产油微藻基因组编辑技术研究进展
藻类油脂生产的研究现状与进展
藻类油脂生产的研究现状与进展随着人口的不断增长和经济的快速发展，能源问题变得越来越严峻，而化石能源的慢慢枯竭和环境污染使得新能源的发展成为全球的趋势。
其中，藻类油脂作为一种环保、可再生、高效的生物燃料，越来越受到研究者的关注。
本文将就藻类油脂生产的研究现状与进展进行讨论。
一、藻类油脂概述藻类是一种具有高效光合作用的微生物，其中大多数藻类都可以进行光合作用过程，将太阳能转化为生物能。
其中一部分藻类可以在特定的生长条件下产生高含量的油脂，并且这些油脂可以作为生物燃料的主要来源。
相较于传统的生物燃料，藻类油脂具有以下优点：1. 油脂含量高：部分藻类的油脂含量可以达到50%以上。
2. 可再生性强：藻类的生长速度很快，是传统农作物的几倍甚至几十倍。
3. 环保：藻类生长需要的二氧化碳可以回收和利用，还可以减少二氧化碳的排放；而且藻类油脂燃烧产生的二氧化碳与藻类生长需要的二氧化碳相当，其实现了零排放。
二、藻类油脂生产的技术路线藻类油脂生产的技术路线包括以下几个步骤：藻类选育、大规模培养、收获和提取。
不同的藻类、不同的生产规模、不同的培养条件下，技术路线可能会有所区别。
近年来，藻类油脂生产的技术路线不断优化，引入了新的技术与方法，以提高生产效率和降低成本。
针对藻类油脂生产的技术路线，以下就几个关键问题进行分析：1. 藻类选育目前，国内外的研究机构都在大规模筛选藻类种质资源，并进行选育。
其主要以高含油量和适应性强的藻类为发展方向，如银耳藻、中肋角龙胆藻、衣藻、小球藻等。
2. 大规模培养大规模培养是实现藻类油脂商业化生产的重要环节。
通常采用的培养方式有开放式和封闭式两种。
开放式的培养方式成本较低，但对水资源、肥料、污染、温度变化等因素的适应能力较差。
封闭式的培养方式可以实现环境条件的控制，但成本较高，且由于水体的冷却和光线照射等因素影响，藻类生长速度慢。
目前大规模培养一般采用的是混合培养方式，即在培养池中混合不同藻类，并加入不同的有机物和肥料，以避免出现物种死亡甚至坏死的情况。
新型基因编辑技术在单细胞微藻中的应用进展
生物技术进展２０２１年㊀第１１卷㊀第１期㊀９~１５ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０２０￣０８￣１０ꎻ接受日期:２０２０￣１０￣２１㊀基金项目:河北省科技厅重点研发项目(１８２７３６１２Ｄ)ꎻ河北省高等学校科学技术研究项目(ＺＤ２０１７２３０)ꎻ石家庄市科学技术研究与发展计划项目(１９１２４０２４３Ａ)ꎻ河北经贸大学校内科研项目(２０１５ＫＹＺ０１)ꎮ㊀联系方式:曹豪豪Ｅ￣ｍａｉｌ:２９４２２４６０４９＠ｑｑ.ｃｏｍꎻ∗通信作者张红兵Ｅ￣ｍａｉｌ:３３５４４９２６４＠ｑｑ.ｃｏｍ新型基因编辑技术在单细胞微藻中的应用进展曹豪豪１ꎬ㊀张红兵１∗ꎬ㊀薛溪发１ꎬ㊀李左群２ꎬ㊀闫洪波１ꎬ㊀李会宣１１.河北经贸大学生物科学与工程学院ꎬ石家庄０５００６１ꎻ２.河北德诺商品检测技术服务有限公司ꎬ石家庄０５００６１摘㊀要:微藻作为单细胞生物ꎬ广泛分布于海洋和淡水湖泊ꎬ由于其在生长过程中能在细胞内大量积累生物质ꎬ被应用于生物能源和高价值产品的生产ꎮ虽然微藻具有巨大潜力ꎬ但在现有研究中低脂质率等瓶颈问题仍未得到解决ꎮ近年来ꎬ基因工程技术尤其是新型基因编辑技术发展迅猛ꎬ基因组编辑技术快速㊁有效ꎬ有利于充分了解微藻的遗传和分子生物学信息ꎬ因此将其应用于微藻成为微藻基因工程和生物工程的热点领域ꎬ受到广泛关注ꎮ基于此ꎬ简要介绍了锌指核酸酶(ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅꎬＺＦＮ)㊁转录激活物样效应因子核酸酶(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ￣ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅꎬＴＡＬＥＮ)和簇状规则间隔的短回文重复序列(ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓꎬＣＲＩＳＰＲ)/Ｃａｓ(ＣＲＩＳＰＲ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｙｓｔｅｍｓ)核酸酶系统等新型基因编辑技术ꎬ综述了上述技术在微藻中的应用进展ꎬ并对微藻基因编辑进行了展望ꎬ以期为深入了解和解决与微藻基因编辑有关的问题提供参考ꎮ关键词:基因编辑ꎻ微藻ꎻＺＦＮꎻＴＡＬＥＮꎻＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２０.００９０中图分类号:Ｑ８１２ꎬＱ９３９.９７㊀㊀㊀文献标识码:ＡＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＮｅｗＧｅｎｅＥｄｉｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＭｉｃｒｏａｌｇａｅＣＡＯＨａｏｈａｏ１ꎬＺＨＡＮＧＨｏｎｇｂｉｎｇ１∗ꎬＸＵＥＸｉｆａ１ꎬＬＩＺｕｏｑｕｎ２ꎬＹＡＮＨｏｎｇｂｏ１ꎬＬＩＨｕｉｘｕａｎ１１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＨｅｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＥｃｏｎｏｍｉｃｓａｎｄＢｕｓｉｎｅｓｓꎬＳｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００６１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＨｅｂｅｉＤｅｎｕｏＣｏｍｍｏｄｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｅｒｖｉｃｅＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＳｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００６１ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅꎬａｓｓｉｎｇｌｅ￣ｃｅｌｌｅｄｏｒｇａｎｉｓｍｓꎬａｒｅｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｏｃｅａｎｓａｎｄｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｌａｋｅｓ.Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅａｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏｅｎｅｒｇｙａｎｄｈｉｇｈ￣ｖａｌｕｅｐｒｏｄｕｃｔｓｂｅｃａｕｓｅｔｈｅｙｃａｎａｃｃｕｍｕｌａｔｅａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｂｉｏｍａｓｓｉｎｃｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｉｒｇｒｏｗｔｈ.Ａｌｔｈｏｕｇｈｍｉｃｒｏａｌｇａｅｈａｖｅｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌꎬｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓｓｕｃｈａｓｌｏｗｌｉｐｉｄｒａｔｅｈａｖｅｎｏｔｂｅｅｎｓｏｌｖｅｄｉｎｅｘｉｓｔｉｎｇｒｅｓｅａｒｃｈ.Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｎｅｗｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬｈａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｒａｐｉｄｌｙꎬａｎｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｆａｓｔａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅꎬｗｈｉｃｈｉｓｃｏｎｄｕｃｉｖｅｔｏｆｕｌｌｙｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏａｌｇａｅ.Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｒｏａｌｇａｅｈａｓｂｅｃｏｍｅａｈｏｔｆｉｅｌｄｉｎｍｉｃｒｏａｌｇａｅｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬａｎｄｈａｓａｔｔｒａｃｔｅｄｅｘｔｅｎｓｉｖｅａｔｔｅｎｔｉｏｎ.Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｉｓꎬｓｅｖｅｒａｌｎｅｗｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｓｕｃｈａｓｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ(ＺＦＮ)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ￣ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅ(ＴＡＬＥＮ)ａｎｄｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ(ＣＲＩＳＰＲ)/ＣＡＳ(ＣＲＩＳＰＲ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｙｓｔｅｍｓ)ｎｕｃｌｅａｓｅｓｙｓｔｅｍꎬｅｔｃꎬｗｅｒｅｂｒｉｅｆｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ.Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｔｈｅｓｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｍｉｃｒｏａｌｇａｅｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆｍｉｃｒｏａｌｇａｅｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｗａｓｍａｄｅꎬｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇａｎｄｓｏｌｖｉｎｇｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｉｃｒｏａｌｇａｅｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇꎻｍｉｃｒｏａｌｇａｅꎻＺＦＮꎻＴＡＬＥＮꎻＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９㊀㊀当前化石能源短缺及其应用带来的污染日趋严重ꎬ阻碍了世界经济发展ꎬ研发替代能源势在必行ꎬ生物燃料作为可再生的能源形式潜力巨大ꎬ成为研究焦点[１]ꎮ微藻是自然界中起源最早㊁数量最多㊁分布最广的生物种类ꎬ是含有叶绿素ａ的光合作用微生物ꎮ由于许多种属的微藻在生长过程. All Rights Reserved.