ Ｎ ｔｒｌ ｃｅ ｃｓ ｏ ｒａ ａ ｉ ｌ ａ ｉｅｓ ｙ（ ａｕａ ｉ ｅ） ｏ Ｈｕ Ａｇ ｃ ｕ Ｕ ｔ Ｓ ｎ
ｖ０１３ Ｏ． ．６ Ｎ ４
（ ． ｕ ａ ｅ ｓａｈＩ ｓ ｔｔ， ｈ ｇ ｈ １ １ ５ Ｃ ｉａ ２ Ｋｅ ａ ｏａ ｒ ｆ ａ ｃ ｎ ｅ ｆ ｉｉｒ ｆ ｄ ｃ ｔ ｎ １ ｎ ｎＴ ａ Ｈ Ｒｅｅ ｃ ｔｕ ｅ Ｃ ａ ｓａ４ ０ ２ ， ｈｎ ； ． ｙＬ ｂ ｒｔ ｙ ｏ Ｔ ｉ ｃ Ｍ ｎｓ ｙ ｏ Ｅ ｕ ａ ｏ ， ｎｉ ｎ ｏ ｅ Ｓ ｅ ｏ ｔ ｉ
茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择
植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 579–587, doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.007——————————————————收稿日期: 2009-12-08; 接受日期: 2010-03-30基金项目: 973计划前期项目(No.2007CB116211)、国家自然科学基金(No.30771755和No.30972401)和安徽省自然科学基金(No.09041- 1006)* 通讯作者。
E-mail: xiatao62@; gaolp62@茶树实时荧光定量PCR 分析中内参基因的选择孙美莲1, 王云生2, 杨冬青1, 韦朝领1, 高丽萍2*, 夏涛1*, 单育1, 骆洋21安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室, 合肥 2300362安徽农业大学生命科学学院, 合肥 230036摘要 选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR 分析(qRT-PCR)准确性的先决条件。
该文以茶树(Camellia sinensis )芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料, 应用实时荧光定量PCR 技术, 分析了18S rRNA 、GAPDH 、β-actin 和α-tubulin 4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。
经GeNorm 和NormFinder 软件分析发现, 当利用荧光定量PCR 分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时, 可选择β-actin 作为校正内参基因; 而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时, 可以选择GAPDH 作为校正内参基因。
关键词 茶树, 实时荧光定量PCR, 内参基因孙美莲, 王云生, 杨冬青, 韦朝领, 高丽萍, 夏涛, 单育, 骆洋 (2010). 茶树实时荧光定量PCR 分析中内参基因的选择. 植物学报 45, 579–587.实时荧光定量PCR(real time fluorescence qua- ntitative PCR, qRT-PCR)实现了聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR)从定性到定量的飞跃, 具有重复性好、灵敏度高、定量准确、速度快等优点, 已成为分子生物学研究中分析基因表达的重要工具(Heid et al., 1996; Haller et al., 2004; Ransbotyn and Reusch, 2006; Yoo et al., 2009)。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量PCR实验原理与应用一、引言荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR），是一种高灵敏、高特异性的基因定量技术。
