活性电泳分析米曲霉沪酿3.042蛋白酶组分

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沪酿3.042米曲霉产中性蛋白酶条件的优化

沪酿3.042米曲霉产中性蛋白酶条件的优化阚清华;汤斌;张庆庆;张海龙【摘要】选择了8种影响因子利用Plackett-Burman设计法,对影响沪酿3.042米曲霉产蛋白酶的主要影响因子进行筛选,试验结果表明,影响该菌产蛋白酶的主要因子为培养温度、初始pH和料水比.利用最陡爬坡试验研究了其逼近最大响应区域,采用响应面法(RSM)对产酶条件进行了优化,并得出菌株产蛋白酶的数学模型;通过对二次多项回归方程求解,得最适产酶条件:培养温度为22 ℃,初始pH为7.0,料水比为1∶0.8.优化后,酶活提高了38.3%.【期刊名称】《安徽工程大学学报》【年(卷),期】2010(025)002【总页数】4页(P26-29)【关键词】米曲霉;蛋白酶;响应面;优化【作者】阚清华;汤斌;张庆庆;张海龙【作者单位】安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000【正文语种】中文【中图分类】TQ925酱油是我国传统酿造制品,有着几千年的实践经验.纯菌种代替野生菌的成功应用,使得酱油实现了大规模工业化生产,原料蛋白质的利用率大大提高,从最初的50%左右提高到80%左右[1].特别是我国上海酿造科学研究所诱变获得的沪酿3.042米曲霉新株,成为我国酿造酱油的最主要菌种,它具有蛋白酶活力高,生长快,适应性强,安全无毒[2]等优点.随后有许多科研工作者为了获得产量更高的菌株,在沪酿3.042的基础上进行研究.孙春华等[3]研究了碳源、氮源对米曲霉的产酶影响;李秀婷等[4]对沪酿3.042在不同碳氮源及pH,温度下的进行最佳产酶的条件研究.本研究利用响应面分析法[5]对沪酿3.042的产酶条件进行分析,找出影响其产酶的显著条件,通过试验,找出其产酶的最佳条件.1 材料与方法1.1 试验菌种米曲霉(Aspergillus niger)沪酿3.042,由安徽味甲天食品酿造有限公司提供.1.2 培养基斜面培养基:将豆粕加水5倍煮沸,小火煮1 h,每1 000 g豆粕制成1000mL浓度为4～5°Bé豆汁、可溶性淀粉20 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4◦7H2O 0.5 g 、KH2PO41 g、琼脂25 g 、pH 自然,121 ℃灭菌30 min;种子培养基:麸皮 80 g、面粉 10g、豆粕 10 g、水 90 g、pH 自然、121 ℃灭菌 30 min;发酵培养基:豆粕、麸皮、水、其他(草木灰、磷酸盐等)、121℃灭菌30 min[6](其配比根据不同试验来确定).1.3 单因素发酵试验在影响米曲霉产酶的诸多条件中,选取了不同原料配比、豆粕的颗粒度、培养温度、曲料的初始润水量、曲料的初始pH值、添加草木灰和添加磷酸盐(以磷酸根计)等因素对米曲霉产酶的影响做单因素试验.豆粕在115℃下干蒸15 min,再1∶1比例润水(或不同pH或不同浓度的磷酸盐的水溶液)30 min,再加入麸皮、草木灰等,放入剩余的水或水溶液再润水20 min后,121℃,30 min灭菌,接种,前18 h,30℃培养,之后在26℃下发酵66 h后测中性蛋白酶酶活[7].1.4 产酶条件优化在单因素试验的结果上,进行Plackett-Burman试验,确定爬坡路径,最终用SAS 8.2软件进行响应面条件优化.40℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μ g酪氨酸,定义为一个蛋白酶活力单位.中性蛋白酶活力测定:Folin法[8].2 结果与讨论2.1 单因素试验原料配比试验[9],豆粕与麸皮配比为8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7;豆粕颗粒度试验[10],豆粕颗粒度分别为＜16目、16目、9目、6目、4目;培养温度对米曲霉产酶的影响[4],在产酶阶段分别放到18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃下培养;曲料的初始润水量指总原料和水的配比,分别为1∶0.6、1 ∶0.8、1∶1.0 、1∶1.2、1 ∶1.4;初始pH 对米曲霉产酶的影响[12],把pH 分别为 4.0、5.0、6.0 、7.0、8.0、9.0、10.0的水溶液加入到曲料中;草木灰[13]添加量分别为原料质量的0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%;添磷酸盐对米曲霉产酶的影响[12],原料的润水改用不同浓度的磷酸盐(0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L)水溶液处理后灭菌接种培养,测成曲中中性蛋白酶酶活.试验结果以测得中性蛋白酶酶活为参考值,得出每个因素产酶的最佳水平分别为:原料配比为豆粕∶麸皮比为4∶6;豆粕颗粒度为6目;产酶培养温度20℃;初始料水比为1∶0.8;初始pH7.0;草木灰添加量为培养基量0.4%;磷酸盐水溶液浓度为0.04moL/L.2.2 Plackett-Burman试验由单因素试验结果,根据Plackett-Burman试验设计得到的N=12试验组合(见表1).配制培养基,接种,发酵(每组3个平行样),以发酵终期的蛋白酶酶活为响应值Y,用于筛选主要影响因子.表1 Plackett-Burman试验结果RUN X1(料比)/(豆粕:麸皮)X2(颗粒度)/目X3(温度)/℃X4 X7(误差项)X5(初始润水量)/(料水比)X6(草木灰)/%(初始pH)X8(磷酸根)/(moL◦L-1)Y(酶活)/U 1 3∶7 ＜16 30 0 1:0.6 0 10 0.05 1207.3 2 3∶7 4 18 0 1:0.6 0 4 0.05 973.4 3 8∶2 4 30 0 1:1.4 0 4 0 251.1 4 3∶7 ＜16 30 0 1:0.6 0.8 4 0 1037.5 5 3∶7 4 18 0 1:1.4 0 10 0 1287.3 6 3∶7 4 30 0 1:1.4 0.8 4 0.05 419.5 7 8∶2 4 30 0 1:0.6 0.8 10 0 630.5 8 8∶2 ＜16 30 0 1:1.4 0 10 0.05 376.4 9 8∶2 ＜16 18 0 1:1.4 0.8 4 0.05 387.3 10 3∶7 ＜16 18 0 1:1.4 0.8 10 0 1243.3 11 8∶2 4 18 0 1:0.6 0.8 10 0.05 1780.9 12 8∶2 ＜16 18 0 1:0.6 0 4 0 1056.2由表2可以看出,对沪酿3.042产蛋白酶影响最大因素是培养温度、初始润水量、初始pH值,这3个因素对产酶影响较为显著,可信度高于95%.表2 因素、水平及影响效果因素 t值检验 Pr＞|t|概率重要性因素 t值检验 Pr＞|t|概率重要性X1料比 1.53418559 0.22537 4 X5初始润水量 -2.47604 0.089583 2 X2颗粒度 0.031577 0.976792 7 X3温度 -2.55358 0.083687 1 X4 误差项X6草木灰 0.316046 0.77268 6 X7初始pH 2.184659 0.116837 3 X8磷酸根 -0.3286 0.764056 52.3 爬坡试验根据Plackett-Burman试验结果分析确定爬坡路径.减少温度、料水比,同时增加初始pH对提高沪酿3.042产蛋白酶酶活有积极意义.因此将温度每次降低2℃,料水比每次减少20%,同时每次增加pH为1.0,其他次要影响因子固定在中心点水平,试验设计及结果见表3.在豆粕:麸皮为4∶6,豆粕颗粒度为6目,产酶培养温度为22℃,初始润水量为1∶0.8,草木灰添加量为0.4%,pH为7.0,磷酸根添加量为0.04mol/L 条件下沪酿3.042产中性蛋白酶酶活最高.表3 爬坡试验结果RUN X1(料比)/(豆粕:麸皮)X2(颗粒度)/目X3(温度)/℃X4X7(误差项)X5(初始润水量)/(料水比)X6(草木灰)/%(初始pH)X8(磷酸根)/(moL◦L-1)Y(酶活)/U 1 4∶6 6 18 0 1:0.4 0.4 5 0.04 22.7 2 4∶6 6 20 0 1:0.6 0.4 6 0.04 807.9 3 4∶6 6 22 0 1:0.8 0.4 7 0.04 1532.7 4 4∶6 6 24 0 1:1.0 0.4 8 0.04 1050.3 5 4∶6 6 26 0 1:1.2 0.4 9 0.04 830.62.4 响应面(RSM)条件优化通过Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验结果分析,利用SAS8.2统计软件,设计Box-Beheken中心组合试验;试验因素及水平见表4,以发酵终期的蛋白酶酶活(U/g湿基)的平均值为响应值Y进行试验.试验设计及结果见表5.图1和图2为响应面分析的曲面图和等高线图.表4 Box-Beheken中心组合试验结果RUN X3(温度)/℃X5(初始润水量)X7(初始pH)Y(酶活)/U RUN X3(温度)/℃X5(初始润水量)X7(初始pH)Y(酶活)/U 1 20 1:0.6 7 1558.7 9 20 1:0.8 6 1856.5 2 20 1:1 7 2011.1 3 24 1:0.6 7 1247.5 4 24 1:1 7 1120.5 5 22 1:0.6 6 1399.7 6 22 1:0.6 8 1260.7 7 22 1:1 6 1077.0 8 22 1:1 8 1114.9 10 24 1:0.8 6 1564.2 11 20 1:0.8 8 2221.8 12 24 1:0.8 8 1337.1 13 22 1:0.8 7 1451.4 14 22 1:0.8 7 1439.1 15 22 1:0.8 7 1444.5表5 回归方差分析方差来源自由度平方和均方 F Pr＞F概率 RootMSE R-sequare一次项 3 709971.7 236657.2 13.74839 0.007521 6.4733 94.35%二次项 3 568876.9 189625.6 11.01613 0.012138交互项 3 179491.8 59830.58 3.475804 0.106689总回归 9 1458340 162037.8 9.41344 0.011854Box-Beheken中心组合试验结果以蛋白酶酶活为响应值,根据Box-Beheken设计表中温度、初始润水量、初始pH量,利用统计分析软件进行多元回归分析,得出蛋白酶活(U/g)依温度、初始润水量、初始pH量三元二次回归方程为Y1=1445-297.35X1-17.8875X2+4.6375X3+285.6375X21-144.85X1X2-148.1X1X3-246.1875X22+44.225X2X3+14.2625X23 ,表5中的F值检验显示,总回归达到显著.表明培养温度、初始润水量、初始pH这3个影响因素与蛋白酶活之间存在显著的回归关系.其中一次项、二次项、交互项较高,表明温度、初始润水量、初始pH量对蛋白酶酶活的影响是显著的.决定系数为94.35%,表明回归方程的拟合程度较好.图1、图2证实拟合面有真实的最大值,即各个具体因子都有一个最佳量.对上述蛋白酶酶活的回归方程求导,可得培养温度为22℃、初始润水量料水比为1∶0.8、初始pH为7.0,此时预测最大蛋白酶活为1532.6U/g.在此条件下,经3次重复试验验证,得到中性蛋白酶平均酶活为1549.8U/g,试验值与模拟值相差在2%以内,证实了沪酿3.042产酶酶活模型的可靠性.同时在优化前培养条件下,发酵得到蛋白酶活平均值为1120.5U/g.产酶条件优化后,沪酿3.042较优化前酶活提高了38.3%.图1 温度 X1、初始润水量X2、和初始pH值 X5两两浪酿产酶曲面图图2 温度 X1、初始润水量X2与初始pH值X5两两交互影响沪酿3.042产酶等高线图3 结论本试验在单因素试验的基础上找出每个单因素的最高水平值,在此基础上进行Plackett-Burman试验,试验结果表明培养温度、初始润水量、初始pH量这3个因素对产酶影响较为显著,由此结果再进行爬坡试验确定了3种因素的浓度范围.最终用SAS8.2软件进行Box-Beheken中心组合试验和多元回归分析对此实验结果进行了验证.产酶条件优化后,沪酿3.042酶活提高了38.3%.沪酿3.042的最佳产中性蛋白酶条件是:产酶培养温度为22℃,pH7.0,初始润水量为1∶0.8,原料豆粕对麸皮配比为4∶6,豆粕颗粒度为6目,添加草木灰量为0.4%,磷酸盐(磷酸根计)水溶液浓度为0.04mol/L.参考文献:【相关文献】[1] 贾爱娟.提高高盐稀态法酿造酱油原料蛋白质利用率及氨基酸出品率的研究[D].西北农林科技大学,2006:11-12.[2] 孟颢华.沪酿3.042米曲霉的纯化复壮[J].中国调味品,2001,7(269):7-9.[3] 孙春华,燕磊,常维山.不同碳源和氮源对米曲霉产酶影响的研究[J].西南农业学报,2007,20(5):986-990.[4] 李秀婷,赵进,鲁绯,等.米曲霉固态发酵产酶条件及酶活力研究[J].ChinaBrewing,2009,203(2):26-28.[5] 赵选民.试验设计方法.科学出版社[M],2006.[6] 贠建民,张卫兵,赵连彪.调味品加工工艺与配方[M].化学工业出版社,2007:108-109.[7] 林祖申.酱油生产技术问答[M].中国轻工业出版社,2000:29-30.[8] SB/T10317-1999,蛋白酶活力测定方法[S].[9] 陈阿娜,汤斌,张庆庆,等.根霉RhizopusspTC1产酶条件的研究[J].安徽工程科技学院学报:自然科学版,2006,21(4):20-22.[10]AshokPandey.RecentProcessdevelopmentsinsolid-statefermentation[J].processBiochemistry,1992(27):109-117.[11]叶勤.发酵过程原理[M].北京:化学工业出版社,2005:106.[12]葛向阳,田焕章,梁运祥.酿造学[M].北京:高等教育出版社,2006:124.。