中能在细胞内大量积累生物质ꎬ已用于生产沼气㊁乙醇㊁生物柴油㊁生物氢等环保㊁清洁㊁经济的生物燃料ꎬ是化石燃料的理想替代品ꎬ同时利用藻类生物质生产食品和饲料添加剂乃至药物等也引起了广泛关注[２]ꎮ为了充分发挥微藻生产潜力㊁优化生产工艺ꎬ有必要利用分子生物学技术研究微藻的遗传背景ꎬ解决脂质积累率偏低[３]㊁固定二氧化碳效率差[４]㊁培养周期长[５]等瓶颈问题ꎮ由于生物信息学和基因工程技术的迅速发展ꎬ尤其是新型基因编辑技术ꎬ已经成为解决上述问题的重要策略ꎮ其中ꎬ应用最广泛的是ＴＡＬＥＮ和ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９等基因编辑技术ꎬ在哺乳动物㊁植物等中已取得了较好的效果[６]ꎮ基于此ꎬ本文就上述技术在微藻遗传改造方面的应用进行综述ꎬ以期为相关研究提供借鉴ꎮ１㊀基因组编辑技术基因组编辑技术的核心是通过对生物体特定ＤＮＡ片段的插入㊁敲除㊁修饰或替换等手段ꎬ使预期基因组序列发生改变并遗传ꎬ进而实现目标基因的编辑[７]ꎮ该方法不仅可以研究目的基因的功能ꎬ还可以赋予生物体新的生物学特性ꎮ特别是近几年被称为分子剪刀的工程核酸酶ꎬ极大地促进了基因组编辑的发展ꎬ包括锌指核酸酶(ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅꎬＺＦＮ)㊁转录激活物样效应因子核酸酶(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ￣ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅꎬＴＡＬＥＮ)和簇状规则间隔的短回文重复序列(ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓꎬＣＲＩＳＰＲ)/Ｃａｓ(ＣＲＩＳＰＲ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｙｓｔｅｍｓ)核酸酶系统ꎮ１.１㊀ＺＦＮ技术目前应用的ＺＦＮ是一类人工合成的核酸内切酶ꎬ也就是具有特定基因编辑功能的蛋白质ꎬ由３个人工设计的锌指ＤＮＡ结合结构域和１个ＦｏｋⅠ核酸酶结构域组成ꎬ能特异剪切基因组某段ＤＮＡ[８]ꎮＺＦＮ的Ｎ末端是ＤＮＡ的结合域ꎬ一般含３~４个串联的ＣｙｓＨｉｓ２锌指蛋白ꎬ其中每个锌指蛋白能够结合特定靶ＤＮＡ序列中３ｂｐ的片段ꎻＣ末端多为非特异性ＦｏｋⅠ核酸酶结构域ꎬ具有核酸内切酶活性ꎬ能够切割非特异ＤＮＡꎬ切割时ＦｏｋⅠ的催化结构域需要以适当的碱基距离形成异二聚体ꎮ如图１所示ꎬ为了进行有效的二聚化和切割ꎬ２个ＺＦＮ分子以尾对尾方式与相对链上的靶ＤＮＡ结合ꎬ相间隔５~７ｂｐꎬ在此间隔区中可以实现特定ＤＮＡ位点的切割[１０]ꎮ１.２㊀ＴＡＬＥＮ技术ＴＡＬＥＮ的ＤＮＡ结合结构域源自转录激活子样效应物(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ￣ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒꎬＴＡＬＥ)ꎬ该效应物是源于植物病原菌黄单胞菌属(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ)[１１]ꎮ与ＺＦＮ相似ꎬＴＡＬＥＮ也包含２个结构域:Ｎ端为ＤＮＡ特异性识别和结合区域ＴＡＬＥꎬＣ端为与ＺＦＮ相同的ＦｏｋⅠ核酸酶催化结构域ꎮ其中ＴＡＬＥ由Ｎ端转录信号㊁Ｃ端核定位信号㊁转录激活结构域以及ＤＮＡ特异性识别和结合结构域组成ꎮ在ＴＡＬＥ蛋白的转录激活结构域中含有由３４个氨基酸组成的锌指模块同源重复序列ꎬ其中第１２㊁１３位为重复可变的双氨基酸残基(ｒｅｐｅａｔｖａｒｉａｎｔｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓꎬＲＶＤ)ꎮＴＡＬＥ所识别的碱基是由不同的ＲＶＤ所决定的ꎬ其中ＮＩ识别Ａ㊁ＮＧ识别Ｔ㊁ＮＨ识别Ｇ㊁ＮＮ识别Ａ或Ｇ㊁ＨＤ识别Ｃ㊁ＮＳ对４种碱基都可以识别ꎬ因此经过人工编辑ＴＡＬＥ的ＲＶＤꎬ能够识别对应的ＤＮＡ序列ꎮＦｏｋⅠ结构域来自ＦｏｋⅠ核酸酶的末端活性域ꎬ需要二聚化才有活性ꎮ所以ꎬ在基因编辑的过程中需要２个ＴＡＬＥＮ蛋白ꎬ如图２所示ꎬ目标序列的上游与下游由２个ＴＡＬＥ结构域分别识别ꎬ２个ＦｏｋⅠ结构域作用在一段ＤＮＡ上造成双链断裂ꎬ可以在该位点进行插入㊁敲除或点突变等操作[１３￣１５]ꎮ１.３㊀ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ技术ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ系统是在细菌和古细菌中发现的一种获得性免疫系统ꎬ可用来对抗入侵的病毒及外源ＤＮＡ[１６￣１８]ꎮＣＲＩＳＰＲ即成簇的规律间隔短回文重复序列ꎬ而Ｃａｓ即ＣＲＩＳＰＲ相关系统ꎬ位于ＣＲＩＳＰＲ序列的上游ꎬ包含多种功能蛋白基因[１９]ꎮＣＲＩＳＰＲ是其中的靶位点识别组件ꎬＣＲＩＳＰＲ转录生成ＣＲＩＳＰＲ￣ＲＮＡ前体(ｐｒｅ￣ｃｒＲＮＡ)ꎬ随后前体被加工成短的成熟的ＣＲＩＳＰＲ￣ＲＮＡ(ｃｒＲＮＡ)ꎬｃｒＲＮＡ将与靶基因ＤＮＡ通过碱基互补配对进行识别ꎮ切割ＤＮＡ的组件为Ｃａｓ核酸内切酶ꎬＣＲＩＳＰＲ与Ｃａｓ结合形成一种ＲＮＡ￣蛋白质０１生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.的复合体ꎬＲＮＡ特异性识别结合ＤＮＡꎬ并引导Ｃａｓ核酸酶特异性切割ＤＮＡ[２０]ꎮＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ免疫系统可分为ＴｙｐｅⅠ型㊁ＴｙｐｅⅡ型和ＴｙｐｅⅢ型３种类型ꎮ其中Ⅱ型ＣＲＩＳＰＲ系统ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９是目前研究最为充分的系统ꎬ如图３所示ꎬ在ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９系统中ꎬ向图１㊀ＺＦＮ的作用机制[９]Ｆｉｇ.１㊀ＴｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＺＦＮ[９]图２㊀ＴＡＬＥＮ的作用机制[１２]Ｆｉｇ.２㊀ＴｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＴＡＬＥＮ[１２]图３㊀ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９工作机制[２１]Ｆｉｇ.３㊀ＴｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９[２１]１１曹豪豪ꎬ等:新型基因编辑技术在单细胞微藻中的应用进展. All Rights Reserved.导ＲＮＡ(ｇｕｉｄｅＲＮＡꎬｇＲＮＡ)代替了上述ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ两者的作用ꎬ在ｇＲＮＡ的作用下ꎬ识别靶序列的原型间隔区相邻基序(ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆꎬＰＡＭ)位点并引导Ｃａｓ９核酸酶切割靶位点ꎬ通过非同源末端连接或同源重组进行修复以实现基因的敲除与修饰[２２￣２３]ꎮ此外ꎬＣａｓ９蛋白还可在２个活性位点残基(Ｄ１０Ａ和Ｈ８４０Ａ)发生突变ꎬ失去启动ＤＮＡ双链断裂(ｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓꎬＤＳＢｓ)的能力ꎬ形成所谓的ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９系统ꎬ可用于干扰和激活基因表达[２４]ꎮ表１比较了３种编辑技术的优缺点ꎮ表１㊀新型基因编辑技术的比较Ｔａｂｌｅ１㊀Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｎｅｗｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ编辑技术工作机制基本组件优点缺点ＺＦＮＤＮＡ/蛋白质识别含锌指结构域和ＦｏｋⅠ酶结构域具有高度的靶向性脱靶率高ꎬ具有细胞毒性ꎬ设计复杂㊁昂贵㊁难度大ＴＡＬＥＮＤＮＡ/蛋白质识别ＴＡＬＥ和ＦｏｋⅠ融合蛋白较ＺＦＮ特异性高ꎬ成本低细胞毒性ꎬ脱靶问题依旧存在ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ＤＮＡ/ＲＮＡ识别Ｃａｓ９蛋白和ｇＲＮＡ设计和实现更简单ꎬ成本低ꎬ毒性低编辑效率㊁精确度及脱靶效应问题２㊀基因编辑技术在微藻中的应用理论上ꎬ上述工具酶可以定点修饰任何物种的基因序列ꎮ它们结合到靶基因序列后ꎬ通过切割酶破坏靶ＤＮＡ双链ꎬ然后启动非同源末端连接修复(ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄｊｏｉｎｉｎｇꎬＮＨＥＪ)或同源重组修复(ｈｏｍｏｌｏｇｙ￣ｄｉｒｅｃｔｅｄｒｅｐａｉｒꎬＨＤＲ)机制来修复靶基因ꎬ从而产生精确的定点修饰的靶基因而没有插入任何外源ＤＮＡ片段ꎬ这种定点修饰就成为可以在后代中稳定遗传的变异[２５]ꎬ在微藻中同样适用ꎮ２.１㊀ＺＦＮ技术在微藻中的应用ＺＦＮ技术应用于微藻的研究非常少ꎬ只有１例ꎮ２０１３年ꎬＳｉｚｏｖａ等[２６]首次将ＺＦＮｓ技术应用于莱茵衣藻(Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｈａｒｄｔｉｉꎬ常作为基础和生物技术研究的通用模型)ꎬ利用ＺＦＮｓ靶向突变编码光敏一型视紫红质离子通道的ＣＯＰ３基因ꎮＺＦＮ的不同转化效率是由敲除抗性或荧光标记等报告基因来评估的ꎬ并根据结果修饰优化模块组合ꎬ选出亲和力和特异性最佳的核酸酶结合外源ＤＮＡ共转化ꎬ实现对该藻株靶基因的定点敲除ꎮ这项技术不仅有助于衣藻单个基因功能的研究ꎬ而且还可以实现有效的基因定点修饰ꎮ２.２㊀ＴＡＬＥＮ技术在微藻中的应用ＴＡＬＥＮ诱导的靶向基因失活和靶向序列插入的方法ꎬ通过重塑硅藻新陈代谢方面的有效性在微藻中得到了证实ꎮＤａｂｏｕｓｓｉ等[２７]首次将ＴＡＬＥＮ技术应用于硅藻的基因敲除ꎮ通过ＮＨＥＪ介导的修复产生突变体ꎬ敲除了三角褐指藻(Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ)中参与油脂代谢的关键基因ꎬ其中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ＵＤＰ￣ｇｌｕｃｏｓｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅꎬＵＣＰａｓｅ)基因的敲除突变株的甘油三酯(ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌꎬＴＡＧ)含量相比野生型藻株提高了４５倍ꎬ使突变体具有工业生产的潜力ꎮ之后的研究中ꎬ将ＴＡＬＥＮ表达盒与含有与ＴＡＬＥＮ靶位点同源序列侧翼的抗生素抗性基因的 敲除质粒 结合ꎬＴＡＬＥＮ与靶基因结合进行切割ꎬ 敲除质粒 则通过ＨＤＲ整合到基因组ꎬ敲除三角褐指藻Ｐ.ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ的尿素酶基因ꎬ基于ＨＤＲ的靶向插入更易获得突变体[２８]ꎮＨａｏ等[２９]通过ＴＡＬＥＮ基因组编辑技术破坏了Ｐ.ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ中硫酯酶基因ꎬ成功构建了ｐｔＴＥＳ１基因的敲除突变株ꎬ结果表明尽管微藻生长受到损害ꎬ但与野生型菌株相比ꎬｐｔＴＥＳ１基因敲除突变体显示出更高的ＴＡＧ生产率ꎬ含量提高了１.７倍ꎬ证明了ＴＡＬＥＮ介导的靶基因敲除作为增强含油硅藻中ＴＡＧ产生的有效策略的潜力ꎮ在最近的研究中ꎬＫｕｒｉｔａ等[３０]合成了编码为产油微拟球藻(Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａ)的ＰｌａｔｉｎｕｍＴＡＬＥＮｓꎬ并通过在人ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中的单链退火实验验证了它们的ＤＮＡ结合活性ꎮ以硝酸还原酶基因２１生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.ＮｏＮＲ和酰基转移酶基因ＬＰＡＴ１为靶点ꎬ将ＰｌａｔｉｎｕｍＴＡＬＥＮ的多合一表达载体转染到微绿球藻中ꎮ在Ｎ.ｏｃｅａｎｉｃａ候选位点没有可检测到的脱靶突变ꎮ同时引入ＴＡＬＥＮｓ靶向２个基因ꎬ获得双突变株ꎮ此外ꎬ这些多合一的ＴＡＬＥＮ载体在大肠杆菌中表现出高特异性和多重性ꎮ此研究为创造高性能藻类生物柴油的实际应用做出了贡献ꎮ２.