它通过检测PCR反应过程中产生的荧光信号，可以快速、准确地测量目标DNA的数量。
荧光定量PCR不仅可以用于基因表达分析、突变检测等生物学研究，还在医学诊断、农业育种等领域得到了广泛应用。
二、原理荧光定量PCR基于传统PCR技术，结合了荧光探针技术，能够实时监测PCR反应过程中荧光信号的累积。
在PCR反应中，DNA模板经过多轮的变性、退火和延伸，产生指数级增加的目标DNA片段。
而将荧光探针引入PCR反应体系中，该探针由一个互补于模板DNA的序列和一个荧光物质构成。
在延伸过程中，荧光探针被3’-5’外切酶降解，导致荧光信号的释放。
通过荧光信号的监测，即可获得PCR反应过程中目标DNA的相对数量。
三、实验步骤荧光定量PCR实验通常包括以下几个步骤：1. DNA提取首先需要从样本中提取目标DNA。
DNA提取方法根据样本的来源，可以采用不同的方法，如酚-氯仿法、盐析法、商用DNA提取试剂盒等。
2. PCR反应体系准备根据实验设计确定PCR反应所需的试剂和体积。
PCR反应体系通常包括模板DNA、引物、荧光探针、核酸酶、聚合酶等。
其中，引物用于定义PCR扩增区域，荧光探针用于监测PCR反应过程中产生的荧光信号。
3. qPCR仪设置将PCR反应体系加载到qPCR仪中，设置PCR反应的温度和周期参数。
qPCR仪通过控制温度，实现PCR反应的变性、退火和延伸过程，并监测PCR反应过程中的荧光信号。
4. PCR反应进行将PCR反应体系置于qPCR仪中，开始PCR反应。
qPCR仪会根据设定的温度和周期参数依次进行PCR反应。
在反应过程中，qPCR仪会实时监测PCR反应体系中的荧光信号，并将信号数据输出。
5. 数据分析通过数据分析软件对荧光信号进行处理，得到PCR曲线和相应的荧光阈值。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR，qPCR）是一种常用于检测和定量分析DNA或RNA浓度的技术。
该技术利用荧光探针与靶分子结合产生荧光信号，通过荧光信号的强度可以确定靶分子的数量。
本文将介绍荧光定量PCR实验及数据分析过程。
实验步骤：1.样品制备：根据研究需要选择DNA或RNA样品，提取并纯化目标DNA或RNA，并将其浓度测定。
2.酶切反应：如果需要对目标DNA或RNA进行酶切，可在此步骤中将其酶切为较小的片段。
3.扩增反应体系的准备：根据实验设计和厂家提供的建议，配置扩增反应所需的试剂。
4.PCR扩增：将目标DNA或RNA与引物和荧光探针一起添加到PCR反应管中，并进行PCR扩增。
根据实验设计，设置反应的温度梯度和时间。
5.实时荧光检测：在PCR扩增的过程中，使用实时PCR仪不断监测PCR反应管中的荧光信号，记录其强度变化。
6.构建标准曲线：选取一系列已知浓度的标准样品进行PCR扩增，并记录每个标准样品的荧光信号强度。
根据标准曲线绘制荧光信号强度和目标分子浓度的对应关系。
7.分析样品数据：将样品的荧光信号强度与标准曲线进行比较，可以计算样品中目标分子的浓度。
根据实验目的，可以对样品数据进行统计分析，如计算平均值、标准差等。
数据分析：1.标准曲线分析：使用标准曲线中的已知浓度和相应的荧光信号强度，通过拟合曲线或插值方法，可以计算出待测样品中目标分子的浓度。
2.相对定量分析：若需要比较不同样品之间目标分子的相对表达水平，可选取一个内参基因作为参照，通过计算目标分子基因和内参基因相对表达量的比值，进行比较分析。
3.统计分析：根据实验设计和样品数量，可以使用合适的统计方法对数据进行分析。
常见的统计方法包括t检验、方差分析等。
总结：荧光定量PCR技术在生物学研究中具有重要的应用价值，能够快速、准确地定量测定DNA或RNA的浓度。