米曲霉的蛋白酶活力测定

米曲霉的蛋白酶活力测定：
紫外分光光度法：
0．4mol/L三氯醋酸溶液：称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。

pH7.2磷酸缓冲溶液：称取磷酸二氢钠31.2g，定容至1000ml，成0.2mol/L溶液（A 液）
称取磷酸氢二钠71.63g，定容至1000ml，成0.2mol/L溶液（B液）。

取A液28ml和B 液7.2ml，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/LpH7.2的磷酸缓冲溶液。

2％酪蛋白溶液：称取酪蛋白2g，加入0.1mol/L氢氧化钠20ml，在水浴中加热溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH7.2磷酸缓冲液定容至1000ml即成。

配置后应及时使用或放冰箱保存。

蛋白酶活力测定：取试管两只，编号1，2，3，每只试管加入样品稀释液1ml，置于40度水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白5ml，精确保温10min。

时间到后，各管立即加入0.4mol/L三氯醋酸5ml，以终止反应。

继续水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心分离或过滤。

取滤液用751分光光度计在275nm处测定其吸收度。

空白实验也是取试管3支，编号，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L 三氯醋酸5ml，使酶失活，在加酪蛋白。

为了清楚起见，参看下表：
计算：在40度下每1min水解酪蛋白产生1Ug酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。

蛋白酶活力单位＝A/10×11×N。

酱油曲精(3.042)

酱油曲精3.042一、3.042米曲霉概述:米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。

在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。

米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。

米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。

米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病提供了线索。

二、3.042米曲霉（酱油曲精）介绍：酱油曲精以CICC2339（沪酿3.042）米曲霉菌株为主，外增产蛋白酶的黑曲霉等多菌种，通过纯种培养、复配精而成。

优势：1.用于制曲提高产量，氨基酸转化率高于同类产品的5%--10%。

2.增香，酶系中含有NSP分解酶系，鸟苷酸等呈味物质成率较高，能给产品带来特有的鲜香味。

3.缩短制曲、发酵周期，更加便于提高生产连续性及设备利用率。

配方：麦片，豆皮，微量元素，CICC2339（沪酿3.042），ACCC30467（沪酿336-2），ACCC30368（AS3.350）等。

用途：酱油原料制曲，广泛用于豆瓣酱、豆酱、豆豉等的发酵。

三、3.042酱油曲精使用说明：接种量：万分之三至五，按混合干料计。

使用方法：取曲精30倍干面粉稀释混匀，均匀的接入料中。

温度要求：小于等于40℃接种，入池后温度在34-36℃。

（夏低冬高）制曲时间要求：24-28小时成熟。

（制曲一般不超过28小时）保存方法：25℃以下阴凉干燥保存。

（建议冰箱保存）注意事项：（1）其为符合菌种，在生产前期比单一的生长速度可能有所慢，属于正常现象，不会影响生产。

复方发酵促进剂对米曲霉沪酿3.042生物活性的影响

叶磊，立千，和何赵
（北京联合大学职业技术师范学院应用生物技术系，京１０１）＊北００１
摘要：复方发酵促进剂对米曲霉沪酿３０２生物活性的影响进行了研究，果表明该促进剂可明就４结显提高米曲霉产蛋白酶的能力，佳添加浓度为４６Ｘ１Ｉｇ培养基时，促进米曲霉生长、最０５／ｇ可繁
而也会影响到酱油的品质；米曲霉产孢子而
能力的强弱则会影响到菌体繁殖的速度，影酱油是人们日常生活中的主要调味品，响到发酵速度；此，高米曲霉的生物活因提性，酿造酱油的生产中具有重要意义。在
维普资讯
第７期
２００２年７月
中
ＣＨ卫ＣｏＮＤＩＥＮＴＭ
国
调
味
品
Ｎｏ．７
Ｊ１２０ｕ．０２
文章编号：００—９７（０２０１０９３２０）７—０００９—０４
复方发酵促进剂对米曲霉沪酿３０２．４生物活性的影响
收稿日期：０２＿５－８２０－０．０－
ｃｌａｔｖｔｆＡｓｒｉｌｒｚｅＳａｇａｒｗｅ０２．ｔｉｅｒｅａｅａｃｌｒｎａｎｒａｅｔｅｐｏａｃｉｉｙｏｐｇｌｏｙａｈｎｈｉｂｅｄ３．ｅｕｓ４Ｉｓｒｐｔｄｔｔｔｃｅｅａｔｃｎｉｃｅｓｈｒ — ｏｈｈｔｉａｅｙｅｄｏｐｒｉｕｂｕ０％ｗｈｎｉｓｐｅｕａｄｎｅｓｔｅｃｅ４— ６Ｘ１ｅｎｓｉｌｆＡｓｇｌｓｂｙａｏｔ２ｅｌｅｔｒｍｉｍｄｉｇｄｎｉｙｒａｈｓ０～ｇｇｉｅｍｅ／ｎｔ — ｈ