３㊀ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术在微藻中的应用首次应用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９对微藻的研究中ꎬＪｉａｎｇ等[３１]将Ｃａｓ９蛋白和ｓｇＲＮＡ(ｓｉｍｐｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡꎬｓｇＲＮＡ)基因通过电穿孔导入衣藻细胞的实验ꎬ用非同源末端连接系统修复双链断裂ꎬ采用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９对微藻中的４个靶基因进行插入和缺失ꎬ成功在莱茵衣藻(Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ)细胞中表达Ｃａｓ９蛋白与ｓｇＲＮＡꎬ突变频率达４２.８％ꎮ然而ꎬ由于Ｃａｓ９的毒性ꎬ未能获得任何稳定遗传的转化子ꎬ严重降低了成功率ꎮ随后有研究表明ꎬ通过运送包含Ｃａｓ９蛋白和ｓｇＲＮＡｓ的Ｃａｓ９核糖核蛋白(ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎꎬＲＮＰｓ)解决了这个问题ꎬ以避免与载体驱动的Ｃａｓ９表达相关的细胞毒性和脱靶问题ꎮ在ＭＡＡ７㊁ＣｐＳＲＰ４３和ＣｈｌＭ这３个位点获得了ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９诱导的突变ꎬ与首次报道的转基因Ｃａｓ９诱导突变相比ꎬ靶向诱变效率提高了１００倍ꎬ通过使用Ｃａｓ９ＲＮＰｓ大大提高了基因敲除效率[３２]ꎮＷａｎｇ等[３３]以硝酸还原酶(ｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅꎬＮＲ)为例ꎬ在工业产油性海洋微绿球藻(Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｓｐｐ.)中建立了一种精确基因组编辑方法ꎬ用质粒载体介导的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术敲除了微藻的１个硝酸还原酶基因ꎬ发现５ｂｐ缺失突变体的比例超过１％ꎬ分离的突变体在ＮＨ４Ｃｌ作用下能正常生长ꎬ但在ＮａＮＯ３作用下不能正常生长ꎬ是一个很有价值的转ＮＲ基因的基础菌株ꎮ有研究报道了在海洋微绿球藻中用ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ介导的基因组编辑的另一种方法:将ＲＮＰ和编辑模板通过电穿孔直接导入微藻细胞ꎬ使Ｃａｓ的表达可有可无ꎬ同源定向修复成为可能ꎮＣａｓ/ＲＮＰｓ与ｄｓＤＮＡ修复模板的共导入有效地提高了靶位点的同源同组ꎬ产生了约７０％的阳性突变系ꎬ阳性突变株比例显著提高ꎬ有利于高效产生微绿球藻靶向突变体[３４]ꎮ海洋硅藻是真核微藻ꎬ在海洋中具有重要的生态作用ꎬ所以更需要建立简单的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９体系ꎮＮｙｍａｒｋ等[３５]在三角褐指藻(Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ)中开发了ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９系统ꎬ经优化后实现了稳定的靶基因敲除ꎮ该系统发挥功能需要的２个组分ꎬＣａｓ９核酸酶和引导核酸酶指向特定ＤＮＡ序列的引导ＲＮＡꎬ都可以在同一载体中表达ꎬ结果在２６个转化实验中有８个得到了突变子ꎬ突变频率为３１％ꎮＭｏｏｓｂｕｒｎｅｒ等[３６]提出了改进方法ꎬ改进后单基因和双基因突变细胞系都是通过将１个选择性Ｃａｓ９和１个或２个ｓｇＲＮＡｓ接合后引入硅藻ꎬ同时利用阴性和阳性选择的外显子克隆策略ꎬ再利用人工测序㊁潮汐测序分析和Ｔ７核酸内切酶分析ꎬ开发了细胞系筛选和基因分型策略ꎬ缩短产生突变体所需时间ꎬ结果单基因和双基因敲除细胞系的突变率分别为４８％和２５％ꎮ从微藻提炼油脂是解决石油枯竭和二氧化碳排放问题的一种可选择㊁可持续㊁有前途的发展趋势ꎮ鉴于微藻细胞生长和油脂含量的限制ꎬ利用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９系统进行改造具有重要意义ꎮＬｉｎ等[３７]证明农杆菌介导的质粒适合对小球藻(Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ)进行基因插入ꎬ并以ω￣３脂肪酸去饱和酶(ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅ３ꎬＦａｄ３)基因为基础构建了结构类似的含有Ｃａｓ９片段的质粒ꎬ该片段含有设计在Ｆａｄ３基因上的ｓｇＲＮＡꎬ在小球藻ＦＳＰ￣Ｅ中表达脂质含量高达４６％ꎬ这是首次成功将ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术用于小球藻基因操作的案例ꎮ本课题组目前正在进行微藻的相关研究ꎬ获得了带有Ｇ４１８抗性的Ｃａｓ９质粒ꎬ将重组质粒成功转化到小球藻ꎬ为ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术应用于小球藻提供参考[３８]ꎮ３㊀展望ＺＦＮ和ＴＡＬＥＮ都是蛋白识别机制ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９系统识别机制则是通过人工设计的ｓｇＲＮＡ实现ꎬ操作简便ꎬ便于上手ꎬ容易构建ꎮ此外ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ基因组编辑的效率和精确度通过不断的努力得到了提高ꎬ包括Ｃａｓ蛋白和ｓｇＲＮＡ的不同表达策略ꎬ因而成为了主流的基因组编辑技术ꎮ３１曹豪豪ꎬ等:新型基因编辑技术在单细胞微藻中的应用进展. All Rights Reserved.目前ꎬ基因组编辑技术主要是产生内源基因功能缺失的突变体ꎬ对基因定点替换及基因的定点插入仍具有极大的挑战性ꎬ无法做到对任一位点上高效地替换或插入任意序列ꎬ这就限制了基因组编辑技术在微藻中的应用ꎮ与此同时ꎬ微藻本身还有很多问题ꎬ由于它们独特的细胞壁和表面结构ꎬ很难将遗传物质转入细胞中ꎬ通常需去除细胞壁并使用原生质体转化ꎬ从而提高转化效率ꎮ微藻可能在转录或转录后水平上对引入的遗传物质(包括ＤＮＡ和ＲＮＡ)具有沉默机制ꎬ暂时抑制其中一个沉默组件可以提高其转化效率ꎮ随着基因工程技术㊁生物信息学的飞速发展ꎬ微藻遗传背景日趋明晰ꎬ对微藻进行基因改造已成为现实ꎮ新型基因编辑技术仅在莱茵衣藻㊁三角褐指藻㊁海洋微绿球藻等几种微藻模型中进行了实验ꎬ通过基因组㊁转录组学等方法对某些潜在菌株进行全面分析ꎬ深入研究将充分发挥新型基因编辑技术在更多微藻中的应用潜力ꎬ以更有效和更可行的方式从微藻中生产生物燃料或其他有价值的产品ꎬ有可能彻底改变未来高效和精确的基因工程解决方案ꎬ具有无可比拟的优势和发展前景ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＭＯＲＷＥＩＳＥＲＭꎬＫＲＵＳＥＯꎬＨＡＮＫＡＭＥＲＢꎬｅｔａｌ..Ｄｅｖｅｌ￣ｏｐｍｅｎｔｓａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｆｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓｆｏｒｂｉｏｆｕｅｌｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｏｎ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ８７(４):１２９１－１３０１.[２]㊀刘敏胜ꎬ耿金峰ꎬ王慧岭ꎬ等.微藻产油技术进展[Ｊ].生物产业技术ꎬ２０１９(５):２２－３１.[３]㊀ＲＡＤＡＫＯＶＩＴＳＲꎬＪＩＮＫＥＲＳＯＮＲＥꎬＤＡＲＺＩＮＳＡꎬｅｔａｌ..Ｇｅ￣ｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆａｌｇａｅｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｄｂｉｏｆｕｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｅｕｋａｒｙｏｔ.Ｃｅｌｌꎬ２０１０ꎬ９(４):４８６－５０１.[４]㊀ＬＩＤꎬＷＡＮＧＬꎬＺＨＡＯＱꎬｅｔａｌ..Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｈｉｇｈｃａｒｂｏｎｄｉｏｘ￣ｉｄｅｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅｆｉｘａｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｌｏｒｅｌｌａｓｐ.ｂｙａｄａｐｔｉｖｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙｅｖｏｌｕｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ１８５:２６９－２７５.[５]㊀ＹＵＡＮＹꎬＬＩＵＨꎬＬＩＸꎬｅｔａｌ..Ｅｎｈａｎｃｉｎｇｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｐｒｏ￣ｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣｈｌｏｒｅｌｌａｓｐ.ＡＥ１０ｉｎｓｅｍｉ￣ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｕｎｒａｖｅｌｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１８ꎬ１８５(２):４１９－４３３. [６]㊀ＧＡＪＴꎬＧＥＲＳＢＡＣＨＣＡꎬＢＡＲＢＡＳＣＲ.ＺＦＮꎬＴＡＬＥＮꎬａｎｄＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ￣ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ３１(７):３９７－４０５.[７]㊀雷立芳ꎬ蔡英桂ꎬ王宏波ꎬ等.基因编辑技术在斑马鱼中的应用及研究进展[Ｊ].基因组学与应用生物学ꎬ２０２０ꎬ３９(２):５９１－５９８.[８]㊀ＳＭＩＴＨＪꎬＢＩＢＩＫＯＶＡＭꎬＷＨＩＴＢＹＦＧꎬｅｔａｌ..Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｃｌｅａｖａｇｅｂｙｃｈｉｍｅｒｉｃｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｗｉｔｈｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒＤＮＡ￣ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｓ[Ｊ].Ｎｕｃｌ.ＡｃｉｄｓＲｅｓ.ꎬ２０００ꎬ２８(１７):３３６１－３３６９.[９]㊀ＰＯＲＴＥＵＳＭＨꎬＣＡＲＲＯＬＬＤ.Ｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｕｓｉｎｇｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００５ꎬ２３(８):９６７－９７３. [１０]㊀ＨＡＵＳＣＨＩＬＤ￣ＱＵＩＮＴＥＲＮＪꎬＰＥＴＥＲＳＥＮＢꎬＣＯＳＴＧＪꎬｅｔａｌ..Ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔａｎｄｋｎｏｃｋｉｎｂｙｚｉｎｃ￣ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ:ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｕｓａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ[Ｊ].