在进行实验时，需要注意实验步骤的正确操作，并合理选择实验设计和数据分析方法，以确保结果的可靠性和准确性。
茶树仪-tubulin基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立
Ｅｓ ａ ｉｈｍ ｅ ｏ Ｒ ｅ ｌ ｔ ｂｌｓ ｒｓｅ ｃ Ｑｕ ｎｉ ｔ ｅ ＲＴ Ｐ Ｒ ｌｏ ｅｃｎ ｅ ａ ｔ ａｉ ｔ ｖ － Ｃ
Ｍ ｅ ｈｏ ｏ 仪一Ｔｕｂｕｌ Ｇ ｅ ｆ Ｃａ ｅｌａ ｉ ｎｓｓ ｔ ｄ ｆｒ ｉ ｎ ｎｅ ｏ ｍ ｌｉ ｓｎｅ ｉ
Ｇｒｅ ａ ｄ ｈ ｍｅｔ ｇ ｕ ｖ ｗａ ａ ａｙ ｅ ． Ｒｅ ｕｔ： Ｔ ｅ ｌ ｅ ｒ ｒｎ ｅ ｆ ｓａ ｄ ｒ ｃ ｒｅ ｔｗａ ｒｍ １ ．６ ｔ ｅ ｎ Ｉ． ｎ ｔｅ ｌ ｎ ｃ ｒｅ ｉ ｓ ｎ ｌｚ ｄ ｓｌ ｓ ｈ ｉ ａ ａ ｇ ｏ ｔｎ ａｄ ｕｖ Ｃ ｓ ｆｏ ｎ ４５ ｏ
ｂｌ ｕｉ 因实 时 荧 光 定 量 Ｒ — Ｃ ｎ基 Ｔ Ｐ Ｒ法 ， 以ｅ ｔｂ ｌ 作 为茶 树 内参 基 因进 行 功 能 基 因表 达 差 异研 究 奠 定 了基 础 。 为 ｔ ｕ ｕｉ — ｎ ［ 键 词 ］ 茶 树 ； ｔｂ ｌ 基 因 ； 时 荧 光 定 量 Ｐ Ｒ 关 一ｕ ｕｉ ｎ 实 Ｃ ［ 图分 类 号 ］ Ｑ ４ ． 中 ９３ ２ ［ 献标识码］ Ａ 文 ［ 章 编 号 ］ １０ － ０ ２ ２ １ ）２ ０ ４ — ３ 文 ０ ９ ０ ０ （０ ２ ０ — ２ ５ ０
研 究 报 告
茶 树 一ｕ ｕｉ 因 实 时 荧 光 定 量 Ｒ — Ｃ ｔｂ ｌ ｎ基 Ｔ Ｐ Ｒ方 法 的 建 立
曾威 ， 昕梅 ， 赵 薛佩 ， 陈春妍 ， 师彗云 ， 红雨 袁
信 阳 师 范 学 院 生命 科 学 学 院 ， 南 信 阳 ４ ４ ０ 河 ６００ ［ 要 ］ 目 的 ： 立 茶 树 一ｕ ｕｉ 基 因 实 时荧 光 定 量 Ｒ — Ｃ 摘 建 ｔｂ ｌ ｎ Ｔ Ｐ Ｒ方 法 。 方 法 ： 据 Ｇ ｎ ａｋ中茶 树 —ｕ ｕｉ 因保 守 根 ｅＢ ｎ ｔｂ ｌ ｎ基 区域 设 计 一对 特 异 性 引 物 ， Ｐ Ｒ扩 增 得 到 的 ｔｂ ｌ 基 因 克 隆 到 ｐ Ｇ１－ 将 Ｃ —ｕ ｕｉ ｎ Ｔ ９ Ｔ载体 上 ， 建 的 重 组 质 粒 标 准 品 经 １１ 构 ／０ 梯 度 稀 释 后 ， Ｓ Ｂ ｒｅ 用 Ｙ Ｒ Ｇｅ ｎＩ染 料 法 绘 制 标 准 曲 线 ， 进 行 融 解 曲 线 分 析 。 结 果 ： 准 曲 线 Ｃ 值 检 测 范 围 为 并 标 ｔ １ ． ７０ ， 关 系 数 为 Ｏ９ １ 溶 解 曲 线 分 析 显 示 产 物 为特 异 的单 峰 ， Ｔ 值 为 ８ ￣ ．Ｃ。结 论 ： 立 了茶 树 —ｕ ４５ ２ ． 相 ６ ９ ．９ ， 其 ｍ １ ０３ ￣ 建 ｔ—
一种适于PCR扩增的茶树基因组DNA快速提取方法
第47卷第4期2020年12月V ol.47，No.4December ，2020茶叶通讯Journal of Tea Communication一种适于PCR 扩增的茶树基因组DNA 快速提取方法申超峰1,2，周玲红1,3，彭丁文1,2*，刘跃荣1,2,3，周 闰1,2（1. 郴州市农业科学研究所，湖南 郴州 423000；2. 郴州市农作物分子技术应用研发中心，湖南 郴州 423000；3. 湖南省茶叶产业技术体系 湘南试验站，郴州市地方茶资源保护与利用技术研发中心，湖南 郴州 423000）摘 要：为了建立一种从茶树嫩叶中快速提取基因组DNA 的方法，笔者通过采用常温研磨、常温裂解、一步抽提等措施对CTAB 提取法进行了改良和简化，省去了DNA 纯化和使用RNase 酶降解RNA 两个环节。
使用该方法以茶树嫩叶为材料提取基因组DNA ，并进行紫外光谱法、琼脂糖电泳、PCR 扩增等方式检测。