沪酿3.042米曲霉产中性蛋白酶条件的优化

１３单因素发酵试验．
在影响米曲霉产酶的诸多条件中，取了不同原料配比、粕的颗粒度、养温度、选豆培曲料的初始润水
量、曲料的初始ｐ值、Ｈ添加草木灰和添加磷酸盐（以磷酸根计）因素对米曲霉产酶的影响做单因素试等
研究了其逼近最大响应区域，用响应面法（Ｓ）产酶条件进行了优化，得出菌株产蛋白酶的数学模采ＲＭ对并
型；过对二次多项回归方程求解，最适产酶条件：养温度为２通得培２℃ ，初始ｐ为７０料水比为１。．．Ｈ．。０８优
３０２．４的基础上进行研究．春华等研究了碳源、源对在孙］氮李．４
不同碳氮源及ｐ温度下的进行最佳产酶的条件研究．研究利用响应面分析法［对沪酿３０２的产酶Ｈ，本ｓ．４
养，之后在２６℃下发酵６测中性蛋白酶酶活吲．６ｈ后
１４产酶条件优化．
在单因素试验的结果上，进行Ｐａｋｔ— ｕｍａｌｃｅｔｒｎ试验，Ｂ确定爬坡路径，终用Ｓ．最ＡＳ８２软件进行响应
面条件优化．４０℃下每分钟水解酪蛋白产生１ｇ酪氨酸，义为一个蛋白酶活力单位．定中性蛋白酶活力测定：ｏｉＦｌｎ法．］
摘要：择了８种影响因子利用ＰａｋｔＢｒｎ设计法，影响沪酿３０２米曲霉产蛋白酶的主要影响因子选ｌｅ－ｕｍａｃｔ对．４

米曲霉沪酿3.042发酵酱油制曲的条件优化

Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｋｏｊｉｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｒｅｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌａｎｄｂｒａｎｉｓ２ｌ３，ｔｈｅｍｏｉｓｔｅｎｉｎｇ１ｅｖｅｌｉｓ１２０％，ｔｈｅｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｉｍｅｉｓ
时，能够明显增加孢子成熟速度，白色茵丝生长厚实，曲味浓郁，有独特香味，此时产生的蛋白酶和淀粉
酶的酶活性较高，最适于曲料发酵。
关键词：米曲霉；蛋白酶；淀粉酶；制曲；酱油
中图分类号：Ａ
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００４０，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００４０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈａｉｍｓｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ，ｍｏｉｓｔｅｎｉｎｇｌｅｖｅｌ，ｒａｗ

基于基因组改组的米曲霉沪酿3.042多亲株PEG介导融合育种

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ＰＡＮ，ＡＬｉＬＩＮＧｎｈｎ，ＩＹａｃａｇＭＡＯａｋｎ，ＸｉｏａｇＨＵｉＪｅ
（ｃ０ｌｆｏｃｎｅａｄＢｏｎｅｄｇｓｕｌＣｉａｎｖｆｏＴｃｎｌｙＧｕｎｚｏｌｏ６ＣｉａｓｈｏＢｉｉｃｌｉｅｎｅｎｏｔｈｉｓｆｅｈ０ｏ．ａｇｈｕｏｏ。ｈｎ）ｏｓｃ１ｌｎＵｅｇ５ＡｂｃＭｕａｔｔｉｆｐ删ｕｚｅ．２ｗｒｏｅｙｃｍｐｕｄｍ协ｅｅｉｏｖ—ｉ１ｎＧｃｅｍ０ｏｉＥｇｔｉ蚰ｔｔ１ｓａｓＡｓｅ：ＩｒｎｏｓａＯｅｅｂ３４ｄｂｏｏｎｕｇｎｓｆＵＬｃｄｓａＮＴｍｏｓ．ｉｎｈｓｈｓｓ
Ｔｅｃｓｉ－ｅａｉｇｐａｅｅｐｒｎｓａｄⅡｅｐｅｓｃｖｉｏｏｉｅｅｔｔｎｗｅｅｕｅ０ｓｒｅｉｈｐｔａｅｐｏｕ．ｇｍｕａｔ．ｉｈａｅｎｄｄｎｌｔｘｅｉｔｎｌｍｔａｅａｔｅ够ｆｓｌｆｍｌａｉｒｓｄｔｃｅｎｈｇｍｅｓ－ｒｄｃｎｔＩｓＳｘｍｅｉｄｎｏ１ｓｉｓｗｉｉｈｒｎｕ１ｐｅｓｒｏｔｉｅｆｒｏｃｃｅｆｃｎｕｎｒｃｄｒｓＴｈｃｉｉｏｍｔａｅｐ０ｕｅｙｍｕａ１ＦＩｌｔｎｔｈｇｅｅ仃ａｍｔａｅｗｅｅｂａｎｄａｔｙｌｓｏｏｎｅｔ０ｅｕｅ．ｅａｔ哆ｆｐｅｓｒｄｃｄｂｔＩＩ４ａｈｅｐＶｔ一

米曲霉培养及蛋白酶分析

米曲霉培养及蛋白酶的分析•实验目的及要求：通过固态三角瓶培养米曲霉，掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法。

•实验原理：固态培养方法（ solid state cultivation ）：主要有散曲法和块曲法。

部分黄酒用曲，红酒及酱油米曲霉培养属散曲法，而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。

固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸热的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲；转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中。

固态培养微生物，主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母也可采用此法。

其主要优点是节能，无废水污染。

单位体积的生产效率教高。

米曲霉（ Aspergillus oryzae ）属于曲霉菌（ Aspergillus ）。

菌落初为白色，黄色，既而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。

•实验过程：•米曲霉菌种的纯化，制成斜面，将斜面菌种接入 250ml 三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（ 500ml ）三角瓶。

培养物经过水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活性测定。

•米曲霉培养：本实验分为斜面培养和三角瓶培养两个阶段。

三角瓶培养物在工厂中作为一级种子。

试管斜面培养基：豆饼浸出汁： 100 克豆饼，加水 500ml ，浸泡 4 小时，煮沸 3-4 小时，纱布自然过滤，取液，调整至 5 波美度。

没 100ml 豆汁加入可溶性淀粉 2 克，磷酸二氢钾 0.1 克，硫酸镁 0.05 克，硫酸铵 0.05 克，琼脂 2 克，自然 pH 。

或采用马铃薯培养基：马铃薯 200 克，葡萄糖 20 克，琼脂 15-20 克，加水至 1000ml ，自然 pH 。

三角瓶培养基制备：米曲霉的培养基： 1 ：麸皮 40 克，面粉（或小麦） 10 克，水 40ml 。

2 ：豆粕粉 40 克，麸皮 36 克，水 44ml 。

装料厚度： 1cm 左右；灭菌：120 ℃，30min；接种及米曲霉的培养条件：米曲霉固态培养主要控制条件：温度，湿度，装料量，基质水分含量。

米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042内切型纤维素酶的分离纯化与鉴定

ＷＵＪｉ— ａＣＨＡＮＧｕｙｉｇＳＵＮＰｅｇＺＨＡＮＧｎ — ｕ，ｎｘｉ，Ｓｈ — ｎ，ｎ，ＹｏｇｋｏＺＨＡＮＧ－ｉｇＨｅｙｎ
（．ｌｇｆＬｉｅＳｉｎｅ，Ｈｅｅｉｅｓｔ，Ｂａｄｎ７０２Ｃｈｎ；１ＣｏｌｅｏｆｃｅｃｓｅｂｉＵｎｖｒｉｙｏｉｇ０１０，ｉａ２ＲｅｅｒｈＣｅｔｒｆｒＢｉｔｃｎｌｇ，Ｈｅｅｉｅｓｔ，Ｂａｄｎ７０２，ｉａ．ｓａｃｎｅｏｏｅｈｏｏｙｂｉＵｎｖｒｉｙｏｉｇ０１０Ｃｈｎ）
Ｐｕｉｉａｉｎａｄｉｅｉｉａｉｎｏｎ０ｅｌｌｓｓｆｏｒｆｃｔｏｎｄｎｔｆｃｔ０ｆｅｄｃｌｕａｅｒｍ
Ａｓｒｉｌｓｏｙａｎａ．４ｐｅｇｌｕｒｚｅＨｕｉｎｇ３０２
米曲霉（ｓｅｇｌｕｒｚｅＡｒｉｌｓｙａ）ｐｏ沪酿３０．４２内切型纤维素酶的分离纯化与鉴定
武金霞淑，鹏张永阔张贺迎，常英孙，，
（．北大学生命科学学院，北１河河保定０１０；．北大学生物技术研究中心，北保定７０２２河河０１０）７０２
ｌｅａａｅｅｄｃｌｌｓｓｉｈｒｄｎｙｏｕｉｎ。ｉｗａｏｎｈｔｔｅｅｕｉｎｐａｆ０１，０２，ｙｓｐｒｔｎｏｅｌａｅｎｔｅｃｕｅｅｚｍｅｓｌｔｏｕｔｓｆｕｄｔａｈｌｔｅｋｏ．ｏ５．０

固体发酵实验米曲霉的培养蛋白酶活性分析及中性蛋白酶的分离纯化

（表1）固体发酵实验—— 米曲霉的培养及蛋白酶活性分析
OD660
样品
1
2.79 9
3.01 0 2.76 7 1.63 7
2
2.91 3
2.76 7 2.79 9 1.62 5
空白 ①
1.20 5
1.14 2 0.73 0 0.48 9
空白 ②
1.13 2
1.16 1 0.77 7 0.43 7

