用CPN60基因序列研究隐孢子虫种系发育关系

畜牧兽医学报　2007,38(11):1230～1234
A ct a V eteri nari a et Zootechnica S i nica
用CPN60基因序列研究隐孢子虫种系发育关系
王进产1,张龙现13,娄　飞1,2,宁长申1,菅复春1,卢庆斌1
(11河南农业大学牧医工程学院,郑州450002;21郑州牧业工程高等专科学校,郑州450011)
摘　要:本试验以编码线粒体功能性蛋白Chaperonin60(CPN60)的核基因作为研究对象,对隐孢子虫分离株CPN60基因进行扩增测序,用Clustal X1181对扩增序列与GenBank相关参考序列进行比对,然后用PAU P410程序中邻接法(Neighbor2joining,NJ)、最大简约法(Parsimony,MP)构建基因树,同时用TREEPU ZZ L E程序Version 411构建最大似然树(Maximum likelihood,ML),以确定不同隐孢子虫虫株之间的进化关系,并以18S rRNA和HSP70基因构建的进化树作参照,评价CPN60是否更适合作为隐孢子虫基因分型和进化关系的分子标记。

结果显示:基于CPN60构建的进化树将隐孢子虫分为两大类:C.bailey i和C.meleag ri dis处于一个分枝,C.hominis、
C.suis、C.parv um牛基因型和C.parv um鼠基因型处于另一个分枝上。

不同隐孢子虫之间的同源性介于96%～
100%,能有效区分隐孢子虫不同基因型。

因此,CPN60基因序列也可作为隐孢子虫分离株种系发育的遗传标记。

关键词:隐孢子虫;CPN60;种系发育
中图分类号:R38213;S852172+3 文献标识码:A 文章编号:036626964(2007)1121230205
Phylogenetic Analysis of the Cr y ptos poridia Isolates B ased on CPN60G ene Sequence
WAN G Jin2chan1,ZHAN G Long2xian13,LOU Fei1,2,
N IN G Chang2shen1,J IAN Fu2chun1,L U Qing2bin1
(11College of A ni m al S cience and V eteri nary Medici ne,Henan A g ricult ural
Uni versit y,Zhengz hou450002,Chi na;21College of Zhengz hou A ni m al
H usban d ry Engi neeri ng,Zhengz hou450011,Chi na)
Abstract:The mitochondrial f unctional p rotein Chaperonin60(CPN60)gene was cho se as t he tar2 get to research t he p hylogenetic relationship between Cry ptos pori di um strains.The gene of all Cry ptos pori di um st rains t hat preserved in our lab were amplified and sequenced.Then t he se2 quences were compared to ot her related reference sequences wit h Clustal X1181.Three met hods of p hylogenetic analysis were used to assess genetic relationship s among Cry ptos pori di a isolates and t he related sequences downloaded f rom GenBank.The distance2based neighbor2joining(NJ)anal2 ysis,parsimony(M P)analysis in PAU P410were used to const ruct NJ t ree and MP t ree,while ML t ree was made by using PU ZZL E Version411.The p hylogenetic relationship of different Cry ptos pori di um species or genotypes were established and t hen t hese p hylogenetic t rees were cont rasted wit h t hat drew from18S rRNA and HSP70gene sequences,to determine whet her t he CPN60gene is suitable for p hylogenetic analysis of Cry ptos pori di um.Cry ptos pori di um species were divided into two group s in t ho se p hylogenetic t rees,one group contained C.bailey i and C.
meleag ri dis,t he ot her group contained C.homi nis,C.suis,C.p arv um cattle genotype and C.
p arv um mouse genotype.The sequence identity of different Cry ptos pori di um species ranged from96%to100%.The result s showed t hat CPN60gene is equally suitable for t he p hylogentic analysis of Cry ptos pori di um.
收稿日期:2006212213
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371079);河南省高校创新人才培养工程项目(豫教高[2004]294)
作者简介:王进产(19792),男,河南正阳人,硕士,主要从事人畜共患寄生虫病研究,现在洛阳普莱柯生物工程有限公司工作
3通讯作者:张龙现,E2mail:zhanglx8999@
　11期王进产等:用CPN60基因序列研究隐孢子虫种系发育关系K ey w ords:Cry ptos pori di um;CPN60;p hylogenetic develop ment
隐孢子虫病(Crypto sporidiosis)是隐孢子虫感染而引起的以腹泻为主要临床表现的一种人兽共患原虫病。