结果表明，该方法提取的DNA ，其260 nm/280 nm 吸光度比值介于1.81 ~ 1.84，260 nm/230 nm 吸光度在1.75 ~ 1.88；经琼脂糖凝胶电泳检测，获得的DNA 条带较亮且无明显拖尾现象；利用ISSR 引物进行PCR 检测，能够获得清晰稳定条带。
说明该方法操作快速简便，提取的基因组DNA 能够满足PCR 反应需要。
关键词：茶树；DNA 提取；PCR中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1009-525X （2020）04-593-596A Rapid Extraction Method of Tea Plant Genomic DNA Suitablefor PCR AmplificationSHEN Chao-feng 1,2，ZHOU Ling-hong 1,3，PENG Ding-wen 1,2*，LIU Yue-rong 1,2,3，ZHOU Run 1,2（1. Chenzhou Institute of Agricultural Sciences, Chenzhou 423000, China; 2. Chenzhou Agricultural Molecular Technology Application Research Center, Chenzhou 423000, China; 3. Hunan Tea Industry Technology System South Hunan Experimental Station, Chenzhou LocalTea Resource Protection and Utilization Technology Research Center, Chenzhou 423000, China ）Abstract ：In order to establish a method for rapid extraction of genomic DNA from tea leaves, the CTAB extraction method was improved and simplified by grinding at room temperature, splitting at room temperature and one-step extraction, eliminating two steps of DNA purification and RNA degradation by RNase. Using this method, the genomic DNA was extracted from the tender leaves of tea plant, and detected by UV , agarose electrophoresis and PCR. The results showed that the genomic DNA extracted from this method, its absorbance ratio of 260 nm /280 nm was between 1.81 and 1.84, and that of 260 nm /230 nm was between 1.75 and 1.88. The DNA bands obtained by agarose gel electrophoresis were brighter and had no obvious tail phenomenon. Using ISSR primers for PCR detection, a clear and stable DNA band could be obtained. The results show that the method is rapid and simple, and the extracted genomic DNA can meet the needs of PCR reaction.Key words ：Tea plant, DNA extraction, PCR收稿日期：2020-07-18 修订日期：2020-08-11基金项目：郴州市农作物分子技术应用研发中心建设项目（yfzx201903）作者简介：申超峰（1991-），男，湖南邵东人，初级农艺师，主要从事农作物检测分析工作。
