一种简便实用的限制性核酸内切酶定量测活方法1)
实验八 限制性内切酶酶切DNA及分析
5.结果观察与分析 5.结果观察与分析 关闭电源，取出凝胶，在凝胶成像仪中观察DNA 关闭电源，取出凝胶，在凝胶成像仪中观察DNA 的迁移位置，并讨论实验结果。判断CS与哪一个DNA CS与哪一个 的迁移位置，并讨论实验结果。判断CS与哪一个DNA 样品是同一个样品，找出罪犯。 样品是同一个样品，找出罪犯。
4.酶切产物的琼脂糖电泳 4.酶切产物的琼脂糖电泳 （１）琼脂糖凝胶制备（１％）：称0.2g琼脂糖粉，加入20ml 琼脂糖凝胶制备（ ％）：称0.2g琼脂糖粉，加入20ml 琼脂糖粉 0.5XTBE电极缓冲液 水浴加热融化，冷却至50 60℃时 电极缓冲液， 500.5XTBE电极缓冲液，水浴加热融化，冷却至50-60℃时，加入 适量EB 混匀倒入铸胶盘中，冷却后凝胶即形成。 EB， 适量EB，混匀倒入铸胶盘中，冷却后凝胶即形成。(注：现在 所用胶模每块胶只需20ml即可) 20ml即可 所用胶模每块胶只需20ml即可)。 取已制备好的酶切DNA样品， DNA样品 （２）取已制备好的酶切DNA样品，用移液器将样品小心地加 入点样孔。 入点样孔。 盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用120 120伏 （３）盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用120伏）， 电泳40分钟。 40分钟 电泳40分钟。
操作步骤： 操作步骤： 1.DNA样品的制备 含样品序列的质粒DNA提取（CS,S1-S4)； 样品的制备： DNA提取 1.DNA样品的制备：含样品序列的质粒DNA提取（CS,S1-S4)； 2.质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测； 2.质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测； DNA样品的酶切反应 3. DNA样品的酶切反应 设置DNA样品的双酶切反应，按下列顺序加样（体积：μl）： DNA样品的双酶切反应 设置DNA样品的双酶切反应，按下列顺序加样（体积：μl）： 反应管 样品DNA 样品DNA 10 反应缓冲液（10X） 反应缓冲液（10X） 2 双蒸水 6 EcoRⅠ 1 PstⅠ 1 总体积 20 加完反应液，温和混匀，置于37℃水浴中反应1. 小时， 37℃水浴中反应1.５ 加完反应液，温和混匀，置于37℃水浴中反应1.５小时， 取出后瞬时离心， 4ul上样缓冲液 混匀， 上样缓冲液， 取出后瞬时离心，加4ul上样缓冲液，混匀，所有样品加入上 样孔。 样孔。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
限制性内切酶的说明
限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。
因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。
二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。
被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。
例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。
另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。
2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。
即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。
Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。
并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。
限制性核酸内切酶
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变 的菌株。
3. 温度