该病原可感染大多数脊椎动物(包括人类),在免疫正常的个体引起自限性腹泻,在免疫功能受损的患者则引起渐进性致死性腹泻[1]。

目前18S rRNA、HSP70基因[2,3]、COWP基因[4]、ITS1和ITS2[5,6]等用于隐孢子虫基因分型的遗传标记。

另有一些基因如GP60,double2st randed RNA已用作隐孢子虫基因亚型分析的遗传标记[7,8]。

但根据目前的资料来看,选用不同基因构建的基因系统树会有一定的差异,因此有必要选用更多的基因作为遗传标记来研究隐孢子虫种系发育关系。

本文选用编码线粒体功能性蛋白CPN60的核基因进行隐孢子虫种系发育分析,并与18S rRNA和HSP70基因构建的进化树结果[9]相比较,进而评价其是否更适合作为隐孢子虫基因分型和种系发育分析的有效基因座。

1　材料与方法
111　隐孢子虫卵囊样品
RP HN:河南人源隐孢子虫分离株,分离自郑州大学第一附属医院;SUCP:河南许昌猪源隐孢子虫分离株;AM HN:河南鹌鹑源C.meleag ri dis分离株;AB HN:河南鹌鹑源 C.bailey i分离株;WB2 HN:河南乌鸡源隐孢子虫分离株;G B HN:河南固始鸡源隐孢子虫分离株,均由本实验室保存。

112　主要试剂
Toyobo Mag Ext ractor2Genome DNA Kit (Toyobo Co.Ltd.,Tokyo,J apan),Toyobo Ma2 gExt ractor PCR&Get Clean up DNA K it(Toyo2 bo,Osaka,J apan,P K2601)、Toyoboo K od2Plus PCR K it(Toyobo,Osaka,J apan,KOD2201)、λ2 Eco T14Ⅰdigest DNA Marker(大连宝生物工程技术公司)。

113　隐孢子虫卵囊纯化及基因组D NA提取
参照文献[9]方法纯化卵囊并提取DNA。

114　扩增CPN60基因部分序列的引物设计
根据GenBank中CPN60的参考序列资料:C. p arv um(A F082520),C.homi nis(XM_662631), Pl asmodi um f alci p arum(PFU38963),Pl asmodi2 um yoelii(A F103898),Tox opl asm a gondii
(A F065609),T ry p anosom a cruz i(XM_814415), Eu glena g racilis(EGU49053),L eishm ani a (L MU59320),T richomonas v agi nalis(U57000), Ent amoeba histol y tica(A F029366),Gi ar di a i ntes2 ti nalis(A F029695),在序列保守区域设计一对属特异性引物,预期扩增片段约为1100bp。

上游引物: 5′2GA GGAAAA GCCA GGAAA GAAA T GT23′;下游引物:5′2TCA GTA TCA GAA TA TCCACCAA TC 23′,稀释成50μmol/L的工作浓度。

115　PCR反应体系与扩增程序
CPN60扩增反应体系按Toyobo K od2Plus PCR K it推荐50μL体系配制,其中含有200μmol/L dN TPs、1×PCR buffer、1mmol/L MgSO4、上下游引物各015μmol/L和1U KOD2 PL U S DNA聚合酶。