茶树基因组的测序与分析
茶树基因组的测序与分析茶叶是中国重要的农业产品之一，在全球也有相当大的市场需求。
茶叶的种植和加工对茶树基因组的理解具有重要意义。
茶树基因组的测序和分析可以为茶树产业的发展提供重要的基础研究支撑。
本文将介绍茶树基因组的测序和分析的进展及其意义。
1. 茶树基因组的测序方法随着高通量测序技术的发展，对于大型基因组的测序变得更加容易和经济高效。
茶树基因组的测序是一个比较复杂的过程，需要考虑到茶树基因组大小（近4亿个碱基对）、复杂性（含有多个倍体性）和杂交繁殖特性等因素。
茶树基因组的测序方法主要有三种：Illumina测序、PacBio测序和Nanopore测序。
Illumina测序是一种高通量测序方法，可以产生短读序列。
这种测序方法通常需要将DNA分成小片段，然后进行测序。
这种方法具有高度准确性和经济性，但对于基因组中的长重复序列区域存在一定的挑战。
PacBio测序技术可以产生较长的读长序列。
该方法使用单分子实时序列技术进行测序，可以很好地解决基因组中的长重复序列区域。
Nanopore测序技术也可以产生比较长的读长序列。
它利用孔径技术进行测序，主要优势在于它可以直接测量单个核苷酸的序列，并且不需要建立退火模型，因此，该方法可以准确解决DNA中的长重复序列区域。
2. 茶树基因组的分析方法茶树基因组的分析方法主要分为两种：比较基因组学和基因组学。
比较基因组学是通过把不同物种的基因组进行比较来发现它们之间的差异。
常用的比较方法有：比对方法、组装方法、注释方法等。
比对方法的基本思路是把一个物种的基因组序列与已知的物种进行比较。
组装方法主要是把碎片组装成完整的基因组序列。
注释方法则是利用基因组学的知识，对测序结果进行注释，即标记不同基因的位点和功能。
基因组学则是研究基因组上的基因，包括基因的功能、调控、表达和进化等方面。
通过比较分析各个基因组的序列，可以鉴定基因、识别基因家族、分析基因结构和功能、探究基因调控网络、还可以研究基因的遗传和进化关系等。
定量荧光PCR技术在基因表达分析中的应用与准确性评估
定量荧光PCR技术在基因表达分析中的应用与准确性评估引言：基因表达分析是生命科学研究中一个重要的课题，它可以帮助我们了解基因的功能以及在不同生物过程中的调控机制。
定量荧光PCR技术是一种广泛应用于基因表达分析的方法，其具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点。
本文将就定量荧光PCR技术在基因表达分析中的应用以及其准确性评估进行探讨。
一、定量荧光PCR技术的原理与流程定量荧光PCR技术是一种基于PCR扩增DNA片段的方法，其通过测量PCR产物的荧光信号强度来定量初始DNA模板的数量。
其基本原理是利用荧光标记的探针与靶序列特异性结合，通过PCR反应的循环扩增产生荧光信号，并通过荧光强度的差异来推断目标序列的表达量。
定量荧光PCR技术的流程主要包括：模板DNA的制备、引物与探针的设计、PCR反应的设置以及荧光信号检测与数据分析等步骤。
在实验过程中，需要根据需要设计适当的引物与探针，并通过荧光信号检测设备来监测PCR反应过程中的信号强度变化，从而获得准确的表达量数据。
二、定量荧光PCR技术在基因表达分析中的应用定量荧光PCR技术在基因表达分析中具有广泛的应用。