实际OD595=测定样液的OD595平均值 — 空白对照OD595 平均值蛋白质浓度（mg/ml）=标准蛋白量×稀释倍数/1000 样品中性蛋白酶活力（U/mL）=[(样液的平均OD275 — 空白对照的平均OD275）/0.01]×稀释倍数/10 样品中性蛋白酶总酶活（U）=样液蛋白酶活力（U/mL） ×样液体积（mL）样液中性蛋白酶比活力（U/mg）=样液蛋白酶总酶活/样液总蛋白
生物工程实验报告
第x组：xx Xxx xx
固体发酵实验—— 米曲霉的培养及蛋白酶活性分析

经查阅文献，本组最后确定的碳氮比是2：1 培养基设计方案：考察培养基中水分含量对米曲蛋白酶的影响灭菌条件：121℃ 30min 斜面接种时间：2014-10-22 16:18 下表为具体的固态培养基配方
1.61
3
0.72
2.63
985
-
375.56
11.4
1.63
4
1
5.18
1314
-
253。54
15.15
1.09
结果讨论
本小组以不同PEG浓度为变量研究其对酶萃取分离的影响。以40%的(NH4)2SO4作为成相盐，考察了不同浓度的 PEG对中性蛋白酶萃取的影响，结果如表4所示。从表4 可以看出，随着PEG浓度的增加，相比总体看来呈上升的趋势，上相酶活回收率和纯化倍数先增加后下降。原因在于：一方面，随着PEG浓度上升，分子内亲水基团增加，亲水性增强，疏水性减弱，表面张力减小，相比增加，蛋白质(包括中性蛋白酶)趋

米曲霉耐盐蛋白酶的分离、纯化及其耐盐机制初步研究

米曲霉耐盐蛋白酶的分离、纯化及其耐盐机制初步研究米曲霉耐盐蛋白酶的分离、纯化及其耐盐机制初步研究米曲霉蛋白酶的耐盐性与酱油蛋白质利用率和氨基酸含量密切相关,目前对米曲霉3.042（Aspergillus oryzae 3.042）蛋白酶的耐盐性及其耐盐机理研究较少且不够深入。

因此,选育高产蛋白酶米曲霉并研究其所产蛋白酶的耐盐机制具有重要意义。

本文以米曲霉3.042（Aspergillus oryzae 3.042）为原始菌株,利用常压室温等离子体诱变（ARTP）技术得到一株高产蛋白酶诱变菌株,从诱变菌株中分离、纯化和鉴定出两种耐盐蛋白酶—天冬氨酰氨肽酶（AAP）与碱性蛋白酶（AP）,并在分子水平上初步阐明了两种蛋白酶的耐盐机制。

（1）利用ARTP技术选育出一株高产蛋白酶米曲霉诱变菌株H8。

采用ARTP诱变技术选育到一株高产蛋白酶、遗传稳定（传代15次）、孢子颜色发生变化的诱变菌株H8,其中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和天冬氨酰氨肽酶酶活比原始菌株分别提高了31.82%、19.36%、20.76%和24.77%。

诱变菌株H8生物量比原始菌株提高2.9%。

应用RT-qPCR方法进一步证实,高产蛋白酶菌株H8中AAP和AP 基因转录水平分别高于原始菌株米曲霉27%和30%,说明AAP基因与AP基因转录水平提高是引起种曲发酵酶活提高的因素之一。

ARTP处理可能加强了米曲霉AAP和AP基因的转录表达,进而提高了两种酶的酶活。

（2）从诱变菌株H8中分离纯化出耐盐天冬氨酰氨肽酶（AAP）并阐明了其初步耐盐分子机制。

利用磷酸盐缓冲液提取、现代色谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等技术从诱变菌株H8中分离纯化和鉴定出耐盐蛋白酶—AAP。

结合理化特性分析可知该酶分子量约57 kDa含有Zn2+,其最佳和最稳定的pH值和温度分别为7和50°C。

蛋白质同源建模、分子动力学模拟、二级结构、酸性残基和内部残基疏水性分析表明,与对照蛋白酶相比,该酶在高盐环境下有序二级结构含量较高、水合表面酸性残基与特定碱性残基之间形成的盐桥较多、内部残基疏水性较强,这是该酶可能的耐盐机制。

米曲霉沪酿3.042制曲过程中碱性蛋白酶的表达分析

ｄｒｇｆｒｎｔｎｈｍｐｏｅｎａｅｏａｓｒｔｎｗａｉｈｒｔａｈｔｏｒｎｌｔｎｗｈｃｎｉａｅｈｔｔｅｅｐｅｓｎｏｌａｉｅｕｉｅｍｅｔｉ．Ｔｅｉｒｖｍｅｔｒｔｆｔｎｃｉｉｓｈｇｅｈｎｔａｆｔａｓｉ，ｉｈｉｄｃｔｄｔａｘｒｓｉｆａｌｎａｏｒｐｏａｏｈｏｋｎ
ＧａＣｈｏ
中图分类号：５Ｑ７６Ｑ５，８
ＡｎｌｓｓｏｔｅｅｐｅｓｏｆｌａｉｅｐｏｅｓｒｍＡｓｅｇｌｕＪａｙｉｆｈｘｒｓｉｎｏａｋｌｎｒｔａｅｆｏｐｒｉｓ０ｌ
ＣＨＥＨｏｇｉＬａｇｇＰＮｎｍｅ，Ｉｎ￣ｎ，ＡＮｉＹＡＦＬ，Ｎ
陈红梅，李方方，潘力，杨慧林，ｌｃ，王超
（华南理工大学生物科学与工程学院，东广州５００）广１６０
摘要：测定了米曲霉３０２曲在固体制曲时碱性蛋白酶的酶活，．种４同时利用实时定量ＰＲ析了碱性蛋白酶基因ａＣ分ｌｐＡ的表达。结果
米曲霉作为一种安全的丝状真菌被广泛地应用在酿造、酶制剂等行业中，中在酱油酿造过程中，曲霉分泌其米
各种蛋白酶来降解原料，高氨基酸含量，提增加酱油的风味；由于在固体培养状态米曲霉分泌的酶远比在液体
ｔｅＰＲ，Ｑ－ＰＲ是一种在ＰＲ反应体系中加入荧ｉＣＦ－Ｃ）ｖＣ光基团，用荧光信号积累实施监测整个ＰＲ过程，利Ｃ在ＰＲ定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。该技术Ｃ

米曲霉沪酿3.042产蛋白酶活力与孢子数之间的关系初探

３ ℃ ｔｍｐｅａｕｒｏｉｉｎ７ｅｒｔｅｃｎｄｔｏｓ．ｔｎｗｉｌｂｅｓｍｐｌｄｆｒａｌｚｎｈｒｅｓｃｉｔｎｄｔｍｏｕｈｅｌａｅｏｎａｙｉｇｔｅｐｏｔａｅａｔｖｉｙａｈｅａｎｔ
ａｐｒｓｃｒｅｉｈｅｓｌｄｓａｅｍｅｉｍｎｄｓｏｅｕｖｎｔｏｉ — ｔｔｄｕｗｈｉｈｃｎｔｉｏｙａｅｌｃｏａｎｓｓｂｅｎｍａ，ｗｈｅｔａ，ｗｈｅｔｂａｎｔｅａｒｎｉｈ
数值与蛋白酶活力不表现相关性。
关键词：福林法；白酶活力；蛋孢子总数；米曲霉；究研中图分类号：２１２ＴＳ０．５文献标识码：Ｂ文章编号：ＯＯ９３２１）５０８０１０一９７（０００ —０４－５
ｏｐｒｔｔｅ１ｆｓｏｅａｈ２，１，２，３，４ｈｓｉｅｔｅｐｉｔ８４６２ｈｔｅｅｆｉｏｎ．Ｔｈｅｕｔｈｗｈｔ１Ｔｈｒｓａｃｒｖｍｅｒｓｌｓｓｏｔａ：（）ｅｅｉｅ — ｔｉｉｌｒｔｅｗｅｎｔｅｃｒｅｏｒｔｉａｅ（ｔｂｌｍ）ａｄｔｅｃｒｅｏｈｍｏｎｆｓｏｅａｎｓｍｉｉｙｂｔｅｈｕｖｆｐｏｅｎｓｍｅａｏｉａｓｎｈｕｖｆｔｅａｕｔｏｐｒｓ
时间为１，８２，６４２１，４３，２ｈ这５个时间点进行取样分析，定曲的蛋白酶活力和孢子数。结果表明：测在固态培养过程中米曲霉的孢子数（态变化）形曲线与蛋白酶活力（代谢作用）曲线存在一定的相似性，变

米曲霉的培养及蛋白酶的活性分析

6.0
100.0
6.5
87.0
7.0
76.4
8.0
59.2
9.0
52.2
• 由表知我们培养基起始pH范围为6-7，pH=6.0时酶活最高
• 综上所述，米曲霉产中性蛋白酶的适宜培养条件为:
• m(麸皮):m(豆粕)=4:1 可用8g:2g • 水50%，即10ml • pH=6
我们小组的加样配方为：
• [3]邓倩，林亲录，赵谋明，周俊清.米曲霉M3产高蛋白酶特性研究[J].中国调味品.2005,1:16-20
其他因素的影响
• 1、培养基的含水量
加水量 /ml 2.5 5 7.5 10.0 12.5