Ｃｅｌｌ.Ｍｏｌ.ＬｉｆｅＳｃｉ.ꎬ２０１３ꎬ７０(１６):２９６９－２９８３.[１１]㊀ＺＵＹꎬＴＯＮＧＸꎬＷＡＮＧＺꎬｅｔａｌ..ＴＡＬＥＮ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｐｒｅｃｉｓｅｇｅｎｏｍｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２０１３ꎬ１０(４):３２９－３３１.[１２]㊀ＢＩＨꎬＹＡＮＧＢ.ＧｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｗｉｔｈＴＡＬＥＮａｎｄＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].Ｐｒｏｇ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.Ｔｒａｎｓ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１７ꎬ１４９:８１－９８. [１３]㊀ＣＨＲＩＳＴＩＡＮＭꎬＣＥＲＭＡＫＴꎬＤＯＹＬＥＥＬꎬｅｔａｌ..ＴａｒｇｅｔｉｎｇＤＮＡｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓｗｉｔｈＴＡＬｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１０ꎬ１８６(２):７５７－７６１.[１４]㊀ＬＩＴꎬＨＵＡＮＧＳꎬＪＩＡＮＧＷＺꎬｅｔａｌ..ＴＡＬｎｕｃｌｅａｓｅｓ(ＴＡＬＮｓ):ｈｙｂｒｉｄｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆＴＡＬｅｆｆｅｃｔｏｒｓａｎｄＦｏｋⅠＤＮＡ￣ｃｌｅａｖａｇｅｄｏｍａｉｎ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ.ꎬ２０１１ꎬ３９(１):３５９－３７２.[１５]㊀ＭＯＳＣＯＵＭＪꎬＢＯＧＤＡＮＯＶＥＡＪ.ＡｓｉｍｐｌｅｃｉｐｈｅｒｇｏｖｅｒｎｓＤＮＡｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂｙＴＡＬｅｆｆｅｃｔｏｒｓ[Ｊ/ＯＬ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００９ꎬ３２６(５９５９):１５０１[２０２０－１２－２７].ｈｔｔｐｓ://ｐｕｂｍｅｄ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/１９９３３１０６/.ＤＯＩ:１０.１１２６/ｓｃｉｅｎｃｅ.１１７８８１７.[１６]㊀ＷＩＥＤＥＮＨＥＦＴＢꎬＳＴＥＲＮＢＥＲＧＳＨꎬＤＯＵＤＮＡＪＡ.ＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄｇｅｎｅｔｉｃｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａａｎｄａｒｃｈａｅａ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２０１２ꎬ４８２(７３８５):３３１－３３８.[１７]㊀ＢＡＲＲＡＮＧＯＵＲꎬＦＲＥＭＡＵＸＣꎬＤＥＶＥＡＵＨꎬｅｔａｌ..ＣＲＩＳＰＲｐｒｏｖｉｄｅｓａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔｖｉｒｕｓｅｓｉｎｐｒｏ￣ｋａｒｙｏｔｅｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ３１５(５８１９):１７０９－１７１２. [１８]㊀ＭＡＲＲＡＦＦＩＮＩＬＡꎬＳＯＮＴＨＥＩＭＥＲＥＪ.ＣＲＩＳＰＲｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｌｉｍｉｔｓｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＤＮＡ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００８ꎬ３２２(５９０９):１８４３－１８４５.[１９]㊀ＨＯＲＶＡＴＨＰꎬＢＡＲＲＡＮＧＯＵＲ.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓꎬｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍｏｆｂａｃｔｅｒｉａａｎｄａｒｃｈａｅａ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１０ꎬ３２７(５９６２):１６７－１７０.[２０]㊀ＲＩＣＨＴＥＲＨꎬＲＡＮＤＡＵＬꎬＰＬＡＧＥＮＳＡ.ＥｘｐｌｏｉｔｉｎｇＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ:ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１３ꎬ１４(７):１４５１８－１４５３１.[２１]㊀ＭＡＮＧＨＷＡＲＨꎬＬＩＮＤＳＥＹＫꎬＺＨＡＮＧＸꎬｅｔａｌ..ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓｓｙｓｔｅｍ:ｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｒｏｓｐｅｃｔｓｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ.ꎬ２０１９ꎬ２４(１２):１１０２－１１２５. [２２]㊀ＣＯＮＧＬꎬＲＡＮＦＡꎬＣＯＸＤꎬｅｔａｌ..Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉ￣ｎｅｅｒｉｎｇｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１３ꎬ３３９(６１２１):８１９－８２３.[２３]㊀ＭＡＬＩＰꎬＹＡＮＧＬꎬＥＳＶＥＬＴＫＭꎬｅｔａｌ..ＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｖｉａＣａｓ９[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１３ꎬ３３９(６１２１):８２３－８２６.[２４]㊀ＣＬＥＴＯＳꎬＪＥＮＳＥＮＪＶꎬＷＥＮＤＩＳＣＨＶＦꎬｅｔａｌ..Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ￣ｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｗｉｔｈＣＲＩＳＰＲｉｎｔｅｒｆｅｒ￣ｅｎｃｅ(ＣＲＩＳＰＲｉ)[Ｊ].ＡＣＳＳｙｎｔｈ.Ｂｉｏｌ.ꎬ２０１６ꎬ５(５):３７５－３８５.[２５]㊀李想ꎬ崔文涛ꎬ李奎.基因编辑技术及其应用的研究进展[Ｊ].中国畜牧兽医ꎬ２０１７ꎬ４４(８):２２４１－２２４７.４１生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.[２６]㊀ＳＩＺＯＶＡＩꎬＧＲＥＩＮＥＲＡꎬＡＷＡＳＴＨＩＭꎬｅｔａｌ..ＮｕｃｌｅａｒｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｉｎＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｕｓｉｎｇｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｚｉｎｃ￣ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅ￣ａｓｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２０１３ꎬ７３(５):８７３－８８２.[２７]㊀ＤＡＢＯＵＳＳＩＦꎬＬＥＤＵＣＳꎬＭＡＲＥＣＨＡＬＡꎬｅｔａｌ..Ｇｅｎｏｍｅｅｎ￣ｇｉｎｅｅｒｉｎｇｅｍｐｏｗｅｒｓｔｈｅｄｉａｔｏｍＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍｆｏｒｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ[Ｊ/ＯＬ].Ｎａｔ.Ｃｏｍｍｕｎ.ꎬ２０１４ꎬ５:３８３１[２０２０－１２－２７].ｈｔｔｐｓ://ｄｏｉ.ｏｒｇ/１０.１０３８/ｎｃｏｍｍｓ４８３１.[２８]㊀ＷＥＹＭＡＮＰＤꎬＢＥＥＲＩＫꎬＬＥＦＥＢＶＲＥＳＣꎬｅｔａｌ..Ｉｎａｃｔｉｖａ￣ｔｉｏｎｏｆＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍｕｒｅａｓｅｇｅｎｅｕｓｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ￣ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅ￣ｂａｓｅｄｔａｒｇｅｔｅｄｍｕ￣ｔａｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｊ.ꎬ２０１５ꎬ１３(４):４６０－４７０. [２９]㊀ＨＡＯＸꎬＬＵＯＬꎬＪＯＵＨＥＴＪꎬｅｔａｌ..ＥｎｈａｎｃｅｄｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｄｉａｔｏｍＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍｂｙｉｎａｃｔｉ￣ｖａｔｉｏｎｏｆａＨｏｔｄｏｇ￣ｆｏｌｄｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅｇｅｎｅｕｓｉｎｇＴＡＬＥＮ￣ｂａｓｅｄｔａｒｇｅｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ/ＯＬ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｆｕｅｌｓꎬ２０１８ꎬ１１:３１２[２０２０－１２－２７].ｈｔｔｐｓ://ｐｕｂｍｅｄ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/３０４５５７４１/.ＤＯＩ:１０.１１８６/ｓ１３０６８－０１８－１３０９－３. [３０]㊀ＫＵＲＩＴＡＴꎬＭＯＲＯＩＫꎬＩＷＡＩＭꎬｅｔａｌ..Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｍｕｌｔｉｐｌ￣ｅｘａｂｌｅｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｕｓｉｎｇＰｌａｔｉｎｕｍＴＡＬＥＮｓｉｎｏｌｅａｇｉｎｏｕｓｍｉｃｒｏａｌｇａꎬＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａＮＩＥＳ￣２１４５[Ｊ].ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓꎬ２０２０ꎬ２５(１０):６９５－７０２.[３１]㊀ＪＩＡＮＧＷꎬＢＲＵＥＧＧＥＭＡＮＡＪꎬＨＯＲＫＥＮＫＭꎬｅｔａｌ..Ｓｕｃ￣ｃｅｓｓｆｕｌｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａｓ９ａｎｄｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡｇｅｎｅｓｉｎＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ[Ｊ].