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。
粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割， 有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。
粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或 同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。
粘性末端和平齐末端的动画对比
四 限制性内切酶的识别序列
• EcoRⅠ的识别序列 GAATTC
•
CTTAAG
• Hind Ⅲ的识别序列 AAGCTT
•
TTCGAA
• BamHⅠ的识别序列 GCATCC
•
CCTAGG
• 从以上举例的各种限制性酶切酶的识别序列看出， 它们具有共同的规律性，呈旋转对称或二重互补 对称。
• 有的限制性酶切酶可识别两种以上的核酸 序列。
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大 多数是37oC，少数要求40-65oC。
酶
最适 温度oC
酶
最适 温度oC
酶
Apa I 30 Apy I 30 Ban I Bcl I 50 BstE II 60 Mae I Mae II 50 Mae III 55 Sma I Taq I 65
最适 温度 oC
特性
限制和修饰活 性
内切酶的蛋白 结构
I类内切酶 单一多功能的酶 3种不同的亚基
限制性核酸内切酶详细资料大全
限制性核酸内切酶详细资料大全限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对在每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
基本介绍•中文名：限制性核酸内切酶•外文名：Restriction endonuclease•作用：切割DNA•别名：限制酶限制性内切酶定义,由来,分布区域,分类性质,用途,命名,类型,第一型限制酶,第二型限制酶,第三型限制酶,生理意义,定义是识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
由来一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株（品系）。
例如，从Bacillus amylolique faciens H 中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindⅡ、HindⅢ，HpaI、HpaⅡ，MboI、MboⅡ等。
限制性核酸内切酶别名：Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。
它能识别外源DNA并将其降解。
单位定义：在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
性状制品不含非专一的核酸水解酶（由10单位内切酶与1μg λDNA，保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示），这类酶主要是从原核生物中分离出来的，迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4000种限制酶。
限制性核酸内切酶
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用 ppt课件
2、Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割 某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别
序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重 组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则： 第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细胞的种名 第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