以下列举了其中几个常见的应用场景：1. 基因的表达量定量分析：定量荧光PCR技术可以定量检测目标基因在不同样本中的表达水平，从而帮助研究人员了解基因在不同组织或不同生理状态下的表达差异。
2. 显性突变位点的检测：通过设计特异的引物与探针，定量荧光PCR技术可以检测并定量突变位点的存在与数量，帮助研究人员了解突变对基因功能的影响。
3. 药物治疗效果评估：定量荧光PCR技术可以用于评估某些特定基因在药物治疗过程中的表达变化，从而判断药物治疗的有效性和副作用。
4. 基因拷贝数变异的检测：定量荧光PCR技术还可以用于检测基因拷贝数变异，通过测量荧光信号的强度差异，可以精确判断基因的拷贝数。
以上仅为定量荧光PCR技术在基因表达分析中的部分应用场景，实际上该技术还可以应用于其他更为复杂的研究领域中。
荧光定量PCR实验数据分析
荧光定量PCR实验数据分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的实验方法，用于定量检测特定DNA序列的丰度。
荧光定量PCR是一种非常重要的分子生物学技术，在基因表达分析、疾病诊断等领域得到广泛应用。
在进行荧光定量PCR实验后，需要对实验数据进行分析，以获取样品中目标DNA序列的丰度信息。
本文将介绍荧光定量PCR实验数据分析的基本步骤和常见方法。
首先，荧光定量PCR数据的分析通常包括以下几个步骤：1.荧光PCR数据的获取：荧光定量PCR实验过程中，荧光信号会被记录下来。
对于每个样品，会获得一条荧光曲线，曲线上的荧光信号强度与PCR循环次数（Ct值）有关。
2. 荧光曲线的阈值设置：荧光曲线上的信号强度在实验的早期循环中较低，随着PCR循环的进行逐渐增加，直至达到一个稳定的平台。
阈值（threshold）是在这个平台上设置的一个信号强度的固定值，用于确定Ct值。
常用的阈值设置方法包括固定阈值法和导数阈值法。
3.Ct值的计算：Ct值是荧光定量PCR实验中的一个重要指标，表示荧光信号达到阈值的循环次数。
在荧光曲线上，Ct值可以通过与阈值的交点来确定。
Ct值越小，表示目标DNA序列的丰度越高。
4.样品之间的Ct值比较：荧光定量PCR实验中，通常需要同时检测一些内部参考基因（如GAPDH）作为对照，以便进行样品之间的Ct值比较。
内部参考基因应在不同样品中表达稳定，其Ct值应接近。
通过对目标基因的Ct值与内部参考基因的Ct值进行比较，可以计算出样品中目标DNA序列的相对丰度。
5.目标DNA序列的绝对丰度计算：通过构建标准曲线，可以将目标DNA序列的相对丰度转化为绝对丰度。
标准曲线是通过在实验中使用一系列已知浓度的目标DNA序列标准品进行绘制的。
通过测量标准品的Ct值并绘制荧光信号与目标DNA序列浓度的关系曲线，可以通过比较样品的Ct值与标准曲线来计算目标DNA序列的绝对丰度。
荧光定量PCR技术在植物基因组分析中的应用
荧光定量PCR技术在植物基因组分析中的应用PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是分子生物学领域中最常用的技术之一，它通过体外扩增DNA片段，能够在非常短的时间内从极少量的DNA样本中扩增大量的特定DNA序列，因此在DNA分子生物学和生物医学领域具有非常重要的应用价值。
而荧光定量PCR技术则在PCR技术的基础上结合荧光探针实现对PCR产物的实时同时定量检测，因此在基因检测、基因诊断、基因表达分析中具有广泛的应用。
本篇文章将重点介绍荧光定量PCR技术在植物基因组分析中的应用。
一、荧光定量PCR技术在基因检测中的应用基因在植物发育过程中发挥着重要的作用，不同的基因在不同的发育阶段和组织中具有不同的表达模式，因此通过荧光定量PCR技术可对植物基因进行检测和分析，并研究其在发育过程中的表达和功能。
在植物基因检测中，荧光定量PCR技术能够快速且准确地检测基因突变、拷贝数变异、基因重组和多态性等遗传学变异，从而帮助进行分子遗传学研究和基因功能分析。