Ｅｕｋａｒｙｏｔ.Ｃｅｌｌꎬ２０１４ꎬ１３(１１):１４６５－１４６９.[３２]㊀ＳＨＩＮＳＥꎬＬＩＭＪＭꎬＫＯＨＨＧꎬｅｔａｌ..ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｉｎｄｕｃｅｄｋｎｏｃｋｏｕｔａｎｄｋｎｏｃｋ￣ｉｎｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ[Ｊ/ＯＬ].Ｓｃｉ.Ｒｅｐ.ꎬ２０１６ꎬ６:２７８１０[２０２０－１２－２７].ｈｔｔｐｓ://ｄｏｉ.ｏｒｇ/１０.１０３８/ｓｒｅｐ２７８１０.[３３]㊀ＷＡＮＧＱꎬＬＵＹꎬＸＩＮＹꎬｅｔａｌ..Ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｏｆｍｏｄｅｌｏｌｅ￣ａｇｉｎｏｕｓｍｉｃｒｏａｌｇａｅＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｓｐｐ.ｂｙＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９[Ｊ].ＰｌａｎｔＪ.ꎬ２０１６ꎬ８８(６):１０７１－１０８１.[３４]㊀ＮＡＤＵＴＨＯＤＩＭꎬＭＯＨＡＮＲＡＪＵＰꎬＳＵＤＦＥＬＤＣꎬｅｔａｌ..ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｍｅｄｉａｔｅｄｈｏｍｏｌｏｇｙ￣ｄｉｒｅｃｔｅｄｒｅｐａｉｒｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｍｉｃｒｏａｌｇａｅＮａｎ￣ｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｏｃｅａｎｉｃａＩＭＥＴ１[Ｊ/ＯＬ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｆｕｅｌｓꎬ２０１９ꎬ１２:６６[２０２０－１２－２７].ｈｔｔｐｓ://ｐｕｂｍｅｄ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/３０９６２８２１/.ＤＯＩ:１０.１１８６/ｓ１３０６８－０１９－１４０１－３. [３５]㊀ＮＹＭＡＲＫＭꎬＳＨＡＲＭＡＡＫꎬＳＰＡＲＳＴＡＤＴꎬｅｔａｌ..ＡＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍａｄａｐｔｅｄｆｏｒｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｍａｒｉｎｅａｌｇａｅ[Ｊ/ＯＬ].Ｓｃｉ.Ｒｅｐ.ꎬ２０１６ꎬ６:２４９５１[２０２０－１２－２７].ｈｔｔｐｓ://ｄｏｉ.ｏｒｇ/１０.１０３８/ｓｒｅｐ２４９５１.[３６]㊀ＭＯＯＳＢＵＲＮＥＲＭＡꎬＧＨＯＬＡＭＩＰꎬＭＣＣＡＲＴＨＹＪＫꎬｅｔａｌ..ＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｋｎｏｃｋｏｕｔｓｉｎｔｈｅｍｏｄｅｌｄｉａｔｏｍｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍｂｙｅｐｉｓｏｍａｌｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆａｓｅｌｅｃｔａｂｌｅＣａｓ９[Ｊ/ＯＬ].Ｆｒｏｎｔ.Ｍｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌ.ꎬ２０２０ꎬ１１:５[２０２０－１２－２７].ｈｔｔｐｓ://ｐｕｂｍｅｄ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/３２０４７４８６/.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｍｉｃｂ.２０２０.００００５. [３７]㊀ＬＩＮＷＲꎬＮＧＩＳ.ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍｉｎＣｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓＦＳＰ￣Ｅｔｏｅｎｈａｎｃｅｌｉｐｉｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ/ＯＬ].ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０２０ꎬ１３３:１０９４５８[２０２０－１２－２７].ｈｔｔｐｓ://ｄｏｉ.ｏｒｇ/１０.１０１６/ｊ.ｅｎｚｍｉｃｔｅｃ.２０１９.１０９４５８. [３８]㊀史秀英.基于Ｃａｓ９质粒的重构及微藻电转化条件的研究[Ｄ].石家庄:河北经贸大学ꎬ硕士学位论文ꎬ２０２０.５１曹豪豪ꎬ等:新型基因编辑技术在单细胞微藻中的应用进展. All Rights Reserved.。
微藻研究进展及产油的影响因素
可 以繁 殖 。
多种维生素 、 氨基酸 、 抗 生素等 多种 物质 ， 特别是 海洋 内生
长的单细胞藻称为微藻 ， 被证实是地球上最先诞生 的物种 ， 其中有很多的相 关 物种 已经 在地 球 上生 存 了 ３ ０多 亿 年。 它们 通过长年的演化 ， 可 以利用太 阳能 ， 将水 、 二 氧化碳 和 盐类 转化成有机物 ， 属于地 球上有 机物 的最初 生产 者。 同 时它们 制造了空气 中绝 大部分 的氧气 ， 并 为其他 海洋 和陆
通讯作者 ： 王志成（ １ ９ ７ ３ 一 ） ， 男， 研究员级高级工程师 ， 主要从事生物质能源和替代 能源研究 。
Ｄ ． 藻类不仅含有蛋 白质 、 脂肪 和碳 水化合物 这些人 类 生存所需摄入 的主要营养 ， 而且还含有可燃性油脂 、 多种 维 生素 、 氨基 酸 、 抗生素等多种物质 。 Ｅ ． 微藻有很多 的种类 ， 有一些 拥有制 造特殊有 机物 的 功能 ， 这些微 藻经 过加 工利 用 ， 可 以给人类提供具有 医用 和
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０ ｔ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ａｌ ｇａ ｅ
Ｚ ＨＡＮ Ｇ Ｙｕ ，ＷＡＮＧ Ｚ ｈ ｉ － ｃ ｈ ｅ ｎ ｇ ，Ｚ ＨＡＮ Ｇ Ｙｕ ｅ ，Ｚ ＨＯ Ｕ Ｈｏ ｎ ｇ ． ｘ ｉ
（ 疵 ｅ ｏ ｆＥ ｎ ｅ ｒ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｆＨ ｏ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ， Ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ ２ ７ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
辟 了一条绿 色途 径。 关键词 ：食 品 ； 能源 ； 微 藻 中图分类号 ：Ｔ Ｑ ６ ４ ５ 文献标志码 ：Ａ 文章编号 ：１ ６ ７ ４ － ８ ６ ４ ６ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ９ － ０ ０ ４ ９ － ０ ４
微藻遗传改造的方法及应用进展
生物制药与研究2018·10180Chenmical Intermediate当代化工研究微藻遗传改造的方法及应用进展＊缪东来（浙江省杭州学军中学 浙江 310012）摘要：随着人们对微藻在能源和资源方面应用需求的增加，现有藻种的性状已不能满足应用的需要，对微藻进行遗传改造越来越必要。
本文简要介绍了显微注射、玻璃珠法、电转化法、基因枪法及农杆菌转化法等转化技术在藻类遗传转化中的应用，并对微藻藻种遗传改造方法如构建随机插入突变体库、RNA干扰、基因组编辑技术等进行简要综述，希望能为这一领域的科研工作者提供参考。
关键词：微藻；遗传改造方法；随机插入；RNA干扰；基因组编辑中图分类号：R 文献标识码：AProgress in Methods and Applications of Microalgae Genetic TransformationMou Donglai(Hangzhou Xuejun Middle School, Zhejiang, 310012)Abstract ：With the increasing application requirements for microalgae in energy and resources, the characteristics of the existing algaespecies can no longer meet the demand of application, so it is more and more necessary to carry out genetic transformation on microalgae. This paper briefly introduces the application of transformation techniques such as microinjection, glass bead method, electric transformation method, gene gun method and Agrobacterium transformation method in the genetic transformation of algae, and briefly summarizes the genetic transformation methods of microalgae such as constructing random insertion mutant library, RNA interference and genome editing technology, hoping to provide references for scientific researchers in this field.Key words ：microalgae ；genetic modification methods ；random insertion ；RNA interference ；genome editing随着全球人口的不断增长，对能源和资源的需求不断增加，由于化石能源和土地资源的不可再生性，人们面临着能源短缺、资源匮乏以及由化石燃料燃烧带来的环境污染问题。
产油微藻培养与回收的关键技术研究进展
摘 要 寻找廉价 而高效 的替代原料是实现生物柴油产业化的关键所在 。微 藻以含油量 高、 生长周期短 、 环境 适应能力 强、 生
物 产 量 高 等优 点 ， 有 望 成 为 一 种 极 具潜 力 的生 物 柴 油 生 产 原 料 。然 而 ， 目前 尚 存 在 微 藻 培 养 低 效 成 本 高 和 微 藻 回 收 效 率 低 两 大 难
Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｐｏ ｌ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ａ ｎ ｄ Ｒｅ ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ Ｒｅ ｕ ｓ ｅ，Ｔ ｏ ｎ ｇ Ｊ ｉ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ，Ｓ ｈ ａ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ ２ ０ ０ ０ ９ ２ ）
题 。综 述 了 微 藻 培养 与 回收 过 程 中 的 关键 技 术 ， 并 对 存 在 的 两 大 难题 及 其 改 进 技 术 进 行 了详 细 的探 讨 。最 后 ， 总 结并 展 望 了微 藻 培 养、 回收 技 术 未来 的 发展 趋 养 回 收
废水 处理
环 境 污 染与 防治
第 ３ ５ 卷