ppt课件
3
限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶： 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
解决方法
1.标准底物检测酶活性
2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3.检查反应系统是否最佳
4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重 新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌 株
5. 换 用 不 同 切 割 非 甲 基 化 位 点 的 同 类 酶 消 化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增
10chenli?结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向orientationl在选择限制性内切酶时应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要
限制性核酸内切酶相关知识总结范文限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶相关知识总结范文限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它的功能是能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶(简称限制性内切酶或限制酶)。
它不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNae），限制性核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类，即所谓Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶，基因工程最常用也是高中生物所指的限制性核酸内切酶即为Ⅱ型酶。
新课标高中生物必修2――遗传与进化模块中“基因工程及其应用”这一节对限制性核酸内切酶作了一定的介绍，但笔者在教学过程中发现部分学生概念有些模糊，做题准确率不高。
因此笔者总结了有关限制性核酸内切酶的知识点，并结合近年来的高考真题，对该酶作一次较为详细的总结。
1.限制性核酸内切酶的相关知识点限制性核酸内切酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。
一般情况下，不同的限制性核酸内切酶具有不同的识别序列和酶切位点。
但这并非绝对，部分限制性核酸内切酶具有相同的识别序列，但切割的位点不同，如某maI和SmaI都识别六核苷酸CCCGGG，然而它们的酶切位点分别是C↓CCGGG和CCC↓GGG；有些限制性核酸内切酶不但具有相同的识别序列，连酶切位点都一样，如BamHI、BglⅡ、BtI这三种酶，它们的识别序列及切割位点都为G↓GATCC。
不同的限制性核酸内切酶切割双链DNA所形成的末端通常是不同的，有的酶切割后切口是平的，即形成平末端，如AluⅠ和HaeⅢ。
有的切口可带有一个短的单链末端，即黏性末端，如EcoRⅠ和HindⅢ。
有些限制性核酸内切酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamHI(G↓GATCC)和BglⅡ(A↓GATCT)，由此产生的DNA片段可借黏性末端相互连接，使DNA重组在操作时具有更大的灵活性。
检测内切酶活性的方法有
检测内切酶活性的方法有
内切酶活性是指酶在特定条件下切割DNA 分子的能力。
以下是几种常见的检测内切酶活性的方法：
1. 凝胶电泳法：将切割后的DNA 样品与未切割的DNA 样品一起置于凝胶中，然后通过电场使DNA 在凝胶中移动，最后根据DNA 片段的大小分离和检测。
2. 荧光探针法：使用特定的荧光探针标记DNA，当内切酶作用于DNA 时，片段的结构发生改变，导致荧光发生变化。
通过测量荧光强度的变化来检测酶的活性。
3. 放射性探针法：使用放射性同位素标记DNA，当内切酶作用于DNA 时，放射性同位素会与DNA 分子结合，通过放射性检测方法，如闪烁计数器，来测量酶的活性。