例如，在植物的抗病性研究中，对相关基因（如R基因）的表达水平进行检测，可了解其在不同病原体侵染时的表达情况，从而为研究植物抗病机制提供基础。
而在植物基因编辑中，荧光定量PCR技术能够快速检测基因敲除或引入突变，从而帮助筛选出所需的编辑体系，为植物基因编辑技术的研究和应用提供技术支持。
二、荧光定量PCR技术在基因表达分析中的应用荧光定量PCR技术可以直接检测组织、器官和细胞中基因在数量水平的表达，从而揭示其在生物体内的功能和机制，因此在植物基因表达分析中具有较为广泛的应用。
通过荧光定量PCR技术，可以获得植物不同基因在不同生长时期、不同组织器官、不同环境条件下的表达水平，以及相应基因在不同发育阶段的表达规律，从而进一步研究其在植物发育和生长中的作用和机制。
例如，在植物抗旱、抗逆等研究中，研究相应基因在逆境应激下的表达变化情况，有助于揭示植物的适应性和生理机制，并为改良基因、遗传改良和再造抗旱植物提供理论依据和技术支持。
表达分析茶树类萌发素蛋白基因CsGLP1和CsGLP2的生物信息学特征与
茶叶学报 2023，64 （6）：13−25Acta Tea SinicaDOI：10.20045/ki.issn.2096-0220.2023.06.002引文格式：吴宗杰，林宏政，欧晓西，等. 茶树类萌发素蛋白基因CsGLP1和CsGLP2的生物信息学特征与表达分析［J］. 茶叶学报，2023，64（6）：13−25.茶树类萌发素蛋白基因CsGLP1和CsGLP2的生物信息学特征与表达分析吴宗杰，林宏政，欧晓西，孙 云*（福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建 福州 350002）摘 要：【目的】类萌发素蛋白（germin-like proteins，GLPs）是一种广泛存在的植物糖蛋白，属于cupin超家族，在植物响应非生物和生物胁迫中起着重要作用。
对GLPs基因进行生物信息学特征与表达分析，为揭示茶树抗病虫等生物胁迫机理提供参考。
【方法】前期从茶橙樱螨刺吸转录组中筛选出2个差异表达的类萌发素蛋白基因CsGLP1和CsGLP2，对其进行理化特性、蛋白质修饰和亚细胞定位预测、结构和启动子序列、氨基酸序列特征分析蛋白质二级结构、进化树、蛋白质高级结构以及不同组织和生物胁迫处理下的表达模式分析。
【结果】CsGLP1的开放阅读框为756 bp，编码251个氨基酸，分子量为28.68 kD，等电点为5.195；CsGLP2的开放阅读框为606 bp，编码201个氨基酸，分子量为21.05 kD，等电点为8.316。
另外，CsGLP1和CsGLP2在氨基酸组成上具有较大差异，预测分析表明它们均可能发生磷酸化、糖基化等修饰。
CsGLP1和CsGLP2都具有信号肽输出位点，为分泌蛋白。
在BoxA（QDFCVAD）、BoxB（G--P-H-HPRATEXXX--G）和BoxC（GXXHFQ-N-G）上具有较高的保守性。
进化树分析显示，CsGLP1和CsGLP2属于不同的亚家族。
蛋白结构分析表明它们的二级结构主要以无规则卷曲为主，都具有典型的同源六聚体三级结构。
荧光定量PCR实验原理及数据分析
荧光定量PCR实验原理及数据分析1.前处理：首先对待测样本进行DNA提取，并且根据需要可对DNA进行适当的纯化和稀释处理。
2. 反应体系的准备：将PCR反应所需的各种试剂组装到反应管中，包括模板DNA、引物、荧光探针和PCR Master Mix等。
其中荧光探针是含有特定标记荧光分子及其互补序列的寡核苷酸。
3.反应机使用条件的设定：根据所需扩增目标的不同，设置适当的反应条件，包括温度控制、循环次数和步骤等。
4.PCR反应过程监测：在PCR反应的过程中，通过荧光信号的实时监测来定量检测目标DNA。
在扩增过程中，如果靶标DNA存在，则引物与目标DNA结合，荧光探针被引物酶切释放出来，从而增大荧光信号。