第 ９期
２ ０ １ ３年 ９月
产油微藻培养 与回收的关键技术研究进展 ＊
杨 黎 彬 周 雪 飞 张 亚 雷 褚 华 强
（ 同济 大 学 污 染 控 制 与 资 源 化研 究 国 家重 点 实 验 室 ， 长 江水 环 境 教 育 部 重 点 实 验 室 ， 上海 ２ ０ ０ ０ ９ ２ ）
ａ ｇ ｉ ｎｏ ｕｓ ｍｉ ｃ ｒ ｏａ ｌ ｇａ ｅ ｃ ｕｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏｎ ａ ｎｄ ｈ ａ ｒ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎｇ ｗａ ｓ ｐ ｒ ｏ ｐ ｏｓ ｅ ｄ ．
Ｚ ＨＡＮＧ Ｙ ａ ｌ ｅ ｉ ， Ｃ ＨＵ Ｈｕ ａ ｑ ｉ ａ ｎ ｇ ． （ Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｙ ａ ｎ ｇ ｔ ｚ ｅ Ｗａ ｔ ｅ ｒ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｍｉ ｎ ｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｅ ｄ ｕ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ， Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ
微藻高油脂化基因工程研究策略
微藻高油脂化基因工程研究策略随着经济的发展，人们的使用的石油的量在不断增加，石油的储量也在逐渐减少。
因此，研究者们开始致力于研究微藻油脂化来替代石油供求缺口，同时具有可持续发展性。
在过去几年里，微藻油脂化技术取得了很大的进步，以及可持续性研究领域也受到了越来越多关注。
微藻油脂化是以微藻（如绿藻、红藻和黄藻）为载体进行基因工程，从而获得大量高油脂量的微藻油。
与传统的原油不同，微藻油的分子量更小，更易被有机物吸收，因此可以用来生产更多的替代能源。
同时，微藻油脂化可以提供碳纤维材料，改善土壤质量，维持可持续增长，以及提高生物利用率。
在微藻油脂化技术的研究中，基因工程扮演着至关重要的角色。
基因工程的应用可以改变微藻的底物需求及其生长环境，以改善油脂的抽取。
例如，通过改变微藻的合成酶系统及其代谢通路，可以使微藻可以合成更多的油脂；此外，一些转基因微藻也可以从水中抽取更多的碳，从而提高油脂产量。
基于以上证据，微藻高油脂化基因工程研究成为近期可持续发展领域的热门研究主题。
然而，在研究中仍然存在一些技术瓶颈，需要有一个系统的策略来解决。
首先，应结合分子工具，如蛋白酶、核酸和其他有害物质抗性系统，筛选微藻及其生物特性，以确定他们在低水温环境中的最佳表现。
其次，可以借助基因组数据，通过遗传调控及通路建模，了解微藻油脂化机制，以优化油脂产量。
此外，应基于实验方法，通过聚合酶链反应（PCR）等技术进行基因表达谱分析，以评价其在不同温度和水下环境中的稳定性。
最后，可以借助最新的技术，如噬菌体基因编辑，来降低转基因微藻的成本，从而提高转基因产物的生产率。
此外，还可以利用数值模拟方法，如蒙特卡洛模拟，从而有效控制油脂合成及其特性，并评估油脂在不同条件下的产量和品质。
总之，微藻油脂化技术具有巨大的潜力，可以替代传统的石油，从而促进可持续发展。
但是，为了实现这一目标，有必要采用全面的策略，包括筛选微藻和他们的生物特征，研究基因表达谱，调控基因，以及降低转基因成本等，以提高高油脂量微藻产品的质量和产量。
中石化中科院联合开发微藻制油技术
提 高水 压 ， 大循 环量 降低气 体温度 ， 加 确保 ４套 合成
富氧气化助太化合成氨煤耗大降 高吸水树脂是一种新型的功能高分子材料。该 技术产 品 的特 点是 吸水 和保 水 能力 强 ， 以吸 收 自 可 太化 股份公 司合成 氨分 公 司生产 采用变 压吸 附 身重量几 百至上 千倍 的水 ， 吸 收 的水 在加 压 的情 制纯氧、 被 富氧制合成原料气等技术 ， 吨合成氨煤耗大 况下也不 会释放 ， 是 可 以通 过土 壤 或植 物 的根 系 幅降低 ， ２ １ ６月份 吨氨煤耗 降至 １７６ｋ 但 继 ００年 ７ ｇ以 进行 传输 或吸 收。 由于 具备 以上优 越 的 特点 ， 类 来 ， 份吨氨煤 耗 又 降至 １６５７ｋ ， 近 年来 吨 该 ７月 ６ ． ｇ创 材料 不仅可 广泛应 用 到人 们 日常生 活 的 方方 面 面 ， 氨煤耗 最低 。 在农林 保水剂 方 面 ， 吸水性树 脂还 可起 到保 水抗旱 、 太化股份合成氨分公司精心整修造气炉设备缺 育种保苗、 沙漠治理等作用 ； 在医疗医药生理卫生方 陷和稳定 富氧气 化 工 艺 ， 稳定 合 成 氨生 产 运行 。造
紧密合作 ， 为学术界与工业界的合作提供 了很好 的 示范。 内蒙古大学成功研发出高吸水树脂技术
内蒙古大 学化工学 院成 功研发 出高吸水 树脂技
术， 该技术 应用领 域广 阔 ， 其技术 产 品吸水量是 市场 销 售产 品的 ２— ４倍 。
自主创新能力 ， 提升科技对经济发展的贡献率。
知识 产权与技 术储备 支持 。中科 院与 中石化 在微 藻
和有关科 研单位 对制 约两个 产业化 项 目的关 键技术 和工艺难点进行攻关。他们开发出了太 阳能级单晶 硅及 晶片产业 化项 目中适 应高原 气候特 点 的特殊 方 法生产 １ 寸太 阳 能级 单 晶硅 棒 的石 墨 加热 系 统 ８英 及 生 产 工 艺 技 术 ， 耗 降 低 ５ ６ ， 节 约 用 电 能 ．％ 年
藻类基因组学的研究进展
一、质体的分离 样品前处理 加STE常温匀浆 过滤和低速离心
二、DNA酶的处理 加ST和DNA酶酶解 三、降解质体和纯化DNA TEN降解质体 去除蛋白 纯化DNA 结果检测 停止酶解加NETF漂洗
总DNA提取的主要方法
组织液氮研磨 提取缓冲液 保温、离心 加TE 70℃保温15min 加醋酸铵冰浴30min
2. 总基因组的提取，再分离细胞器DNA
2.1 总DNA提取，超速分离细胞器的DNA
2.2 总DNA提取，层析等方法分离细胞器DNA
超速离心分离细胞器，再分离DNA
样品前期处理 结果检测 蔗糖梯度离心 分离细胞器 裂解细胞器 DNA的纯化 CsCl梯度离心
Lysis buffer: 50 mM Tris (pH 8), 100 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.5% (w/v) SDS, 0.7% (w/v) N-lauroyl-sarcosine , 200 μg/mL proteinase K, 100 μg/mL Rnase
CTAB 提取缓冲液： 100 Tris-HCl mM TRIS-HCl pH 8.0, 1.5 M NaCl, SDS 提取缓冲液： 0.1M pH 8.0, 0.05M EDTA, 20 mM EDTA, 20 mM DTT和2% CTAB
0.5M NaCl, 1.6% SDS, 0.2% PVPP和2%β-巯基乙醇
加提取缓冲液 37 ℃ 保温1h 加等体积5.0M醋酸 钾冰浴20min,离心 水相加等体积酚:氯 仿:异戊醇(25:24:1)
方法二
结果检测
18000g离心得到DNA 沉淀、洗涤，提纯DNA
重复4、5，2/3体积预冷 异丙醇，-20℃放置过夜
微藻生物燃油制备技术的研究进展
微藻生物燃油制备技术的研究进展摘要：综述了微藻生物燃油制备技术的研究进展，包括微藻快速热解液化技术、直接液化技术以及超临界液化、溶剂催化液化、微波热解液化和共液化等新型液化技术。
介绍了现有技术的特点和优势，指出了今后研究的主要方向。
关键词：微藻生物燃油快速热解直接液化新型液化技术生物质能源作为一种清洁的低碳燃料，其含硫和含氮量均较低，同时灰分含量也较小，所以燃烧后SO2、NO和灰尘排放量比化石燃料小得多，是可再生能源中理想的清洁燃料[1-3]。
微藻生物质与能源植物相比，具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短和生物质产量高的优势。
目前，微藻培养和收获方面，国内外学者已进行大量研究，包括微藻的藻种筛选、基因工程构建高产油藻株，优化培养法提高油脂含量，以及微藻细胞的采收技术等方面。
相对于微藻培养与收获方面的研究，如何将微藻转化为性能良好的燃料油也是微藻能源化应用中的重要课题。
本文对微藻生物燃油制备技术的研究进展进行综述。
一、快速热解液化技术生物质热解和液化是常用的生物质油制备方法。
从对生物质的加热速率和完成反应时间来看，生物质热解工艺基本可以分为慢速热解和快速热解两种类型。
在快速热解中，当完成反应时间极短（HCOOH>KOH>Na2CO3，而在反应体系添加一定的有机物质的基础上，使用碳酸钠作为催化剂可获得最高油产率为27.3%（小球藻）和20.0%（螺旋藻）。
生物油产率：Na2CO3>CH3COOH>KOH>HCOOH，对制备的生物油进行分析表明，所得生物油典型组成为碳70～75%，氧10～16%，氮4～6%，高位热值为33.4～39.9MJ/kg。
生物油含有芳香族碳氢化合物，含氮杂环化合物以及长链脂肪酸和醇等，仅有40%左右的成分沸点低于250℃。
Zhou等[26]以浒苔为原料进行了水热液化制备生物油研究。
结果表明，在反应温度300℃，反应时间30min，加入5% （质量分数）Na2CO3条件下，可获得最高生物油产量为23.0%（质量分数）。
基因编辑技术在藻类生物中的应用研究
基因编辑技术在藻类生物中的应用研究随着科学技术的不断发展，基因编辑方面的技术也越来越成熟，越来越普及。
而这种技术的应用范围也越来越广泛，包括在藻类生物中。
基因编辑技术在藻类生物中的应用研究，已经成为当前科学研究的重点之一。
一、什么是藻类生物藻类生物是一类复杂的生物体系，在生态环境中扮演着重要的角色。
它们可以进行光合作用并产生氧气，同时也可以吸收二氧化碳，转化为有机物质。
这些生命活动对于维护整个生态环境的平衡起着至关重要的作用。
二、基因编辑技术在藻类生物中的应用研究随着人类的发展，生态环境的状况日益恶化。
为了能够更好地支持和维护生态环境的平衡，我们需要找到一种更加有效的方法。
基因编辑技术便成为了这个时代最好的选择之一。
基因编辑技术可以通过人工手段对生物体基因进行编辑和改造，以实现对自然界的人工操控。
在藻类生物中，基因编辑技术可以用于改变其生长特征、代谢模式等方面，从而使其更加适应不同的环境。
这对于生态环境的平衡和人类的生存都具有极其重要的意义。
三、基因编辑技术的原理基因编辑技术主要基于CRISPR/Cas9技术体系，利用特定的酶促反应对DNA 序列进行改变。
它可以选择性切除或插入特定的DNA序列，从而改变生物体的特征。
四、基因编辑技术在藻类生物中的实践在实际应用方面，基因编辑技术可以用于改变藻类生物的代谢模式。
例如，可以利用该技术对藻类生物的光合作用进行优化，使其更加适应光照条件的变化。
同时，也可以改变其生长特征，从而实现对生态环境的更加有效的操控。
在生长特征方面，可以利用基因编辑技术优化藻类生物分布区域，从而实现更加高效的生态环境维护。
实际应用方面，还可以利用基因编辑技术对生物体的免疫系统进行加强，以提高生物体的抗菌能力。
五、基因编辑技术在藻类生物研究中的意义基因编辑技术在藻类生物研究中的意义不能被忽视。
它可以帮助我们更好地了解藻类生物的生物学特征和生态环境的变化规律。
同时，也可以为环境保护和生态保护提供更加有效的手段。
微藻生物技术新进展
（一）小球藻
一种单细胞绿藻，蛋白质含量高达50-65％, 并含有大量的维生素、叶绿素，特别是含有生物 活性物质。 产品具有增强人体免疫、抗菌、抗病毒、抑 制癌细胞、控制血糖上升，降低胆固醇，排除毒 素等功能。小球藻中富含CGF（小球藻生长因 子），能迅速恢复机体造成的损伤，并可作为食 品风味改良剂，广泛应用于食品及发酵领域。 小球藻为世界上公认的健康食品，全世界年产 量2000吨，主要生产地为东南亚地区。产品以粉 或丸剂及小球藻提取物形式直接进入保健品市场。
螺旋藻消化率——95％ 小球藻消化率——74.6％
250克微藻干品可满足一个成年人一天24小时 对蛋白质、维生素、矿物质及热量的需求。
（二）应用开发途径