4. 酶切位点测定法：利用已知DNA 序列和内切酶的酶切位点信息，通过酶切反应后的片段大小的比较，来确定内切酶的活性。
这些方法都可以用于检测内切酶的活性，选择适合实验条件和需求的方法进行检测。
PfAgo核酸内切酶活性检测方法-最新国标
Pf Ago核酸内切酶活性检测方法1范围本文件描述了Pf Ago核酸内切酶活性的检测方法。
本文件适用于Pf Ago核酸内切酶活性的检测。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T191-2008包装储运图示标志GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法。
3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.1Pf Ago核酸内切酶Pf Ago endonucleasePf Ago核酸内切酶是一种依托向导DNA序列（guide DNA，gDNA）与靶核酸序列碱基互补配对，继而特异识别并剪切靶核酸的核酸内切酶。
3.2Pf Ago核酸内切酶活性单位activity unit of Pf Ago endonuclease在25μL反应体积中，95℃条件下反应，每分钟剪切0.1nmol单链靶核酸DNA所需的Pf Ago蛋白量，定义为一个活性单位(U)。
4原理Pf Ago核酸内切酶是一种依托向导DNA序列（guide DNA，gDNA）与靶核酸序列碱基互补配对，继而特异识别并剪切靶核酸的核酸内切酶，其可以在5’磷酸化的单链gDNA(大于15nt)引导下剪切与gDNA互补的单链DNA底物，从而发挥核酸内切酶作用。
剪切位点常发生在底物与gDNA互补序列的第10位和11位之间的磷酸二酯键处。
根据Pf Ago核酸内切酶的作用原理，在25μL反应体积，95℃反应条件下，单位时间内消耗0.1nmol单链靶核酸DNA的Pf Ago蛋白量来进行活性测定。
5试剂或材料5.1水符合GB/T6882规定的RNase-free超纯水。
5.21mol/L Tris-HCl（pH8.0）按配制所需量，用分析天平称取Tris12.114g，加入80mL超纯水中，充分混匀后用6M盐酸调至pH值8.0±0.05，加入超纯水定容至100.0mL，并用0.22μm微孔滤膜对其过滤，存储于2～8℃，储存期限为24个月。
DNA的限制性酶切实验原理
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常用的电泳缓冲液
常用的6X载样缓冲液 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
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4℃ 保存备用.
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三 材料、设备及试剂
质粒 ：pUC118、pEGFP 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
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溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
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琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
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找出相应的 Ｄ Ａ含量。从产物含量的增加 Ｎ
量或底物含量的减少量来求得酶活力。
结 果 与 讨 论
（ 一）底物 ＤＮ 的标准 曲线 Ａ 以 几
Ｄ ＮＡ制作标准曲线， 反应液中不加酶液 。标 准曲线的含量范围为０ ７－１０ ｌ， ． ５ ． ０ 在此范 ０ ０ ｕ ｇ
围内， Ｎ 含最与 Ａ Ｄ Ａ Ｓ有很好的线性关系。 结