反应参数:94℃预变性5min; 94℃45s,5013℃60s,72℃1min,35个循环;72℃延伸10min。

反应结束后,样品于4℃保存。

116　PCR产物的鉴定和测序
PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。

用Toyobo MagExt ractor PCR&Get Clean up DNA纯化试剂盒直接对PCR产物纯化,纯化产物送大连宝生物工程技术公司进行测序。

117　系统发育分析
在GenBank上用Blast进行搜索,下载同源性较高的相关序列,用Clustal X1181程序[10]对测定的不同隐孢子虫的CPN60基因序列与相应序列进行比对,然后用PAU P410[11]程序中邻接法(Neigh2 bor2joining,NJ)和最大简约法(Parsimony)构建进化树,用TREEPU ZZL E程序Version411构建最大似然树(Maximum Lilelihood),分析不同隐孢子虫之间的进化关系。

邻接法距离矩阵用Tamura-Nei模型运算,最大简约树用branch and bound模型分析,用自展值检验(Boot st rap test)估计所构建系统树的可靠性,重复次数为1000。

并用Tree View[12]绘制进化树。

同时用DNAStar软件对不同序列进行同源性分析,用PAU P410分析不同分离株之间的遗传距离。

并与基于18S rRNA和HSP70基因序列分析的隐孢子虫种系发育关系[9]进行比较,进而评价CPN60作为隐孢子虫基因分型和进化关系的分子标记的有效性。

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2　结　果
211　CPN60基因序列扩增、测序结果
扩增结果表明6个分离株均能扩增出阳性特异条带,片段大小约1100bp(图略)。

经测序各隐孢子虫分离株CPN60序列长度见表1。

212　以CPN60基因序列构建隐孢子虫种系发育分析结果
通过TREEPU ZZL E构建的ML树和PAU P 410绘制的NJ、MP进化树,分析结果基本一致,本文只列出NJ树,见图1。

在3种进化树上隐孢子虫分离株分为2个群:一个是寄生于哺乳动物的隐孢
表1　河南各隐孢子虫分离株CPN60扩增片段长度
T able1　The length of amplif ied CPN60sequence of Cr yptos poridia isolates collected in H enan province
分离虫株Cryptosporidia isolates
寄生宿主
Parasite2hosts
种/基因型
Species/G enotypes
扩增片段长度/bp
Amplified f ragment length/bp
RP HN病人Patient C.parvum鼠基因型1105 SUCP猪Swine C.suis1114 AM HN鹌鹑Quail C.meleag ri dis1382 AB HN鹌鹑Quail C.bailey i1089 WB HN乌鸡Sooty chicken C.bailey i1090 G B HN固始鸡Gushi2chicken C.bailey i1114
子虫,包括C1homi nis、C1p arv um牛基因型、RP HN和SUCP,另一群是寄生于禽类的隐孢子虫,包括C1bailey i和C1meleag ri dis,而且经Boot st rap分析,其节点的支持值均在90%以上。

　
在进化树上WB HN、G B HN、鹌鹑源隐孢子虫2个分离株(AB HN和AM HN)处在同一分枝上。

在同源性上,AM HN与WB HN和G B HN之间CPN60核苷酸序列的同源性均为100%,经PAU P410分析这4个禽类隐孢子虫分离株的遗传距离均为0。

在寄生于哺乳动物的隐孢子虫中RP HN与SUCP之间的亲缘关系最近,单独处于同一分枝,经Boot st rap分析,在3种不同进化树上其节点的支持值分别为99(NJ)、79(M P)和84(ML),其中C1 homi nis和C1p arv um牛基因型作为两者的外群。

在同源性上RP HN和SUCP之间的同源性为100%,遗传距离为0;RP HN与C1homi nis和C1 p arv um牛基因型的同源性分别为9819%、9911%; SUCP与后两者之间的同源性分别为9819%和9910%,而C1homi nis和C1p arv um牛基因型之间的同源性为
9817%。