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保健食品 动物饲(饵)料 药物化工 废水处理 新能源 生物肥料
（三）来自微藻的产品
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单细胞蛋白（SCP） 类胡萝卜素（ β－胡萝卜素、虾青素） 藻胆蛋白 高不饱和脂肪酸 多糖类 生物活性物质 藻毒素
目前,国际上成功的生产模式都采用了两 阶段生产方式,即先采用封闭式光生物反应 器培养系统实现细胞的高密度营养生长、 再采用流行的开放池系统在胁迫条件下使 细胞积累虾青素。 当前世界上只有美国、以色列等国家的 大公司能够实现规模生产。 雨生红球藻产品以软胶囊和藻粉形式在 市场出现。
Sosa Texcoco 湖
螺旋藻大规模生产地主要在美国、墨西哥和远东 (主要是泰国)。 我国螺旋藻产业化规模目前位居世界前列。 产品以粉或丸剂投放保健品市场。或将藻粉掺到 多种食品中。另一类产品是从螺旋藻中提取的藻蓝 素主要作食品增色剂，或用于医药和化妆品。
（三）杜氏藻
杜氏藻是单细胞双鞭毛的绿藻，此种藻积累 的甘油浓度可达总生物量的50％。在不利条件下， 细胞积累的β—胡萝卜素浓度可达干重的8—12％。 杜氏藻具有的以下独特性状，使其成为大规模培 养的有吸引力的对象：
中科院建立工业产油微藻基因敲低技术
［ １ ０ ］ 张秋 卓 ， 蔡伟 民 ． 纤 维素酶 高产 菌株的 复合 交替诱 变选
育［ Ｊ ］ ． 工业微生物 ， ２ ０ ０ ８ ， ３ ８ （ ６ ） ： ３ ２ — ３ ７ ． ［ １ １ ］ Ｓ ｈ ｗ ｅ ｔ ａ Ｓ ｈ ａ ｒ ｍａ ， Ｔ Ｋ Ｂ ｈ ａ ｔ ， Ｒ Ｋ Ｄ ａ ｗ ｒ ａ ． Ａ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ０ ｐ ｈ ｏ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｉ ｃ Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ Ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｏ ｆ Ｔ ａ ｎ ｎ ａ ｓ ｅ Ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ Ｒ ｈ ｏ ｄ ａ ｎ ｉ ｎ ｅ［ Ｊ ］． Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ
ｃ ｈ ａ ｌ ｌ ｅ ｎ ｇ ｅ ｓ ｏ ｆ ｔ ａ ｎ ｎ ａ ｓ ｅ ａ ｎ ｏ ｖ ｅ ｒ ｖ ｉ ｅ ｗ［ Ｊ ］． Ｆ ｏ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ Ｂ ｉ ｏ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ
Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ １ ２ ， ５ （ ２ ） ： ４ ４ ５ — ４ ５ ９ ．
Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｉ ｎ ｄ ｕ ｓ ｔ ｒ ｙ
９ １ ％ 的 菌 株 来 自 Ｈ／ Ｄ 比值 为 １ ． ４至 １ ． ５之 间 。 单 宁
生 物 王 程
［ ６ ］ Ｉ ｌ Ｊ ｉ Ｇ， Ｌ ｉ Ｈ Ｐ ， Ｗａ ｎ ｇ Ｌ Ｙ， ｅ ｔ ａ １ ． Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｆ ｒ ａ ｄ ｉ ｏ —
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基因组编辑技术在微藻育种中的应用
基因组编辑技术在微藻育种中的应用微藻是一类生物体，具有高度的生物活力和适应性，广泛分布在自然环境中。
微藻中含有许多有益的物质，如藻胆蛋白、气囊、多糖等，具有很高的营养价值和医疗价值。
此外，微藻还是石油替代品的重要来源之一。
因此，人们对于微藻的学习与研究日益重要，其中育种技术是微藻研究与利用的关键。
将基因编辑技术应用于微藻育种可以提高微藻的生产力和经济效益，同时，也可以在生物学、医学等领域造福人类。
基因组编辑技术是指通过对基因组中的某些基因进行干预，从而改变微藻的某些性状。
目前，基因组编辑技术主要有CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN等几种。
Crispr/Cas9是目前最流行、最强大的基因组编辑技术之一。
CRISPR序列为一段长度约20个碱基的RNA，可以与一个或多个即使在基因组相对会难以发现的AAV或其他载体比如质粒相接合来对目标DNA进行导向。
而Cas9可以割开任何DNA（包括目标基因），通过简单复制粘贴、插入和删除DNA来实现基因组编辑的目的。
CRISPR/Cas9技术已经被应用于微藻育种中。
利用CRISPR/Cas9技术可以快速、准确地操控微藻的基因组。
以前，微藻育种只能通过长时间的杂交和选择，才能获得育种成功的品种。
这种方式不但耗时费力，而且育种成功率非常低。
现在，使用CRISPR/Cas9技术，可以高效地实现微藻突变和选择，实现微藻个体的快速生长和高产。
CRISPR/Cas9技术可以应用于微藻中的多种转录因子的调控，实现微藻的高效表达和生长。
比如，CRISPR/Cas9可以针对微藻中的某些负调控转录因子进行编辑，提高微藻的产生量，同时也能够降低微藻耗能基础水平，进一步提升微藻在生物质及其他高附加值产品生产等方面的应用潜力。
此外，CRISPR/Cas9还可以帮助研究人员研发出更加高效的微藻菌株，用于生产可生物降解塑料、生物柴油、微藻氨基酸、多糖等物质。
据报道，已经利用CRISPR/Cas9技术基因编辑微藻，成功地改善和增强其生物农药抗性、抗UV能力等特征，大大提高了微藻的工程利用价值和应用前景，为许多相关领域提供了重要的技术支撑。
中国研究微藻的课题组
中国研究微藻的课题组微藻作为一种重要的生物资源，其研究在我国受到了广泛关注。
本文将为您介绍中国研究微藻的课题组，带您了解他们在微藻领域的研究成果和应用前景。
一、课题组简介中国研究微藻的课题组遍布全国各地，其中以中国科学院、各高等院校和科研机构为主。
这些课题组在微藻的基础研究、应用开发等方面取得了显著成果，为我国微藻产业的发展做出了贡献。
二、研究方向与成果1.微藻生物学特性研究：课题组对微藻的分类、生理、生态等生物学特性进行了深入研究，发现了一批具有较高应用价值的微藻种类。
2.微藻生物技术：课题组在微藻的培养、育种、发酵工艺等方面取得了重要进展，提高了微藻生物量的产量和品质。
3.微藻活性成分研究：课题组对微藻中的蛋白质、脂质、多糖等活性成分进行了深入研究，发现其在医药、食品、饲料等领域具有广泛的应用前景。
4.微藻环保应用：课题组研究了微藻在污水处理、生物固碳等方面的应用，为实现绿色环保和可持续发展提供了技术支持。
5.微藻生物能源：课题组在微藻生物柴油、氢能等新能源领域取得了突破性进展，为我国能源结构调整和减排目标提供了新途径。
三、应用前景微藻研究在我国具有广泛的应用前景，主要包括以下几个方面：1.医药健康：微藻中的活性成分具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性，可用于开发新型药物和保健品。
2.食品工业：微藻富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素等营养成分，可作为食品添加剂、营养补充剂等。
3.饲料工业：微藻作为动物饲料添加剂，可提高动物生长速度、增强免疫力、降低发病率。
4.环保产业：微藻在污水处理、生物固碳等方面具有显著效果，有助于实现绿色环保和可持续发展。
5.生物能源：微藻生物能源具有清洁、可再生、低碳排放等特点，有望成为替代化石能源的重要选择。
总结：中国研究微藻的课题组在微藻领域取得了丰富的研究成果，为我国微藻产业的发展奠定了基础。
产油微藻的高密度培养工艺研究的开题报告
产油微藻的高密度培养工艺研究的开题报告一、研究背景随着全球经济的快速发展和人口的不断增长，能源需求持续增加，而传统的化石能源不仅数量有限，而且污染大，不利于环境保护。
因此，生物能源作为一种新型、清洁、可再生的能源成为了备受瞩目的研究领域。
而微藻由于其生长速度快、营养丰富、含油量高等优点，被认为是未来生产生物燃料的理想来源。
其中，产油微藻是研究热点，被广泛用于生物柴油、生物液体燃料等领域。
在产油微藻高密度培养中，最主要的问题是如何提高生物量和油脂含量，以保证经济可行性和生产效益。
因此，在研究高密度培养工艺时，需要考虑微藻种类、培养条件、光照强度、温度等因素，以及各种营养物质的浓度和配比等因素，以实现最优生长状态和最高的产油量。
二、研究目的本研究旨在探究如何通过合理的培养条件和营养物质调控，实现产油微藻高密度培养的最优化，以提高油脂含量、节约成本、增加生产效率，为生物燃料产业的发展做出贡献。
三、研究内容1. 紫藻和绿藻两种常见产油微藻的特性比较研究；2. 探究适宜的培养条件及营养配比对微藻生长和油脂含量的影响；3. 基于 L18 正交实验设计，对产油微藻高密度培养工艺进行优化；4. 对优化后的产油微藻进行培养试验并对生长情况和油脂含量进行分析。
四、研究意义随着全球化石能源储量的枯竭，生物能源的开发和利用越来越受到重视。
而产油微藻作为生物燃料的理想来源，其可再生、可持续、清洁环保等优势更是被广泛认可。
通过本研究，可以为实现高密度培养产油微藻提供科学依据，为生物燃料的发展作出贡献。
同时，此项研究还对微生物生长和生物工程的研究提供了新的思路和方法，具有较高的学术和应用价值。
五、研究方法本研究采用文献分析、实验研究、正交实验设计等方法，首先对微藻的种类、生长条件等进行文献调研和分析，并确定研究对象。
接着，通过小试实验确定营养物质配比及推荐培养参数范围。
然后，采用正交实验设计优化培养条件，最后通过大规模培养试验数据分析油脂产量和微藻生长情况。
科研人员找到富含神经酸的产油微藻
科研人员找到富含神经酸的产油微藻
微藻被认为是最具潜力、能实现可持续供给的油脂生物质资源之一，但至今未获产业化突破。
近日，中科院青岛生物能源与过程研究所研究员李福利及其微生物资源团队通过对自然界中微藻资源的筛选，得到一株Mychonastes afer HSO-3微藻，其油脂含量超过57%，神经酸占中性脂的6%以上，属国际上首次发现富含高比例神经酸的微藻品种。
神经酸又名鲨鱼酸，最早发现于哺乳动物的神经组织。
神经酸在神经组织和脑组织中含量较高，是生物膜的重要组成成分。
医学药学研究证明，神经酸是修复神经纤维的关键因子，具有恢复神经末梢活性、促进神经细胞生长和发育的功能，并对心血管及人体自身免疫缺乏性疾病有很好的疗效。
神经酸因其独特的医学价值、广阔的市场前景而极具开发价值。
但随着相关限制性使用动物产品的法规逐步建立，天然神经酸资源受到限制，远远不能满足需求。
因此，该微藻的发现对发展和开发神经酸市场具有重要意义；同时，该藻还具有高含油、生长较快、抗逆性强等特性。
据悉，李福利团队已申请了相关的藻种专利，在实验室水平对该藻的生长特性进行了研究，并建立了500 L实验室平板规模培养及神经酸提取工艺技术路线。
(摘自：中国科技网)。
油脂微藻的研究进展
油脂微藻的研究进展江木兰;黄凤洪【摘要】本文简述了油脂微藻的种类、含油量和脂肪酸成分以及主要用途,介绍了微藻的油脂代谢调控和改良技术研究进展,分析了目前大规模生产中存在的主要问题以及今后发展重点.【期刊名称】《中国油料作物学报》【年(卷),期】2010(032)004【总页数】6页(P571-576)【关键词】微藻;油脂含量和成分;代谢调控【作者】江木兰;黄凤洪【作者单位】中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;农业部油料作物生物学重点开放实验室,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062【正文语种】中文【中图分类】Q939.99藻类是一类具有叶绿素、能进行放氧光合作用，没有真正根、茎、叶的分化，生殖器官是单细胞，用单细胞的孢子或合子进行繁殖的低等生物。