Ａ Ｓ为负片上样品黑度与背景黑度之 差，Ｃ为 样品的含量， 单位为 ｊ ， ｕ ｒ ｇ 为反衬度， 是与感光 板性质有关的常数， 为自吸收系数， ｂ 。为与样 品激发有关的参数， 在一定实验条件下， 与 ａ ｂ 均为常数。由此可见， 根据以上公式， 则可定量 侧定酶反应后产物 Ｄ ＮＡ 带含量的增加量， 或 底物 Ｄ ＮＡ 带含量的减少量， 从而能定量测定 限制性内切酶的活力。
影响
以０ ５ｇ Ｎ ． １ ２ Ａ为样品，电泳后胶 ２ｃ Ｄ
我们又以 Ｉ Ａ为底物， Ｄ Ｎ 测定了 Ｐｌ ｓ １酶 的 Ｋ 值。反应速度用底物的减少量表示。 ｍ 通 过测定底物剩余带的黑度，在标准曲线上查出
板分别放置 １ 小时， －６ 并且依次拍照，结果如 图３ 所示。从图 ３ 中可见，荧光强度随放置时 间的增加而减弱。结果表明，在电泳以后 ４ 小
２
ｌ Ｊ Ｊ
３
４
５
七丁ｘ （） － １ Ｍ－ ０ ｌ ８
０ ０２ ． ０４ ． ０６ ． ０８ ． １０ ．
酶 单位
图 ４ 限制性核酸内切酶 Ｂｐ Ｋ 值的 ｓ ６１ｍ ３ 改良 倒数图 双
图 ２ 限制性核酸内切酶 Ｅ ｏ ｃＲ Ｉ的酶浓度实验
（ 三）电泳后凝胶放置时间对荧光强度 的
ｔ ｎ ｉ Ｅｎｄ ｎ ｌ ｓｓ ｏ ｏ ｕｃｅ２ｅ
需要昂贵的仪器，故它们的使用范围受到一定
３４
１ ）本工作曾得到本校化 学系分析化学教研室张 悟 铭、半 振环同志的 帮助 ， 在此谨致谢忱。 本文于 工８ 年 ６月 ２ ９６ １日收到。
置测微光度计上进行测定，以此来对酶活力进
行定量。
ＩＮ ． Ｄ Ａ谱带移近狭缝， 利用微动螺旋使谱带慢
时内拍照，结果均较为满意。这使我们既能保
３ ６
［ ］ Ｍｘ ｉ ， 。 ａ ： ６ Ｊ Ｂｏ Ｃ ｅ ． ２１ ， ｉｒｈ Ｐ， 。 ｌ １７． ｉ ． ｍ， ， ｌｃ ． ． ９ ． ｉ ｈ ５
５６ ８ ６－
的标本能获得较多的中期分裂相，染色体分散 好， 形态佳， 更重要的是该方法制作的标本经一 系列处理后， 可进行染色体显带， 故而空气干燥 法被现代细胞遗传学研究广泛采用。节肢动物 由于细胞来源不丰富， 细胞培养又很困难， 所以 在染色体研究方法上受到了很大的限制。 Ｃｏ ｒ－
ｚｒ１６） ｉ（９８最早发明了一种适于昆 ｅ 虫染色体制
图 １ Ｄ Ａ 的 Ｉ Ｎ 标准曲线
曝光的乳胶部分，校正零点。随后测出琼脂搪
凝胶的黑度值 （０ Ｓ ）作为背景扣 除。 最 后将
此方法在 Ｄ ＮＡ 含量超过一定范 围会偏 离线性关系。另外，底片的曝光和显影等实验 条件要严格控制， 以避免误差。 （ 二）限制性核酸内切酶活力定ｔ测定 的
３５
结果 以不同量的酶作用于一定量的底物， 证良好的结果，又有充分的准备拍照的时间。 严格控制反应条件，酶切后谱带呈现的荧光强 （ 四）酶动力学常数 Ｋｍ 值 测定的结果 度不同，反映在照相负片上的黑度也不同。我 我们以 ｐ Ｒ ２ Ｄ Ｂ ３２ ＮＡ为底物， 测定３ Ｂｐ ＇ ｓ 们以限制性核酸内切酶 Ｅｏ ｃＲ Ｉ为例，用不同 ６ １酶的 Ｋ 值。反应速度 （）用单位时间 ３ ｍ Ｖ 量的酶作用于一定量底物 ｐＲ２ Ｄ Ａ 测定 内产物的增量表示。通过测定产物带 的黑度， Ｂ ３２ ， Ｎ 产物带的黑度， 换算成相应的产物含量， 用酶活 在标准曲线上查出对应的产物含量，作改良双 力单位与产物含量作图 （ ２。结果表明，它 倒数图，结果如图 斗 图 ） 所示。求 得其 Ｋ 值为 ｍ
备的空气千燥法Ｕ 这种方法既保证了在制作 １ ０
过程中不致使细胞丢失，又保持了常规空气干 燥法的优点， 特别适于少量细胞的染色体制备， 尤其果蝇的染色体研究（ 本文首次将此方法 ３ １ 。 用于蟀瞒染色体的研究 ，取得了较好的效果。 参 考 文 献
染色体。我们曾采用压片法对恙蟠生活史各期
进行过观察 ，结果显示 ， 幼虫、 卵、 若蛹、 旱期若
１ 一 １ ３． ７１ ７
［ ，］ Ｓｉ ｉ Ａ ｅ Ａ ： ８． Ｍ ｄ Ｐ ｌ ２（ ）６６一 ｈｒ ， ｔ １ ４ Ｊ ｅ ． ． １５： １ ａ ． ． ９ ． ａ ，
６７ １．
［ ］ Ｖ ｎ ｒｕ ｅ Ｆ 。Ａ． ８． ｉ Ｔ ｃｎ ｌｇ ， ６ ａ Ｂｅｇｌ ．Ｍ ． １ ０ Ｓａｎ ｅｈ ｏｏ ｙ ， ９ ｔ
们之间有良好的线性关系。我们还以 Ｉ Ａ Ｄ Ｎ
为底物， 酶反应后测定剩余底物的黑度， 换算成 相应的剩余底物的含量，作 Ｅｏ ｃＲ Ｉ的酶浓度
实验， 亦得到良好的线性关系。
０６ ．
１３ Ｘ ０８ ．３ １－ Ｍ，
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慢经过狭缝， 此时黑度标尺亦有移动， 读取最大