W(水) % 33.3 50 60 66.7 71.4
单位酶活
680.5 1489.2 1414.2 1110.2 328.2
• 2、蛋白酶活力的测定
• (1)成曲水分含量的测定：准确称取1.0000g左右的研细的成曲于称量瓶中(预先称好空瓶重量)，置于105℃干燥箱中烘至恒重(大约2h)，取出在干燥器冷却后准确称量，计算水分含量。
• (2)称取一定量(5g左右)充分研细的成曲，按加水比1:20(约 100ml)加入蒸馏水，40℃水浴内间断搅拌1h，滤纸过滤，滤液即为粗酶液，用量筒准确测量粗酶液的体积V(ml)。取少量用0.1mol/LpH7.2的磷酸缓冲液稀释一定的倍数后测酶活力。
• 从另一文献中发现有加葡萄糖，活力也得到显著提升，考虑到菌株的差异，以m(麸皮):m(豆粕)=9:1尝试加入。
参考文献:
• [1]赵飞龙，徐亚军.米曲霉的应用研究进展[J].中国酿造.2006,3:8-10
• [2]杨世平，邱德全.米曲霉产中性蛋白酶的适宜条件[J].湛江海洋大学学报.2005,25(3):47-51

米曲霉制曲过程中酶活性变化及其工艺优化

米曲霉制曲过程中酶活性变化及其工艺优化2007No.5?56?SerialNo.170ChinaBrewingInn.vati.nandKn.w1edgeTmsfer米曲霉制曲过程中酶活性变化及其工艺优化林祖申(上海酿造科学研究所,上海200237)摘要:国内酱油酿造主要选用纯种米曲霉,其制曲是酱油生产的一个重要工序.文中对米曲霉制各过程中水分,温度,空气,湿度,环境对米曲霉生长及酶活力的影响进行了探讨,并提出了加强制曲管理优化工艺的措施.关键词:水分;温度;酶活力;制曲管理中图分类号:TQ925文献标识码:A文章编号:2054—0571(2007)05—0056—04 ChangeofenzymeactivityinAspergillusoryzaecultivationandtechnicalopti mizationLZu—shen(InstitutionofBrewingScience,Shanghai,200237,China)Abstract:Aspergillusoryzaeisappliedtobrewsoyinourcountry.Kojimakingis animportantstepinsoyproduction.Inthispaper,theeffectsofwater,temperature,air,moisture,environmentongrowthofAspergillusoryz aeandenzymeactivityWerediscussed.Theimpo~anceof enhancingthemanagementofkojimakingandoptimizingthetechniquewereal soadvocated.Keywords:moisture;temperature;enzymeactivity;managementofkojimakin g制曲是我国传统技术,谚语:一曲,二醪,三熬油.说明制曲的重要性.古时称麴蘖,黄麈,黄衣,即由自然界野生曲霉菌在原料中生长繁殖制成的曲子.目前国内酱油酿造主要选用纯种米曲霉,以适宜的条件保证米曲霉等有益微生物生长繁殖,以优化条件使米曲霉分泌产生所需要的各种酶系,达到优质高产的目的.1制曲方法的演化酿造微生物大都是好气性的,为了适应曲霉菌的呼吸,散热,恒温等条件,一直沿用固态浅盘法制曲,如帘子,竹匾,木盘等,设备简单,劳动条件差,占厂房面积大,目前仅在农村小型企业还有存在.白改进为厚层通风制曲工艺后有先进的圆盘制曲及平面型通风制曲,实现了机械化制曲.国内厚层制曲的料层一般为25cm-30cm.风机选择中,低压离心通风机,全风压80mmH20～142mmH20,风量(ms/h)为总原料的4～5倍,如曲池总投原料1500kg,则风机的风量需为6000m/h-7500m3/h,可选择4—72—11,6通风机.2制曲的水分与质量关系微生物生长必需有适量的水.水是细胞组成部分,也是细胞吸收营养物质和排泄代谢产物的介质:微生物酶的活性也随着水分的增加而提高.此外由于水的比热高,是细胞散热的良好导体,调节细胞温度.因此水是微生物生命活动的主要成分.各类微生物对水分要求各不相同.然而微生物对水的可利用性不单纯是水分含量.在基质中存在的水分能被微生物生长利用的水分,称水分活性.表示水分活性就是水溶性的蒸气压与同温度纯水蒸气压的比值.即水在反应中的效力以Aw表示.Aw与溶液蒸气压有关,可测量蒸气中相对湿度的方法估算,例~tNAw为0.75相当于75%的相对湿度. 因此水分活性又可表示为:Aw=RH/100式中:RH为相对湿度.各种微生物都有一定的最适水分活性要求,当水分活性偏离最适要求时,微生物生长就受到抑制.曲霉的水分活性0.80～0.88;毛霉,根霉水分活性大于曲霉为0.92;一般细菌水分活性为0.92～0.97:酵母的水分活性0.88--0.94;耐盐鲁氏酵母为0.60;嗜盐细菌为0.75.从水分活性可知过高的水分有利毛霉,根霉及细菌生长.从生产实践中可知制曲水分对产品质量的有着很大的影响(见表1).收稿日期:2007.01.12作者简介:林祖申(1932.),男,浙江海盐人,高级工程师,主要从事酿造微生物,酱油工艺及调味品的研究工作.创新与借鉴中国酿造2007年第5期总第170期?57?表1制曲水分对成曲和酱油质量的影响Table1.Effectsonqualityofmaturekojiandsoybywater豆粕润水量熟料成曲细酱油质量/(g?lOOmL)水分/菌数%比例全氮游离氨澄清度成率/%慢日厦从表1可看出,随着制曲水分的增高,细菌总数也随着升高,氨基酸生成率也同步提高,54.5%水分酱油出现细菌性浑浊,42.5%水分蛋白变性不完全呈N性蛋白.以51%为宜.目前生产企业一般掌握在47o/50%.但也要视原料配比和制曲设备的保湿条件及气候条件适当上下浮动.如原料配比中麸皮比例较多时水分可略低些;制曲设备保湿条件好,水分略低些;冬季水分不易散发,夏季气候干燥水分略作浮动.3原料配比与制曲质量的关系酱油生产原料配比各异,北方地区常以豆粕:麸皮=70:30或60:40;南方地区以豆粕:小麦:麸皮=100:30~40: 10～20;日本工艺豆粕./J,麦=100:100;有些企业豆粕:面粉:麸皮=100:30:20;也有以豆粕与麸皮制曲;面粉或小麦单独制曲,最后混合发酵.笔者以为适量的麸皮有利于制曲和酶活力的提高;适当提高淀粉原料制曲增加微生物营养,有利于菌丝生长粗壮浓厚,经研究表明曲霉中肽酶和谷氨酰胺酶都是孢内酶,菌体内比菌体外高10 倍,而且菌体富含蛋白质和核酸,有利产品氨基酸的提高, 增加酱油鲜味.淀粉的六碳糖又能改善酱油的色泽红褐及光亮度,而且能被酵母利用发酵,产生风味物质.4温度与制曲关系制曲中温度,空气,湿度,以温度为中心.温度是制曲的技术关键,米曲霉在制曲过程中对温度管理分3个阶段:接种,生长,产酶.4.1接种温度要求40℃以下,理想的接种温度进入曲池后品温在(32±2)℃.米曲霉孢子虽较耐热但在接种温度76℃～80℃下lOmin便死亡.而芽孢杆菌能耐热100℃,所以较高接种温度易于污染细菌致使制曲失败.不同接种温度保持5min后放在平皿中28c《=培养,结果见表2.表2不同接种温度后28%培养18h曲料生长情况Table2.EffectsongrowthofAspergillusoryzaebyinoculation temperature注:”+”生长不好,”++”生长略好,”+++”生长良好.表3不同水分,培养温度,制曲时间的曲料酶活力(干基)比较parisonofenzymeactivityondifferentwater,temperatureandtheti meofkojimaking32h36h中酶,zk~-/%中酶,%祧20O7NO.5?58?SerialNo.170ChinaBrewingIru1ov{nionandKnow1edgeTransfer 4.2米曲霉的生长温度孢子发芽和菌丝繁殖30cI二～35cI二是米曲霉的最适温度,温度过低或过高都会影响发芽和生长速度,低于28cI二孢子发芽缓慢,对低温型微球菌,青霉,毛霉菌等杂菌容易生长.所以低温制曲要有纯净的环境为条件,否则容易污染杂菌.高于35~C枯草芽孢杆菌,根霉等耐高热性微生物容易生长繁殖,产生氨味,使曲料发黏,吐水.4.3产酶旺盛期的温度一般在翻曲之后菌丝大量繁殖,顶囊形成分子孢子开始着生,制曲时间在16h~18h后为产酶高峰期,要求低温制曲(见表3)品温28cI二～32cI二.从表3可以看出, 制曲水分与低温制曲对酶活力的影响.相同水分在低温条件下主要酶都有明显提高,相同温度条件下高水分酶活力明显高于低水分.沪酿3.042米曲霉的制曲条件与国外报道的低温制曲有利于酶的形成趋势是相似的.沪酿3.042制曲时间约在30h(见附图).但要视原料配比,水分高低,制曲条件而确定.如麸皮含量多,水分大,制曲温度偏低,制曲时间适当延长.现在国内对沪酿3.042米曲霉制曲时间大致分1d曲或2d曲.1d曲为30h左右;2d曲为36h-42h.=:=纂白酶:麟霎丞酶避+糖化酶至_r维系孵一碱性蛋白酶,,龉垛蓠霎避蜒蔷避髻附图制曲时间对酶活力的影响Attachedfigure.Relationsofdifferentenzymeactivityandthe timeofkojimaking5制曲管理曲料进箱完毕,要求立即通风调节料温,使品温均匀为30~C～32~C.如果是浅盘制曲只需要调节好室温和品温.厚层制曲还要通风调节温度.温度,空气,湿度是制曲管理的3大要素.以温度为中心.米曲霉的最适生长温度30cI二～35cI二,25cI二以下生长缓慢,40cI二以上生长困难.产酶的最适温度(30±2)cI二.米曲霉是好气性的菌株,曲霉的孢子吸收营养在4h-5h开始发芽,在发芽期本身不产生热量,需要外界保温,保持室温28cI二～30℃,品温30℃～32cI二,并首次通风数秒钟.提供少量空气有利于孢子发芽.随着菌丝生长,产生呼吸热和分解热,品温逐渐上升为35cI二～36cI二需要通入间断循环风即利用曲室内空气循环通风,既保持温度又保持湿度.接着菌丝大量繁殖产生大量热能.在制曲过程中米曲霉边生长边产酶分解蛋白质和淀粉质作为养料,部分糖分分解成CO和H2O,同时放出大量的热供培养所需的能量,大部分多余热量散发掉.由于自然热量的上升,由间断通风至连续通风.米曲霉分解淀粉并耗糖的反应式:(C6HIo05)+nH2O-÷nC6Hl206C6Hl206+602---~6CO2+6H20+738千卡热量当曲料白色菌丝布满结成块状,空气不易穿透,上下层温差加大时需翻曲1次,使曲料疏松,上下层温度均匀.此时菌丝大量繁殖热量很大,加强巡视,防止烧曲.为维持要求的品温,可适当补充室外新鲜空气,排除部分二氧化碳,调节温度.再经4h~6h,随着水分蒸发曲料开始收缩,发生裂缝,引起品温不均匀,需翻第2次曲,保证曲温均匀.一般在l6h以后是产酶旺盛期,也是顶囊和分生孢子形成期,必须掌握低温制曲,保持品温(30±2)cI二.20h以后品温逐渐下降,曲料水分散发而收缩出现跑风现象,可用铁铲以倾斜角度每隔2cm~3cm 从曲料上一铲到底,经铲曲后通风均匀.但铲曲颇费劳力,也可用机械翻3次曲代替铲曲.3次翻曲后逐渐排除室内潮湿空气(称排潮).整个制曲时f~30h左右.也有2d 曲36h~42h,视设备条件而定.制曲过程中湿度管理除了原料含有充沛的水分之外,在制曲前期0h~20h要保持曲室的湿度,湿度高有利于曲霉生长和酶的产生.特别是通风制曲水分易挥发, 通风干燥常会出现干皮,菌丝稀少,曲料似黄沙,酶活力低等缺点.在不同湿度条件下对蛋白酶活力的影响见表4.表4不同相对湿度对蛋白酶活力的影响Table4.Proteinaseactivityondifferentmoisture在夏季气候干燥条件下,要适当提高制曲水分.现在有些企业采用保湿条件好的圆盘制曲机或平面制曲机”加盖”保温,或在进风处设空调设备或在大曲房内创新与借鉴中国酿造2007年第5期总第170期?59?套小曲房有隔热保湿作用,形成良好的小气候.6成曲质量6.1感官鉴定手感曲料疏松柔软,具有弹性外观菌丝丰满粗壮,密生嫩黄色的孢子,无杂菌,无夹心,具有曲子特有香气,无霉臭及其他异昧.6.2理化指标水分(1d曲)30%～36%,(2d曲)26%-32%;福林法中性蛋白酶lO00U/g~上;成曲细菌数50x10个/g以下. 7制曲注意事项蒸料水分不低于46%,不高于51%.种曲孢子多,杂菌少,新鲜孢子发芽率高,符合种曲标准.接种要求均匀,接种后品温迅速调为30℃32℃,接种量为总原料的0.33%～0.4%,曲精0.3%～0.4%.熟原料接触的工具,竹箩,绞龙,输送带,曲池均须每次工毕清洁干净,保持卫生.特别是气流输送设备更需注意管道积料和卫生问题.制曲前期品温30℃～35℃,后期品温28℃～32℃.曲池内品温差距要缩小,不得超过2~C～3℃.8制曲中常见的污染菌8.1细菌微球菌(Micrococcus)是制曲污染的主要细菌.在低温,高湿通气量大的条件下极易生长,常在制曲初期污染,产生弱酸,使成曲pH值略有下降,少量污染能抑制枯草杆菌,大量污染造成酱油混浊及沉淀增多.粪链球菌(Screptococcusfaecalis)在高温,高湿通气不良条件下易生长,制曲前期繁殖快,产酸,少量污染能抑制枯草杆菌,污染过多影响曲霉的生长.枯草杆菌(Bacillussubtilis)是制曲污染有害菌的代表,在高温37oC~40~C,高湿通风条件好生长极快,消耗原料中的蛋白质和淀粉,产生刺鼻的氨昧,使成曲发黏吐水有异臭,手感黏糊.它具有芽孢,耐高温,不易杀灭. 8.2霉菌毛霉:菌丝呈白色,似兔毛,在低温高湿的条件容易生长,少量污染影响不大.根霉:菌丝呈白色,似蜘蛛网状,在高湿条件下易生长,有一定的糖化酶活力,少量污染影响不大.’青霉:菌丝呈灰色,孢子呈青色,在低温高湿条件下易生长.该菌生长较慢,污染后影响酱油风味.8.3酵母成曲中除了有益的鲁氏酵母,球拟酵母能增加酱油风味之外,还有有害的酵母如毕赤氏酵母,醭酵母在酱油液面形成醭(生白或霉花)消耗酱油中成分,影响酱油风味.有害酵母在低温,高湿,通风条件好时易生长,如江南霉雨季节(黄梅天)极易污染.被污染的成曲不酸不臭,色泽仍如熟原料一样.只要延长制曲时间米曲霉后来居上仍可挽回损失,但以不酸曲为前提. 9总结制曲技术决窍的5句话制曲决窍:一熟,二大,三低,四均匀,五清洁.一熟:要求原料蒸熟,达到蛋白质适度变性.二大:大水分,大风量制曲.在制好曲的前提下加大熟料水分.大风量有利好气性曲霉生长,防止嫌气性细菌繁殖.三低:接种进料温度低,制曲品温低,进风温度低.四均匀:生原料润水均匀,熟料接种均匀,装曲池疏松均匀, 曲料厚薄均匀.五清洁:曲室清洁,制曲工具清洁,接种器具清洁,熟料输送设备清洁,周围环境清洁.。

