伪狂犬病毒上海株糖蛋白G(gG)基因的克隆及序列
四川农业大学硕士研究生毕业论文猪...
四川农业大学硕士研究生毕业论文猪伪狂犬病病毒ｇＤ基因生物信息学分析齄里皇口木１．ＰＲＶ野毒株的分离１．１ＰＣＲ检测ＰＲＶ特异常性检测将不同的病毒接种细胞后，待细胞出现部分病变后，用ＳＤＳ法将病毒的核酸抽提出来，用建立好的ＰＣＲ检测ＰＲＶ的方法对不同病毒的核酸模板进行扩增，主要是检测该检测方法的确种属特异性。
从ＰＣＲ结果看，仅有ＰＲＶ扩增出来特异的目的条带，而其它病毒的核酸抽提物中，只有引物二聚体，所以证明了该方法具有较好的种属特异性。
图２ＰＣＲ方法检测ＰＲＶ特异性电泳图Ｆｉ９２ｓｐ∞ｉ五ｃ姆ｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇＰＲＶｂｙ’ＰＣＲＭ．ＤＬ｝Ｏｏｏ１．ＰＲＶ２．ＰＲＲＳＶ３．ＨＣＶ４删５．ＪＥＶ６．ＰＣＶ７．空白细胞１．２ＰＣＲ检测病料ＤＮＡ的结果对１４个疑似病料的ＤＮＡ通过ＰＣＲ扩增检测，电泳检测有两个疑似病料（３。
、７８）扩增出来约３０５ｂｐ的特异性条带，将该两株病料定为阳性病料。
图３ＰＣＲ检测病料电泳图Ｆｉ９３Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇｐｉｇ’ｓａｂｏｒｔｕｓｂｙＰＣＲＭ１．ＭａｒｋＩ］Ｉ１．１＃病料２．２＃病料３．３＃病料４．硝病料５．５＃病料６．硎芮料７．７＃病料８．８＃病料９．９＃病料Ｍ２．ＤＬ２０００１．３ＰＲＶ野毒株的分离对ＰＣＲ检测为阳性的两株病料进行病毒分离后，使用ＶＲＥＯ细胞进行细胞培养，在盲传的第一、二代虽然细胞会出现细胞固缩、融合、堆积成小丘状、折光性增强等细胞异常现象，但是没有出现ＰＲＶ接种ＶＥＲＯ细胞后的明显的和特异的拉网病变现象。
在盲传的第三代ＶＥＲＯ细胞才出现ＰＲＶ接种后特异的细胞拉网现象。
由于该两株病料的分别采自四川的遂宁、邛崃，所以分别命名为ＳＳ株和ＳＱ株。
２ＰＲＶ＿ｇＤ基因的ＰＣＲ扩增采用ＳＤＳ蛋白酶Ｋ方法抽提ＰＲＶ病毒基因组ＤＮＡ，用ＰＣＲ对ＰＲＶ标准株Ｆａ疫苗株ＳＡ２１５株、７８３株扩增、哈尔滨株；早期分离的野毒株ＳＮ株、ＳＬ株、ＳＣＺ株、ＢＪｌＦ４株、ＤＧＢＳＦｌ、ＨＳＦ０株；本次实验分离的四川野毒株Ｓｓ株、ｓＱ株共计１２株病毒株进行了ＰＣＲ扩增，结果１２株毒株均获得了约１．２ｋｂ的特异性扩增条带。
猪伪狂犬病病毒基因序列分析
猪伪狂犬病病毒主要功能蛋白基因序列分析摘要:根据Genbank中已发表得猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、TK基因得序列各设计了1对引物,对分离得到得PRV毒株得gE、gG、TK基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期得PRV gE、gG、TK基因片段相符。
遗传进化树分析与氨基酸序列比对结果发现PRV毒株得gE、gG、TK氨基酸序列发生变化得位点与2012年国内分离到得PRV流行株相同,从而推测该毒株为PRV变异毒株。
关键词:伪狂犬病毒;gE基因;TK基因;序列分析猪伪狂犬(Pseudorabies,PR)就是由伪狂犬病毒(Peudorabies virus,PRV)引起得以家畜与多种野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为特征得急性传染病[1]。
该病在我国发生较为严重,就是严重危害我国养猪业得疫病之一。
我国目前广泛应用得就是自然缺失弱毒活疫苗Bartha-k61株,使猪伪狂犬病得到了很好得控制。
但就是,2011年底至2012年该病在中国东北部分省份流行,甚至在许多使用基因缺失活疫苗免疫得规模化猪场出现了猪伪狂犬病疫情,给中国得养猪业造成了巨大得经济损失[2-6]。
伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1型)属于双股线性DNA病毒,大小约150kb,DNA 基因组中G+C得含量高达73%,可编码100种蛋白质。
基因组由独特得长节段(UL)、独特得短节段(US)、内部倒转重复序列(IRs)与末端倒转重复序列(TRs)组成。
在病毒得结构蛋白中,gE糖蛋白就是主要毒力因子之一,并作为标志基因用来区分疫苗免疫与野毒感染。
TK基因不仅就是最主要得毒力基因,而且也就是决定病毒持续感染得重要因素[7]。