因此通过CPN60基因序列同源性分析隐孢子虫不同基因型之间也存在着一定程度的差异。

图1　河南隐孢子虫分离株CPN60基因序列与其它相应序列两两比对后,用T amura2N ei距离模型
根据邻接法(N J)构建的隐孢子虫进化关系;
1000个重复采样的B ootstrap(BP)值大于80%
的分别标在相应节点上
Fig11　E volutionary relationships of Cr yptos poridium
isolates inferred by N J analysis b ased on T amu2
ra2N ei distances calculated from pairwise com2
parisons of p artial CPN60gene sequence.V al2
ues of B ootstrap support(80%)from1000
replicate samples are indicated at the supported
node
3　讨　论
311　动物源隐孢子虫线粒体编码基因的扩增
在已完成的两种隐孢子虫基因组工程中,已经推断出一些核基因编码线粒体功能性蛋白[13,14]。

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　11期王进产等:用CPN60基因序列研究隐孢子虫种系发育关系
在C1p arv um基因组工程中已经分析到有17种蛋白编码基因可能定位于线粒体[13]。

但在其他隐孢子虫种有关线粒体存在与否的报道很少,本试验选用在2个基因组工程中都存在的线粒体功能性蛋白基因CPN60作为研究对象,在人源隐孢子虫分离株RP HN、猪源隐孢子虫分离株SUCP、鹌鹑源隐孢子虫AM HN分离株、鹌鹑源隐孢子虫AB HN分离株、乌鸡源隐孢子虫分离株WB HN和固始鸡源隐孢子虫分离株G B HN均能成功扩增这一基因。

本实验室曾用18S rRNA和HSP70基因序列进行种系发育关系分析[9],其结果如下:河南人源隐孢子虫分离株RP HN为C1p arv um鼠基因型,猪源隐孢子虫分离株SUCP为C1s uis,河南乌鸡源隐孢子虫分离株WB HN和鹌鹑源隐孢子虫AB HN分离株均为C1bailey i,鹌鹑源隐孢子虫AM HN分离株为C1meleag ri dis,这2个基因目前是隐孢子虫种系发育分析中最具代表性的。

将CPN60基因分析结果与之对比,说明人源C1p arv um鼠基因型、猪源C1 suis、禽源C1meleag ri dis和C1bailey i也存在线粒体功能性蛋白CPN60,这一结果从分子水平证明了在动物源隐孢子虫分离株中仍保留线粒体细胞器的某些功能。

312　根据隐孢子虫河南分离株CPN60基因序列研究隐孢子虫种系发育关系
C1homi nis和C1p arv um(基因2型或牛基因型)两种隐孢子虫基因组工程已经完成[13,14],均发现线粒体蛋白CPN60的编码基因,其序列长度均为1857bp,其核苷酸序列的同源性为9817%,在本试验扩增的CPN601162bp区域中,其序列同源性也为9817%,而在18S rRNA全序列中,C1homi nis 和C1p arv um牛基因型的同源性为9914%,在HSP70基因2000bp左右序列中两序列的同源性为9813%,因此CPN60基因序列可把C1homi nis 和C1p arv um牛基因型分开。

因此,该基因是否可用于某些类群种下分类或基因亚型分类尚有待于大量分离株的验证。

本试验首次选用该基因部分片段作为隐孢子虫种系发育分析研究,结果表明SUCP与C1homi nis 和C1p arv um牛基因型的同源性为9819%和9910%,同源性均高于通过18S rRNA和HSP70基因序列分析SUCP与两者之间的同源性[9]。

因此, CPN60基因序列的保守性比18S rRNA和HSP70基因序列高,但仍能把河南猪源隐孢子虫分离株SUCP(C1s uis)与C1homi nis和C1p arv um牛基因型分开。