米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究_马俊阳

微生物学通报Jan. 20, 2014, 41(1): 83−89 Microbiology China© 2014 by Institute of Microbiology, CAStongbao@DOI: 10.13344/j.microbiol.china.130068基金项目：浙江省重大科技专项计划项目(No. 2012C12004-3)*通讯作者：Tel: 86-510-85918150; : bzhuge@收稿日期：2013-01-27；接受日期：2013-04-09；优先数字出版日期()：2013-10-11 研究报告米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究马俊阳1诸葛斌1*方慧英1宗红1孙进2龚星慧2诸葛健1楼笑笑2冯倩2(1. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室工业微生物研究中心江苏无锡 214122)(2. 浙江正味食品有限公司浙江省调味食品制造工程技术研究中心浙江义乌 322000)摘要：【目的】获得米曲霉蛋白酶主要成分及其酶学性质。

【方法】利用硫酸铵盐析，DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Superdex-G75/200凝胶层析对米曲霉所产蛋白酶系进行分离纯化，SDS-PAGE检测蛋白酶纯度和分子量，采用高效液相凝胶色谱分析两种蛋白酶酶解产物。

【结果】从米曲霉所产蛋白酶系中分离纯化获得两种蛋白酶组分P1和P2，分子质量分别约为37 kD和45 kD。

以酪蛋白为底物时，P1的K m=8.36 g/L，V m=12.95 μg/(mL·min)，最适反应条件为pH 8.0、45 °C；P2的K m=4.11 g/L，V m=4.86 μg/(mL·min)，最适反应条件为pH 7.0、45 °C。

两种蛋白酶均对酪蛋白水解活性最高，而对牛血清蛋白的水解活性很低。

P1和P2分别酶解大豆分离蛋白后水解产物中肽分子质量分布呈现出一定的差异。

蛋白酶活性电泳实验

蛋白酶活性电泳活性电泳(明胶酶谱法)一、实验原理明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。

通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。

通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。

二、材料与方法1试剂与溶液配制1.1试剂和仪器：酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2·2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5×蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。

水为去离子水或超纯水。

主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等1.2溶液配制1.2.1 5×SDS-PAGE电泳缓冲液配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。