一旦TK基因缺失,PＲV变异株对宿主得毒力将丧失或明显降低。
2013年至2014年上海市农业科学院畜牧兽医研究所繁殖障碍研究室从山西某免疫猪伪狂犬病(Bartha)疫苗得规模化猪场成功分离并鉴定出四株PRV,命名为SX1,SX2,SX3,SX4株,为明确该四株分离株就是否属于PRV抗原变异毒株,本研究对PRV SX株得gE、gG、TK全基因进行克隆与测序,通过与国内外其她已公布PRV分离株得gE、gG、TK推导得氨基酸序列进行比对,构建核苷酸序列遗传进化树,以期为丰富PRV分子流行病学与开发科学有效得新型猪伪狂犬病疫苗提供重要科学依据。
伪狂犬病毒GDSH株的分离鉴定及gE基因的序列分析
摘 要 ： 广 东四会 某猪场分 离到一株疑为猪伪狂 犬病病毒（Ｒ ） 从 Ｐ Ｖ 的病毒． 病毒在猪 肾细胞上 出现 细胞 变圆、 拉 网、 融合等典型病变 ， 并具有 细胞泛嗜性特点 。在 ＭＤＣ 细胞上 测得 其 Ｔ Ｄ Ｋ ＣＩ 值为 １－ ０１ ， ０ｓ ． ／ ｍＬ 能被伪狂 犬病病毒 标 准阳性血清 中和。 ０１ｍＬ病毒液接种小鼠后发 生奇痒并麻 痹致死， 将 ． 接种猪 ３天后发病 ， ７天死亡． 从攻毒病死猪 的脑组织病理切片上观 察到 典型的病毒性脑膜脑 炎及血管套现 象。通过 Ｐ ＣＲ 扩增到 Ｐ 基 因． Ｒｖ 由此进一步证 明所分 离病毒为猪伪 狂犬病毒 ， 并命名为 Ｇ Ｈ株 。根据 Ｇ ｎ ａｋ中发表 的序 列， ＤＳ ｅＢ ｎ 设计一对扩增 Ｐ Ｒｖ 吐 基 因的特 异性 引物 ， 建立可以区分 Ｐ Ｒｖ 野毒株 与疫苗株 的 Ｐ Ｒ 诊断方法。 以此方法对病毒 的细胞培养液进行检测 ． Ｃ 结果证 实所分毒株为 Ｐ ｖ野毒株 ， Ｒ 经克隆测序后与 Ｇ ｎ ａｋ收 录的其 它 Ｐ ｖ ｇ ｅ Ｂｎ Ｒ Ｅ基 因序列进行 比较 ， 发现 所测毒 株的核 苷 酸 序 列 与 其 它 Ｐ Ｖ 毒 株 的 同 源性 介 于 ９ ． ￣ ９９ Ｒ ８ ％ ９． ３ ％之 间 ， 中与 Ｐ ห้องสมุดไป่ตู้ａ 的 亲缘 关 系最 近 为 ９ ． 其 ＲＶ Ｅ 株 ９％ ９ 关键词 ： 伪狂 犬病毒（ Ｒ ； 离鉴定 ： 基 因； Ｐ ｖ）分 吐 序列分析
表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果
-----------------------------------Docin Choose -----------------------------------豆 丁 推 荐↓精 品 文 档The Best Literature----------------------------------The Best Literature农业生物技术学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００７，１５（２）：１９２￣１９７＊基金项目：国家高技术研究与发展（８６３）计划课题（Ｎｏ．２００２ＡＡ２４１３４）资助。
＊＊通讯作者。
Ａｕｔｈｏｒｆｏｒｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．教授，博士生导师，主要从事动物分子病毒学与免疫学研究。
Ｔｅｌ：８６－１０－６２７３１２９６；Ｅ－ｍａｉｌ：＜ｙａｎｇｈａｎｃｈｕｎ１＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ＞．收稿日期：２００６－０６－１９接受日期：２００６－０８－２８·研究论文·表达伪狂犬病毒ｇＣ糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果＊陈振海，杨汉春＊＊，郭鑫，陈艳红（中国农业大学农业部预防兽医学重点实验室，北京１０００９４）摘要：通过双酶切将伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）Ｆａ株ｇＣ囊膜糖蛋白基因片段亚克隆到５型腺病毒ＡｄＭａｘ系统穿梭质粒ｐＤＣ３１６中，得到ｐＤＣ３１６－ｇＣ。
用此质粒与腺病毒ＤＮＡ辅助质粒ｐＢＨＧｌｏｘΔＥ１，３Ｃｒｅ共转染２９３细胞，包装出重组腺病毒Ａｄｖ－ｇＣ。
通过ＰＣＲ鉴定和病毒空斑纯化，得到纯的高效价Ａｄｖ－ｇＣ病毒液。