有的藻也无叶绿素不能进行光合作用，或者在无光的条件下失去色素而进行异养生活。
大多数藻类生长在水中，目前全球已知藻种中的70%是微藻[1，2］。
微藻(microalgae)一词不是分类学名称，而是指那些需要借助于显微镜等工具辨别的微小藻类的总称[11］。
顾名思义，微藻个体微小，一般几微米至几十微米;结构多为单细胞或单细胞群体;生长周期短、一般数小时至几天。
可将它们定义为一类原核或真核的具有光合作用的微生物，原核微藻如蓝藻(blue－green algae)或称为蓝细菌(cyanobacteria)和原绿藻(prochloraphytes);真核微藻如绿藻(chlorophyta)和硅藻(bacillriophyta)。
它们在自然界分布广泛，无论是在海洋、淡水湖泊等水域或在干燥的陆地，微藻都能生存。
据估计约有5万种不同类型的微藻存在，目前约3万种微藻被人们所认识和研究[3，4］。
很多微藻以中性脂为储藏物质，中性脂占细胞干重的20%～50%，少数微藻可达75%。
微藻应用于油脂生产具有以下几点优势:①藻类油脂含量高、环境适应能力强、生长周期短、光合作用效率高、产量高，单位生产力显著高于农业油料作物;②微藻的一生都在水中度过，它们的生长不会与其他油料作物争夺土地，可以起到缓解食用油脂危机的作用;③可以利用边际陆地、废弃湖泊、废水和CO2，有利环境治理。
基于基因组学的藻类多样性研究
基于基因组学的藻类多样性研究近年来，随着基因组学技术的不断发展，藻类多样性研究也得到了空前的发展。
藻类是一类单细胞或多细胞生物，广泛分布于海洋、淡水、陆地等不同环境中，对环境变化具有较强的响应能力。
基于基因组学的藻类多样性研究将有助于深入探究藻类的起源与进化，并为生物技术和环保等领域提供更多原材料和解决方案。
一、藻类基因组学研究的发展现状与趋势基因组学是一个综合性学科，包括基因组分析、功能研究、对基因组数据的理解和解释等多个方面。
藻类基因组学研究的主要方向包括以下几个方面：1.常见藻类的基因组测序目前，已有大量藻类基因组测序工作完成，并不断涌现出新的基因组测序结果。
如测序了150个品种草履藻、140多个品种硅藻等。
这些工作极大地丰富了我们对不同藻类的遗传特征和分子机理的认识，为进一步深入研究奠定了基础。
2.基因组学与藻类分子育种随着基因组学技术在藻类领域的应用，使得藻类育种研究进入了一个全新的阶段。
藻类分子育种是一种高效、精准、快速的培育方法，可以通过改变特定基因的表达来获取特定的性状，如提高产量、改善耐受性等，为全球食品和能源危机提供了新的思路。
3.应用基因编辑技术研究藻类基因编辑技术是一种准确、高效、快速、低成本的基因改造技术。
利用基因编辑技术，可以精准修改特定基因，如“剪切掉”不利基因、“粘贴”或“编辑”有益基因等。
此外，基因编辑技术还有望开发出全新藻类菌株，从而为解决全球能源和环境问题提供新的思路和方案。
二、藻类基因组学研究的应用前景随着藻类基因组学研究的深入，其应用前景也日益广阔，甚至可谓无限。
以下是藻类基因组学研究的主要应用前景：1.藻类育种的应用藻类育种是基于藻类基因组学研究成果，通过对藻类基因组进行优化改良或添加人工基因来提高藻类的生长速度、适应性和产量等，为未来能源与食品生产提供了全新的思路，成为了未来先进生产手段之一。
2.藻类及其代谢产物的生物技术应用藻类及其代谢产物具有重要的生物技术应用价值，如藻类的油脂可以用于生产生物柴油、化妆品原料等；藻类中含有的多种生物活性物质可用于治疗疾病等；藻类纤维素等可作为天然涂料、油墨等。
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Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｏｌｅａｇｉｎｏｕｓｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ＨＡＯＸｉａ－ ｈｕｉ，ＨＵＡＮＧＦｅｎｇ－ｈｏｎｇ，ＧＯＮＧＹａｎｇ－ｍｉｎ
油，其生产力远超陆地油料作物，以生物柴油为例， 开放式的微藻培养体系每公顷可产生物柴油１２０００ Ｌ，相 比 之 下 每 公 顷 油 菜 籽 生 产 的 生 物 柴 油 只 有 １１９０Ｌ［５］。此外，微藻还可以用于生产有高价值的 代谢产物如蛋白、色素、生物氢气等 。 ［３～５］
尽管目前已经实现了微藻油脂的工业生产，但 主要以类胡萝卜素和 ＯＭＥＧＡ－３多不饱和脂肪酸 等高价值油脂为主，微藻生物燃油等油脂转化产物 因为生产 成 本 高，不 具 有 市 场 竞 争 力［６，７］。 主 要 原 因是，为提高微藻的油脂产量需要的缺氮等培养条 件会显著限制细胞的生长，导致细胞指数生长不能 与油脂积累同时进行。所以，在优化培养方案和油 脂提取技术的同时，深入研究微藻高效产油的相关 基因的功能和表达调控仍是微藻油脂研究领域的重
中国油料作物学报 ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｉｌＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓ
２０１９，４１（１）：０１４４－０１５０ ｄｏｉ：１０．７５０５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－９０８４．２０１９．０１．０１９
产油微藻基因组编辑技术研究进展
郝夏晖，黄凤洪，龚阳敏
（中国农业科学院油料作物研究所 ／农业部油料作物生物学与遗传重点实验室，湖北 武汉，４３００６２）
（ＯｉｌＣｒｏｐＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＯｉｌＣｒｏｐｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｕｈａｎ４３００６２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｏｗｂｉｏｍａｓｓａｎｄｌｉｐｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｍｉｃｒｏａｌｇａｅａｒｅｍａｉｎｒｅａｓｏｎｓｆｏｒｔｈｅｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙｉｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏａｌｇａｌｏｉｌｓ．Ｎｅｗｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＴＡＬＥＮ ａｎｄＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９，ｈａｖｅｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｋｅｙｇｅｎｅｓｉｎｌｉｐｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｇｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｉｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｌ ｇａｌｓｔｒａｉｎｓ．ＴｈｉｓｒｅｖｉｅｗｎｏｔｏｎｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄＴＡＬＥＮａｎｄＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄｔｈｅｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｒｏａｌ ｇａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，ｂｕｔａｌｓｏｅｌａｂｏｒａｔｅｄｔｈｅｉｒｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｉｎｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｔｕｄｙｏｆｏｌｅａｇｉｎｏｕｓｍｉｃｒｏａｌｇａｅａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ；ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ；ＴＡＬＥＮ；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ｌｉｐｉｄ
郝夏晖等：产油微藻基因组编辑技术研究进展
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要方向［８，９］。如果微藻油脂代谢的调控机理被充分 揭示，可使得微藻在理想的生长条件下大量合成油 脂，使其价格大幅降低。近年来，基因工程技术和生 物信息学的发展突飞猛进，特别是新型基因编辑技 术，已经成为生物科学研究的重要工具。ＴＡＬＥＮ和 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９是近年来应用最广泛的新型基因编辑 技术，并在 哺 乳 动 物、植 物 等 中 取 得 很 好 的 研 究 进 展［１０］。单细胞微藻的基因组较小，易于改造代谢途 径并用于工业培养，在微藻研究中结合基因编辑技 术 ＴＡＬＥＮ和 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的使用，研究者们可以 快捷而有效地研究基因功能并构建工业生产株系， 促进微藻应用研究的快速发展。
摘要：微藻生物 量 与 油 脂 产 量 偏 低 是 目 前 微 藻 油 脂 难 以 商 业 化 生 产 的 主 要 原 因 之 一，新 型 基 因 编 辑 技 术
ＴＡＬＥＮ和 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９在解析油脂合成代谢的关键基因以及进一步遗传改造产油藻株方ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ有巨大潜力。本文主 要介绍了 ＴＡＬＥＮ和 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术的基本原理，以及它们在产油微藻中的研究进展，并展望了两种技术在研究 产油微藻功能基因和构建工业株系方面的应用前景。
收稿日期：２０１８０５０７ 基金项目：中国农业科学院科技创新工程项目（ＣＡＡＳ－ＡＳＴＩＰ－２０１３－ＯＣＲＩ） 作者简介：郝夏晖（１９９５－），河南安阳人，硕士研究生，研究方向为微生物代谢与酶工程，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈａｏｘｉａｈｕｉ２２１＠１２６．ｃｏｍ 通讯作者：龚阳敏（１９７６－），男，博士，副研究员，硕士生导师，从事微生物脂质代谢与酶工程研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｍｉｎｇｏｎｇ＠ｏｉｌｃｒｏｐｓ
微藻在生物燃油、环境保护、食品添加、人体健 康、水产养殖上有良好的应用前景，种类繁多的微藻 以及多种多样的油脂代谢产物可以成为各种产业需 求的良 好 资 源［１，２］。 微 藻 油 脂 产 业 具 有 多 种 优 势： 一些微藻藻种含油量高，在正常条件下，微藻油脂含 量占其细胞干重的 ５％ ～２０％，主要为膜脂，一些微 藻可积累一定的中性油脂；而在缺氮等环境胁迫条 件下，部分 微 藻 藻 种 的 油 脂 含 量 可 占 细 胞 干 重 的 ２０％ ～５０％，部 分 微 藻 种 系 的 含 油 量 甚 至 能 高 达 ８０％，以储存能量的中性油脂为主［３］。微藻生长迅 速，在对数生长期间可在 ３．５ｈ内繁殖一代，培养周 期短。微藻的培养对水的适应性强，可在海水、工业 废水或农业废水中生长，成本低且可用于治理水污 染［３，４］。微藻的光合效率高、生物量大，且可全年产