使用时用去离子水稀释至1×，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。

米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042内切型纤维素酶的分离纯化与鉴定

米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042内切型纤维素酶的分离纯化与鉴定武金霞;常淑英;孙鹏;张永阔;张贺迎【摘要】The crude enzyme solution from Aspergillus oryzae Huniang 3. 042 mature Koji was extrac ted for the purpose of revealing the roles of cellulases in the process of material decomposing, and the ac tivity of exocellulase , endocellulase and β-glucosidase was analyzed by DNS method . Four Cx enzymes were identified by Congo red staining, called as Cx enzyme Ⅰ , Cx enzyme Ⅱ , Cx enzyme Ⅲ and Cx en zyme Ⅳ respectively in this article. DEAE-Cellulose-52 ion exchange chromatography was used to primari ly separate endocellulases in the crude enzyme solution, it was found that the elution peak of 0. 15 , 0. 20 , 0. 25, 0. 30 mol/L NaCl contained the active components. Then, four purified Cx enzymes were obtained by preparative electrophoresis. First three Cx enzymes were monomeric enzyme and their molecular mass were 31 800,34 000, 26 000 u respectively determined by SDS-PAGE, the last one contained four subunits ,and their molecular mass were 14 000,23 600,26 000,33 500 u respectivly. The optimal temperature of en docellulases in the crude enzyme solution was 50 ℃,and the optimal pH was 4. 0.%为了解米曲霉纤维素酶在物料分解过程中的作用,从米曲霉沪酿3.042成曲中提取粗酶液,利用DNS法分析了粗酶液中外切酶、内切酶及β-葡萄糖苷酶的活力.用刚果红染色法确定了沪酿3.042成曲粗酶液中含有4种内切型纤维素酶,分别称为Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ和Cx酶Ⅳ.经DEAE-Cellulose-52离子交换层析,0.15,0.20,0.25,0.30 mol/L NaCl洗脱峰均测得内切型纤维素酶活性,制备电泳纯化得到4个内切型纤维素酶组分,SDS-PAGE结果显示,Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ为单体酶,分子质量分别为31 800,34 000,26 000 u,Cx酶jV含有4个亚基,分子质量分别为14 000,23 600,26 000,33 500 u.粗酶液中内切型纤维素酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为4.0.【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(032)001【总页数】7页(P68-74)【关键词】米曲霉;内切型纤维素酶;刚果红染色;离子交换层析;制备电泳【作者】武金霞;常淑英;孙鹏;张永阔;张贺迎【作者单位】河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生物技术研究中心,河北保定071002【正文语种】中文【中图分类】Q814.1;Q556.2米曲霉是一种丝状真菌，因其生长过程中能够产生丰富的水解酶系，被广泛应用于食品、饲料、酿酒等行业[1].米曲霉沪酿3.042是应用于国内酱油酿造行业的主要菌株之一，其生长环境粗放，适应性强，生产纤维素酶产量高，稳定性好，而且其产生的纤维素酶是胞外酶，发酵完成后，纤维素酶容易与菌体分离纯化得到所需的酶.纤维素酶(cellulase)是分解纤维素的一类酶, 包括内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase，EC3.2.1.21)[2-3]，这些酶组分协同作用将纤维素分解为葡萄糖.在酿造过程中纤维素酶可以分解物料细胞壁,增加细胞内含物的溶出，有利于蛋白酶充分作用于大豆蛋白，从而提高原料的利用率和氨基酸态氮生成率[4].有报道酱油生产中添加纤维素酶或提高菌株的纤维素酶活力，有利于提高酱油质量和出油率[5].本实验室曾初步以刚果红染色法检测出米曲霉3.042含有2种内切型纤维素酶组分[6]，本研究拟进一步鉴定并纯化米曲霉沪酿3.042菌株的内切型纤维素酶组分，研究其酶学性质，为进一步了解纤维素酶在酿造过程中的具体作用，以及与其他酶的协同机制提供理论基础.1.1 材料1.1.1 菌种米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042(本实验室保藏).1.1.2 培养基m(豆粕)∶m(麸皮)∶m(水)=6∶4∶10.1.1.3 主要实验仪器HWS型智能恒温恒湿箱(宁波东南仪器有限公司)，SH-5磁力搅拌器(BeiDe)，GL 20A高速冷冻离心机(中国湘西仪器厂)，数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)，BG-Power 600电泳仪(BAYGENE)， 721型分光光度计(上海第三分析仪器厂).1.2 方法1.2.1 米曲霉纤维素酶粗酶液的制备称取5 g成曲，充分研磨后加20 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)，磁力搅拌15 min，4 ℃ ，10 000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液，分装后放置于-20 ℃冰箱备用.1.2.2 葡萄糖标准曲线制作采用DNS法[7]制作葡萄糖标准曲线.1.2.3 粗酶液纤维素酶的酶活测定1.2.3.1 内切型纤维素酶活力测定将粗酶液稀释10倍，取3支刻度试管，分别加入0.1 mL稀释酶液，再分别吸取1.9 mL 10 g/L的羧甲基纤维素钠(CMC)(pH 5.0，0.05 mol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制)溶液，50 ℃水浴保温30 min；空白样用煮沸灭活的稀释酶液 0.1 mL 代替样品，同样50 ℃水浴保温30 min.再吸取DNS试剂2 mL，充分摇匀后具塞，沸水浴反应10 min,冷却至室温后用去离子水定容至15 mL，上下摇匀，用空白调零点，于550 nm 下测定OD值.根据标准曲线求出对应葡萄糖产量，计算出粗酶液中内切型纤维素酶活力(U/mL).每小时由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(U).计算公式：A:OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量(mg)；D:酶液的稀释倍数；t:反应时间(min).1.2.3.2 外切型纤维素酶活力测定采用DNS法，以脱脂棉为底物[8].1.2.3.3 β-葡萄糖苷酶活力测定采用DNS法，以水杨素为底物[9].1.2.4 蛋白质含量测定采用Folin-酚法[10]测定蛋白质含量，以标准酪蛋白溶液做标准曲线.1.2.5 PAGE检测粗酶液中蛋白质组成浓缩胶质量浓度为45 g/L，分离胶质量浓度为100 g/L，浓缩胶电压120 V，分离胶电压150 V，室温电泳结束后考马斯亮蓝染色15 min，用体积分数为7.0%的冰乙酸脱色至条带清晰.1.2.6 CMC-PAGE检测粗酶液中内切型纤维素酶组分参照文献[6]稍做改进.配制质量浓度为100 g/L的PAGE分离胶，加入1 g/LCMC溶液(pH 5.0 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制)0.4 mL，再配制质量浓度为45 g/L的浓缩胶，用不同浓度粗酶液点样，浓缩胶120 V，分离胶150 V，4 ℃低温电泳.