5.数据收集与分析：实时采集PCR反应过程中的荧光信号，并通过相应的软件进行数据分析。
常见的荧光曲线分析方法有阈值循环数法（Ct 法）和相对定量法（ΔCt法）等。
在数据分析方面1.Ct值分析：阈值循环数法（Ct法）是一种常用的数据分析方法。
通过设定一个荧光信号的阈值（通常为反应曲线的背景荧光信号的两倍标准差），根据荧光信号的曲线与阈值的交点来计算Ct值。
Ct值越小，说明目标DNA起始含量越多。
2.标准曲线分析：通过引入已知浓度的标准品，制作一条标准曲线。
根据标准曲线，可以推算出待测样本中的靶标DNA的含量。
3.相对定量分析：采用相对定量法（ΔCt法）来比较两个不同样本间的靶标DNA的表达量。
通过比较目标基因与内参基因（如表达稳定的参考基因）的Ct值，计算两者Ct值间的差异（ΔCt），进而得到靶标基因的表达差异。
4.绝对定量分析：通过构建外部标准曲线或使用串联基因的方法，直接定量目标DNA的浓度。
总之，荧光定量PCR技术在医学、生物学和分子生物学等领域的应用非常广泛，对荧光信号的实时监测及数据分析能够提供准确快速的定量结果，为研究者们提供了一个强大的实验工具。
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茶 树 ＣＰ ｔ 因的荧 光定 量 Ｐ Ｒ分 析 ｓＬ 基 Ｃ
陈林 波 夏 丽飞 梁名 志 江 昌俊 ， ， ，
（． １ 云南省农业科 学院茶 叶研究所 ， 云南 勐海 ６ ６０ ；． ６ ２ １２ 安徽农业 大学教育部茶叶生物 化学与生物技术重 点开放实 验室 ， 安徽
合肥 ２０３） ３０ ６
摘
要： 利用 ｅ Ｎ — Ｆ Ｐ技术进行茶树低温胁迫处理 的基因表达差异分析， ＤＡＡＬ 获得低温诱 导后表达 的差异片段 Ｔ Ｆ ｔ ｎ ｒ ｔ ｅ Ｄ ６（ｒ ｓ ｉ — ａ ｃ ｐｄ
ｒ ｅ ｆｇ ｅｔ Ｄ ） ｉ ｄ ｒ ｍ ｎ， Ｆ 。经 Ｂ Ａ Ｔ比对发现该片段 与杨树 、 ｖ ａ Ｔ ＬＳ 橡胶树、 脉根 的多元醇转运 子（ ０ ｏ ｂ ｎｐｒ ｒ 分别有７ 百 Ｐ】 ｌ ＇ ｓｏ ｅ ｙ ａ ｔ） ７％、６％、５ ７ ７ ％ 的同源性， 命名为 ＣＰ ｔ ｓＬ。利用实时荧光定量 Ｐ Ｒ技术对多元醇转运子基 因在不 同胁迫 以及不 同组 织中的表 达进 行分析 ， Ｃ 结果 表明， 多元醇转运子基 因能被低 温、 脱水、 高盐诱 导表达 ， 最大表达量分别比处理前提高 ７ ３ ｌ． 、． 倍 。在 芽中表 达最高 ， ． 、２ ２ ５ ３ 其次 是花蕾， 茎表达量与嫩根相近 ， 嫩 均比成熟叶种的表达量高， 在种子中表达 最低 。推测该 基因在组织 中的表达 受到严格控 制 以及 在响应非生物胁迫 中发挥重要作用。 关 键词 ： 茶树 ； 多元醇转运子；Ｒ －Ｃ ； ｑ ＴＰ Ｒ 表达分析
ＣＨＥ ｌ －ｏ ＸＩ Ｌ ． ｉ Ｎ Ａｎｂ ‘ Ａ ｉｆ ，Ｈ ＡＮＧ ｎ —ｈ ‘ ｅ Ｍｉｇ ｚｉ
， ，
ＪＡ Ｇ Ｃ ａｇｊｎ Ｉ Ｎ ｈｎ－ ｕ
（ ．ＴａＲ ｓａｃ ｓｔｔ， ｕｎｎＡ ａｅ ｙｏ Ａ ｒ ｕｔｒ ｃｅｃｓ Ｙ ｎａ ｎｈｉ ６ ２ １ Ｃ ｉａ２ ｅ ａｏａｏ ＴａＢｏｈｍ－ １ ｅ ｅｅｒｈＩ ｔｕｅ Ｙ ｎａ ｃｄｍ ｆ ｇｉ ｌ ａＳ ｉ ｅ ， ｕ ｎｎＭｅｇａ６ ６ ０ ， ｈ ；．Ｋ ｙＬｂｒｔｒ ｏ ｅ ｉｃｅ ｎｉ ｃ ｕｌ ｎ ｎ ｙｆ
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中图分类号 ：５ １ １ ￥７ ． 文献标识码 ： Ａ
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２１ ０ １年 ２ ４卷 ６期
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