此方法的简单原理是根据 Ｄ Ａ与澳化 Ｎ
乙锭 （＇ Ｅ ）结合形成荧光络合物， Ｂ 在一定条件 下， 其荧光强度与 Ｄ Ａ 的含量成正比。由于 Ｎ
数据即为此谱带的黑度值 （） Ｓｏ
ＡＳ 二 Ｓ一 Ｓ Ｏ
负片上 Ｄ Ａ谱带的黑度 （）是谱带荧光强 Ｎ Ｓ
度的函数， 因此， 通过侧量谱带的黑度，最终可
１０ ０ 即 ｓ ｃ ７ ０ ６ ０ 伪
段进行分离， 压为６ ／ 电 Ｖ ｃ， ｍ
（ 二）凝胶板拍照 电泳后的凝 胶板置
心
５ ０
４ ０ ３ ０ ２ ０
于２４ｍ的紫外灯下照射３ 分钟，以便充分 ５ｎ ０ 激发， 然后用１５ ３ 照相机拍照（ 加红色滤光片） ，
并需采用同一牌号的全色胶卷及严格控制曝光 时间， Ｄ １ 显影液显影 ３ 分钟， － 定影 用 －９ ． ， Ｆ５ 液定影 １ 分钟， ５ 温度为 ２９ｏ ０ ｃ
（ 四）酶活力的定ｔ侧定 在酶 活力的 定量测定中，每 次需同时 做一 条标准 曲线
（． ５ ． ０ｇ，或带一个标准管。 目 ０ ７－１ ０ｐ） ０ ０ 的是
使待测凝胶板与标准曲线凝胶板在同一张底片 上拍照，降低误差。然后测量胶片上产物带的 黑度或未切底物谱带的黑度，对照标准曲线查
确定一个谱带所相应的 Ｄ Ａ含量。 Ｎ 根据ｕ Ａ 一；城 Ｃ十， 。 ＇ Ｓ ｂ 蜿 ，在式中
进食的雄虫减数分裂达高峰。因此， 我们认为， 研究恙蟒有丝分裂染色体， 材料以化蛹 １ 天 －３ 的成蛹为佳， 容易获得形态较好、 数较多的有丝 分裂中期相。 而要观察减数分裂和精子形成，
则以老熟成蛹或早期雄虫为好。
〔） 周 ２ 洪福等： ８０遗传， （）４） １３ ９ ５５： ５
【 ］ 北京大学生物系遗传教研室：９４ 遗传学实验技太和 ３ １８ 方法， 高等教育出版社，１７ ２６ ９ 一 ０． ［ ］ Ｃｏｉ ， Ｈ ： ６ ． ａｎ ｅｈ ｏ ｇ ， （） ４ ｒｚ ｒ Ｒ ｅ ． ． １ ８ Ｓ ｉ Ｔ ｃｎ ｌ ｙ ４ ３： ９ ｔ ｏ ３
虫均未能观察到染色体和分裂相细胞，老熟若 虫休内性腺开始发育， 偶可见有丝分裂细胞， 但
数：极少。 － ． 进人成蛹期后 ， 恙瞒体内生殖细胞的
有丝分裂旺盛，此时制作标本较易获得满意的 结果。５ 天龄的成蛹已趋成熟， －６ 有丝分裂减
弱， 减数分裂日趋旺盛并开始形成配子， 羽化后
【 ］ 廖翻溶 等：９ １ 动物学研究，２２：３一１３ Ｌ １８． （ ）１７ ４．
相应 余底 量； 的剩 物含 进而推 底 减少 算出 物的
量。其双倒数图亦有良好的线性关系。 我们认为本方法是一个可靠、实用的限制 性核酸内切酶定量测活方法。采用这种方法可 对限制性核酸内切酶进行多种酶 学方面 的研 究。所用的测微光度计乃为一般光谱分析之常 规仪器，具有操作简便、负片测定不受时间限 制， 样品用量少 （０８） １－ 的特点。 ９ 参 考 文 献
果见图 １ ａ
材 料 和 方 法
快速测微光度计为蔡司Ｉ型 （ｅｓ 东 Ｉ Ｚｉ Ｉ ｓ Ｉ ， 德产） 又 ＮＡ， Ｒ 。 Ｄ Ｅ口 Ｉ酶为北京生物物理所 ｃ
生物化学工厂产品 ｓ ６１ Ｐｒ 。Ｂｐ 和 ｓ 酶为本 ３ Ｉ
实验室制备。其他试剂为分析纯。 （ 一）酶切 ＤＮ 片段的电泳分离 Ａ 酶 切反应系统见文献〔） ２０采用 １ ％琼脂糖凝胶 ． ２ （ ０ Ｋ Ｅ ／ｌ 含 ． ｇ ｍ）平板电泳， ５ Ｂ 将酶切 Ｄ ＮＡ片
３７． １６
“ 一 １一 Ｚ ３ ４ ５ 啥 一 ， －
Ｉ（ 间 ） 时
图 ３ 电泳后凝 胶放置 时间对荧光强度的 影响
［ ］ ｈｒ ｊｎ Ｊ Ｇ ： １ Ｇ ｎ Ａ ｌ ｉ ｔ ｎ ｄ ４ Ｃ ｉｋｉ ， ． １８． ． ｉａ ． ９ ｅ ｍｐｆ ａ ｏ ａ ｉｃ ｉ ｎ Ａ ａ州 ， Ｖ ｌ １ Ｒ ｓｉｉ Ｅ ｄｎｃｅｓ， ｅｉ ｎｌ ， ｏ． ｅｒ ｔ ｎ ｎ ｏｕｌ ｅ Ｅｓｖ ， ｔｃｏ ａ ｌ － ｃｒ ｒ Ｈｏ ａｄ Ｉｃ， ８－８， ｅＮ ｔ ｏ ｈ ｌ ｎ ， ． ｐ． ２ ｌ ｎ ｐ １
１ ０ １
０８１ ． ． ０ ２ ３ ４ ６ ８ Ｏ－ ５ Ｌ
（ 三）负片上 Ｄ Ａ 错带的定组测定 Ｎ
将负片放在测微光度计的谱片台上，用二块玻 板将负片夹住， 乳剂面向上。将玻板固定， 调节 仪器使玻片处在水平状态。调节聚焦螺旋使谱 线全部清晰， 选用黑度标尺， 把狭缝对准负片未
Ａ Ｎ ＃） １－ Ｄ Ａ（ ｘ １ ｇ ０