电泳结束后，将胶切成2部分，一部分考马斯亮蓝染色，另一部分置于50 ℃预热的0.1 g/L刚果红染色液(用0.05 mol/L pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制)中，50 ℃恒温水浴3 h后移至1 mol/L NaCl脱色液中，常温脱色至条带清晰.1.2.7 DEAE-Cellulose-52离子交换层析初步分离内切型纤维素酶将DEAE-Cellulose-52离子交换柱用pH 7.2，0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液充分平衡后，取10 mL粗酶液上样，然后以NaCl浓度依次为0.10，0.15，0.20，0.25，0.30,0.35,0.40，0.60 mol/L的pH 7.2，0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液进行分步洗脱(3.5 mL/min).收集各洗脱峰，将各洗脱峰透析、浓缩后以天然-PAGE电泳检测蛋白组分[11].1.2.8 制备电泳分离纯化内切型纤维素酶组分参照刚果红染色图谱切胶，95 W,30 V,25 mA进行回收电泳[12].将所得的酶组分进行酶活力和分子质量测定.酶活力测定过程中，将回收的纯酶冻干浓缩成酶粉后加入100 μL蒸馏水溶解，作为稀释酶液，空白样加入蒸馏水，其余操作同1.2.3.1.1.2.9 粗酶液中内切型纤维素酶最适反应温度和最适反应pH值的测定配制含有10 g/L CMC的0.05 mol/L，pH 5.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，测定20～80 ℃内切型纤维素酶的最适反应温度；配制含有10 g/L CMC的0.05 mol/L，pH 3.0～8.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，测定50 ℃时内切型纤维素酶的最适反应pH值[8].2.1 米曲霉3.042纤维素酶分泌曲线图1显示，制曲时间为35 h时内切型纤维素酶酶活最高，此时粗酶液蛋白质质量浓度为19.26 mg/mL,纤维素酶系中不同酶组分的酶活力如表1.2.2 刚果红染色法鉴定内切型纤维素酶组分配制PAGE分离胶时加入内切型纤维素酶的底物CMC，使其均匀分布在胶内，电泳结束后经过水浴，如果样品液中含有内切型纤维素酶则会将CMC长链的纤维素分子降解为纤维寡糖, 刚果红能将长链的纤维素分子染成红色,却不能将纤维寡糖染色，因此水浴后的凝胶经刚果红染色后未着色的透明区域即为内切型纤维素酶的位置.由图2 a和图2 b可知，分离胶内添加一定质量的CMC，会造成各个蛋白条带的相对迁移率都减小，但各个条带的相对位置不变.由图2 c 可知，米曲霉沪酿3.042成曲浸提液含有4个内切型纤维素酶组分，分别称为Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ 和Cx酶Ⅳ，从透明区带的范围初步认为Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ具有较高的活力，而Cx酶Ⅰ和Cx酶Ⅳ活力较低.2.3 DEAE-Cellulose-52离子交换层析用DEAE-Cellulose-52离子交换层析初步分离米曲霉粗酶液，280 nm下核酸蛋白检测仪测得不同NaCl浓度的pH 7.2，0.01 mol/L的 Tris-HCl缓冲液各洗脱下一个蛋白峰(图 3).经DNS法测定酶活和天然-PAGE电泳检测可知，0.15，0.20，0.25和0.30 mol/L NaCl洗脱下的蛋白峰含有内切型纤维素酶组分(图4 ).其中0.15 mol/L NaCl的洗脱峰含有Cx酶Ⅲ，虽然杂蛋白较多，但迁移率与Cx酶Ⅲ相差较大.0.2 mol/L NaCl浓度下的洗脱峰含有Cx酶Ⅰ，但杂蛋白含量较多.0.25 mol/L NaCl 洗脱峰含有Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅳ3个目标组分，且杂蛋白较少.0.3 mol/L NaCl洗脱峰含有Cx酶Ⅳ，杂蛋白也相对较少.米曲霉粗酶液中蛋白质组分较多，由于一些蛋白质的荷电性质及分子质量相近，导致多条目标条带和其他杂蛋白混杂在一起，仅采用离子交换层析不能有效地将单个纤维素酶组分纯化.因此分别将上述不同NaCl浓度洗脱液冻干浓缩，以制备电泳切胶回收4个内切型纤维素酶组分.2.4 制备电泳分离纯化内切型纤维素酶组分及分子质量测定图5 a和图5 b显示制备电泳纯化的Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ 和Cx酶Ⅳ4个组分，DNS法测定其酶活分别为61.77，6.11，44.93，72.03 U/mL，因此可以确定纯化到的酶组分为目标组分，后经SDS-PAGE 电泳测得Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ的分子质量分别是31 800，34 000 u(图5 c)和26 000 u(图5 d)；Cx酶Ⅳ含有4个亚基，分子质量分别为14 000，23 600，26 000，33 500 u(图5 d).2.5 粗酶液中内切型纤维素酶的最适反应温度和最适反应pH值米曲霉(A.oryzae)沪酿3.042成曲粗酶液中内切型纤维素酶的最适反应温度为50 ℃(图6)，最适反应pH值为4.0(图 7).米曲霉固体发酵产纤维素酶的最佳收获期是35 h,其纤维素酶系中包含有外切型和内切型纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶.经离子交换层析、制备电泳纯化到4个内切型纤维素酶组分.SDS-PAGE结果表明，Cx酶Ⅰ，Cx酶Ⅱ，Cx酶Ⅲ为单体酶，Cx酶Ⅳ为多亚基酶，这种现象可能与不同种类内切纤维素酶的分子组成有关：纤维素酶的各组分大多是糖蛋白，含糖的比例各不相同；糖和蛋白质之间的结合方式也不同，有的是通过共价键连接，有的是可解离的复合物[13-14].在酱醅发酵中，纤维素酶能起到崩溃豆饼、小麦、麸皮中的纤维素及将其分解成糖的作用，我国酱油酿造中多采用低盐固态发酵工艺，发酵温度较高(一般控制在40～45 ℃)，酱醅pH值较低，米曲霉产纤维素酶的最适温度和pH值分别为50 ℃和4.0，这一特性与酱醅发酵条件一致.因此，在酱油制备过程中米曲霉纤维素酶能发挥其最大作用，提高物料的利用率.【相关文献】[1] LIANG Yanchang, 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张贺迎武金霞闰，，博
（．大学生物技术研究中心，１河北河北保定０１Ｏ；．７０２２河北大学生命科学院，河北保定０１０）７０２
摘要：建立了活性电泳分析蛋白酶组分的方法。在制备分离胶时，加入终浓度为Ｏ５．％的ＳＳ１Ｄ和％的酪蛋臼，℃下电泳，．４以２５％
ｒｓｌｓｄｆｅｅｏｔｅｔａｉｉｎａｏｌｄｇｆｓｒｌｕｒｚｅＨｕｎｉｎ０２ｐｒｔａｅ．ｅｕｔｉｆｒｄｆｍｈｄｔｏｌｒｒｋｎｗｅｅｏＡｐｅｇｉｌｓｏｙａ — ａｇ３．４ｏｅｓｓ
Ｋｅｗｏｄ：ｓｙｓｕｅＡｓｒｉｌｓｏｙａｅＨｕｎａ．４２ｐｏｅｓ；ａｔｖｌｃｒｈｒｓｓｙｒｓｏａｃ；ｐｅｇｌｕｒｚ — ｉｎｇ３０；ｒｔａｅｃｉｅｅｅｔｏｐｏｅｉ
ＺＨＡＮＧｅｎｇ，Ｕｉｉ２ＹＡＮＨｙｉＷＪｎｘａ，Ｂｏ
（，ｅｅｒｈＣｎｅｆｒｏｅｈｏｏｙＨｅｅＵｉｅｉ，ａｄｇ０１０，ｈｎ；ｉｓａｃｅｔｏＢｉｔｎｌ，ｂｉｎｖｒｔＢｏｉ７０２ＣｉａＲｒｃｇｓｙｎ２ＣｌｇＬｆｃｎｅＨｅｅｎｖｒｔＢｏｉｇ０１０，ｈｎ）．ｏｅｅｆｉＳｉｃｓｂｉｉｅｓ，ａｄｌｏｅｅ，Ｕｉｙｎ７０２Ｃｉａ
很大的不同。
关
键
词：酱油；曲霉沪酿３０２蛋白酶；米．；４活性电泳文献标识码：Ａ文章编号：２４５７（００１ — １２００５ — ０１２１）２０６ — ３
中图分类号：Ｓ０．Ｔ２１２
ＡｎａｙｉｆｏｅｓｏｌｓｓｏｐｒｔａｅｃｍｐｏｅｓｏｆｐｅｇｌｕｒｚｅＨｕ－ａｇ３４２ｍａｔｅｅｅｔｏｈｒｓｓｎｎｔＡｓｒｉｌｓｏｙａｎｉｎ０ｃｉｌｃｒｐｏｅｉｖ
ＴｒｔｎＸ１０ａｄｃｌｉｇｔｅｇｌｉｉｅｅｔｐｂｆｅ．ＳｖｎｐｏｅｓｏｐｎｅｓｃｕｄｂｅｅｔｄｆｏＡｓｒｌｕｒｚｅＨｕ— ａｇ３０２ｂｉｏ — ０ｎｕｔｎｈｅｎｄｆｒｎＨｕｒｅｅｒｔａｅｃｍｏｎｔｏｌｅｄｔｃｅｒｍｐｅｇｉｓｏｙａｎｉｎ．ｙｕｒｌ４ｈｓｍｔｄ．ｌｈｅｓｖｎｏｏｎｓｗｅｅａｔｖｄｒｎｕｒｌｐｖａｕｅａｄｔｅｆｔｍａｅｈｇｃｉｙｕｄｒａｉｃｐｖｌｅ，ｓｗｅ１ＴｈｅｔｉｅｏＡｌｔｅｅｃｍｐｎｅｔｒｃｉｅｕｎｅｅｔａＨｌ，ｎｒｅｏｅｈｖｉｈａｔｔｎｅｃｄｉＨａｕａｌ．ｈｈｈｖｉ
酱油生产的生物化学过程主要是蛋白质分解成小分子肽类和氨基酸的过程，白酶在其中起主要作用＿蛋ｌｌ。在
酿造行业，遍认为与酱油生产相关的蛋白酶有碱性、普中
１材料和方法１实验材料．１菌种：曲霉（ｓｅｉｕｌｚｅ沪酿３０２（实验米Ａｐｒｌｓｙａ）ｇｌＯ．４本室保藏）。
Ａｂｓｒｃ：ｍｅｈｏｎａｙｉｆｐｏｅｓｏｔａｔＡｔｏｄｆｒａｌｓｓｏｒｔａｅｃｍｐｏｅｔｆａｔｅｅｅｔｏｈｏｅｉｓｅｔｂｉｈｄＣｌａｙｏｒｐｙｃｌｂｅｖｄｂｙｔｏｃ — ｎｎｓｏｃｉｌｃｒｐｒｓｓｗａｓａｌｓｅ．ｅｒｚｍｇａｈｏｕｄｂｅｏｓｒｅｐｒｅｖｈｅ
ｄｕｅｓｆｌｏ：Ｏ５ＳＳａｄ１ｃｓｉｓａｄｅｎｒｓｌｉｅ．ｕｎｉｇｅｅｔｏｏｅｉｓｃｒｉｄｏｎｄｒ４￣ｅｒｓａｏｌｗｓ．％Ｄｎ％ａｅｎｗａｄｄｉｅｏｖｎｇｇ１ｒｎｎｌｃｒｐｈｒｓｓｗａａｒｅｕｔｕｅＣ．ｒｍｏｖｎｉｇＳＤＳｗｉ５ｔ２．％ｈ
ＴｉｎＸ１０去Ｓ，ｒｏ— ０洗ｔＤＳ在不间条件卜浴，温可得到清晰的蛋白酶谱。采用该方法在沪酿３４的成曲浸提液中检ＮＮ７蛋白酶组分，．２０种这些组分在ｐＨ中性条件下都有活性，中３蛋白酶在ｐ酸性条件下仍然有很强的活性。些发现与对米曲霉蛋白酶的传统认识有其种Ｈ这
・
１２Ｓｒｌｏ２・６ｅｉ．５ａＮ２
２０Ｎ０１０１．２
ＣｈｎｅｎｉａＢｒｗｉｇ
ＡａｙｉａｄｘｍｉａｏｎｌｓａｎｔｎｓｎＥｉ
活性电泳分析米曲霉沪酿３０２白酶组分．蛋４