隐孢子虫另2个分离株RP HN和SUCP通过18S rRNA和HSP70基因序列分析分别为C1p arv um鼠基因型和C1s uis,两分离株在18S rRNA和HSP70基因序列的同源性分别为98%和9216%[9],而通过CPN60基因序列分析两者的同源性为100%,因此通过线粒体功能性蛋白CPN60基因序列不能有效把C1p arv um鼠基因型和C1s uis这2个分离株分开。

AB HN(C1bailey i)与C1homi nis和C1p arv um牛基因型的同源性分别为9610%和9613%,而通过18S rRNA和HSP70基因序列分析河南鹌鹑源C1bailey i与后两者的同源性分别为9612%、9612%和8514%、8411%[9],因此CPN60基因序列分析结果与18S rRNA和HSP70基因序列分析结果一样,能把C1 bailey i同C1p arv um、C1homi nis区分开。

因此,线粒体CPN60基因序列不仅可以作为隐孢子虫种类鉴定和基因分型的基因座,又能发现隐孢子虫一些新的遗传特性。

但由于分离到隐孢子虫分离株较少,GenBank登录的相关序列也较少, CPN60是否比18S rRNA和HSP70基因序列更适合作为隐孢子虫基因分型和种类鉴定的基因座还难以定论,因此CPN60基因序列作为隐孢子虫分类和种系发育关系的可靠性还有待于进一步的研究。

313　火鸡隐孢子虫的进化地位
文献报道感染禽类的隐孢子虫有3个有效种[15],即C1bailey i、C1meleag ri dis和C1galli。

国内报道感染禽类的隐孢子虫有2种,即C1bai2 ley i、C1meleag ri dis,其中C1meleag ri dis在国内仅在鹌鹑体内分离到。

本试验分离到的鹌鹑源隐孢子虫有2种,通过18S rRNA和HSP70基因序列分别为C1bailey和C1meleag ri dis[9]。

鹌鹑源C1 melea g ri dis的进化地位在CPN60基因序列构建的进化树与18S rRNA基因序列和HSP70基因序列构建的进化树存在较大的差异。

在CPN60基因序列构建的进化树上,鹌鹑源C1meleag ri dis与C1 bailey i的亲缘性较近,而在18S rRNA和HSP70基因序列构建的进化树上鹌鹑源C1melea g ri dis与C1p arv um的亲缘关系较近。

在同源性上,通过CPN60分析,河南鹌鹑源C1meleag ri dis与C1 homi nis和C1p arv um牛基因型的同源性为9611%和9615%,与河南鹌鹑源C1bailey和河南乌鸡源C1bailey i的同源性分别为99%和100%,
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因此C1melea g ri dis与C1bailey i的同源性高于与C1p arv um和C1homi nis的同源性;而通过18S rRNA和HSP70基因序列分析,C1melea g ri dis与C1p arv um和C1homi nis的同源性明显高于与C1 bailey i的同源性。

这一点说明C1meleag ri dis在其基因上具有独特遗传特性,有些基因与C1bai2 ley i同源性高,有些基因与C1p arv um同源性高,从这一点似乎可以解释为什么C1melea g ri dis既可以寄生于禽类又可以寄生于哺乳动物。

从寄生的宿主范围上,火鸡隐孢子虫是唯一一种既可寄生于禽类又可寄生于哺乳动物(包括人)的隐孢子虫,说明C1meleag ri dis具有独特的宿主特异性。

2000年Sreter等[16]通过形态学、细胞培养、分子种系发育等方面系统研究了C1melea g ri dis的生物学特性,认为C1melea g ri dis与小球隐孢子虫(C1p arv um)关系非常紧密。

但本试验通过线粒体功能性蛋白CPN60序列分析时,C1melea g ri dis与C1bailey i的关系非常紧密。

这一点又证实了C1 melea g ri dis作为独立种的有效性,但本实验室仅分离到1株C1meleagri dis,其它C1meleagri dis分离株是否也具有相同的特性还有待于进一步的研究。

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