间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达ＰＲＶｇＣ蛋白。
该病毒经肌注免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。
攻毒试验表明，此重组病毒能提供１００％的免疫保护。
关键词：伪狂犬病毒；ｇＣ糖蛋白；重组腺病毒；免疫中图分类号：Ｓ１８８文献标识码：Ａ文章编号：１００６－１３０４（２００７）０２－０１９２－０６ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇＣＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＧｅｎｅｆｏｒＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇＶａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓＣＨＥＮＺｈｅｎ－ｈａｉ，ＹＡＮＧＨａｎ－ｃｈｕｎ＊＊，ＧＵＯＸｉｎ，ＣＨＥＮＹａｎ－ｈｏｎｇ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ＦａｓｔｒａｉｎｇＣｇｅｎｅｗａｓｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒｐＤＣ３１６ｔｈｒｏｕｇｈｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒｐＤＣ３１６－ｇＣａｎｄＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＤＮＡｈｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄｐＢＨＧｌｏｘΔＥ１，３Ｃｒｅｉｎｔｏ２９３ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇＣｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎｄｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｍａｒｋａｂｌｙｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ．Ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ，ｈｉｇｈｔｉｔｅｒｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡｄｖ－ｇＣｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｆｔｅｒＰＣＲｉｄｅｎ－ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｖｉｒｕｓｐｌａｑｕｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｇＣｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｉｎＭａｒｃ１４５ｃｅｌｌｓｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｔａｉｎ－ｉｎｇａｓｓａｙ．ＩｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｄｖ－ｇＣｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅＰＲＶｓｐｅｃｉｆｉｃｈｕｍｏｒａｌａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｍｉｃｅ．Ｉｎｔｈｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅｇｒｏｕｐｉｍｍｕｎｉｚｅｄｂｙＡｄｖ－ｇＣｐｒｅｓｅｎｔｅｄ１００％ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｓｃｏｎｔｒａｓｔｔｏ０％ｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｔｏｔａｌｌｙ，ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅａｇｏｏｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇａｎｏｖｅｌＰＲＶｌｉｖｅｖｅｃｔｏｒｖａｃｃｉｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ；ｇＣｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ；ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）引起的动物传染病。
α
第１ ７卷 ２期
２０ ０ ２年 ５月
中
国
病
毒
学
１ （ ：４ ７ ２） １ ９— １ ２ ５
Ｍ ａ ２ ０２ ｙ ０
Ｖ Ｉ 】』） ＣＡ ＳＩ Ｉ Ｒ（Ｉ ＧＩ Ｎ ＣＡ
伪狂 犬 病病 毒 上海 株 ｇ 和 ｇ 因的克 隆 及缺 失 转移 载体 的 构建 Ｅ Ｉ基
须的（ 。
［
但 各种 灭活疫 苗及 弱 毒 疫 苗对 该 病 的 防制 、
根除 及 对持 续 性 感 染 的 防 制 都 是 不成 功 的ｉ 随 ｔ Ｉ ｏ 着分 子 生物 学 的发 展 ， 一些 传 染 病病 原的 分 子 剖 对 析， 使致病 基因和 免 疫 保护 性 抗 原 基 因的 鉴 定 和分 离得 以 实 现 。 自 ２ ‘ Ｊ 。 ０世 纪 ７ ０年 代 以 来 ． 过 对 通 Ｐ Ｖ基 因组 的改造 已先 后研 制 了 多利 Ｐ Ｖ 基 固歃 Ｒ Ｒ 失疫 苗 。这些基 因缺失 疫 苗株有 的是缺 失病 毒的主 要毒 力基 因， 以降低其 毒力 ； 的缺 失 ｒ 有 病毒 的糖 蛋 白基 因 ， 而可 以通过 血 清学 等 方 法 将 疫 苗免 疫猪 从 和 自然感染野 毒猪 区 分开 来 ， 控 制并 最 终 消灭此 使 病成 为可能 。 ｇ 和 ｆ是 以 非共 价 键 形式结 合成 。Ｅ
ｐ ｒｉｌ Ｉｇ ｎ ｒ ｂａｎ ｄ ｂ ｏｙ ｒｓ ｈ ｉ ｅ ｃｉｎ Ｐ Ｒ）， ｕ ｓｑ ｅ ｔ ｌｎ ｄ ｉ ｔ ＧＥ Ｔ ａｔａ ｇ ｅ ｅｗｅ ｅｏ ｔｉｅ ｙ ｐ ］ｍｅａ ｅｃ ａｎ ｒａ ｔ （ Ｃ ｏ ｓ ｂ ｅ ｕ ｎ ｌ ｃｏ ｅ ｎ ｏｐ Ｍ ｙ
Ｍ ｕ ａ ｆ Ｐｓ ｕ ｒ ｂ ｅ ｒ ｓＳＨ ｔ ａ ｎ ｔ ｎｔｏ ｅ ｄ０ ａ ｉｓ Ｖｉ ｕ Ｓ ｒ ｉ
狂犬病毒分离株糖蛋白基因的克隆与序列分析
ａ ｈ ３ ａ ｉｏ ａ ｉ ｉｅ．Ｔｈｅ ｅ ｒ ｓ ｔ ｎ ｃ ｔｄ ｔ ｔｔ ｅ ＧＤ３３ ｉｏｌｔ Ｓ ｌＷ ｉ ｌｎｔｓ ａｎ． ｔｔ ｅ ３３ ｍ ｎ ｃｄ ｓｔ ｓ ｅ ｕｌｓｉ ｄｉａ ｅ ｈａ ｈ ｓ ａｅ ｉ Ｏ ｖｒ ｅ ｔ ｉ ｕ ｒ
Ｋｅ ｒ ｓ ｒｂｅ ｉ ｓ ｌｃ ｐｏｅｎ ｇ ｎ ；ｓｑ ｅ ｃ ｎ ｌｓｓ ｙ ｗｏ ｄ ： ａ ｉｓｖｒ ；ｇｙ ｏ ｒ ｔｉ ｅ ｅ ｅ ｕ ｎ ｅａ ａｙ ｉ． ｕ
狂 犬病是 由狂 犬病病 毒 （ ａ ｉ ｉ ｓ Ｖ） 起 Ｒ ｂｅ ｖｒ ，Ｒ 引 ｓ ｕ 的人和 哺乳 动 物 的急 性致 死 性 中枢神 经 系统 的 自然 疫 源性 疾病 ，病 死 率几 乎达 １０％【。Ｒ 基 因组 为 ０ ” Ｖ
猪伪狂犬病毒糖蛋白B细胞表位编码序列的克隆及融合表达
猪伪狂犬病毒糖蛋白B细胞表位编码序列的克隆及融合表达猪伪狂犬病毒(Rabies virus)是一种令人担忧的病毒，可以感染多种动物，包括狗、猪和人类。
与典型的狂犬病相比，猪伪狂犬病在猪身上表现出更为复杂的病理变化。
目前，防控猪伪狂犬病的主要手段是疫苗接种。
然而，现有的疫苗对于预防这种疾病的效果并不理想，因此需要研发更为有效的疫苗。
疫苗的主要成分是病原体的抗原部分，它们可以激发机体产生免疫应答从而进行防御。
在猪伪狂犬病疫苗中，糖蛋白G是最主要的抗原。
糖蛋白G是病毒表面的蛋白质，它具有多个B细胞表位(epitope)，这些表位是免疫系统识别病原体的关键。
因此，克隆和融合表达猪伪狂犬病病毒糖蛋白B细胞表位编码序列的研究对于开发新型疫苗具有重要意义。
为了实现这一目标，研究人员首先从猪伪狂犬病毒的基因组中选取糖蛋白G基因，并通过PCR扩增获得所需的DNA序列。
接下来，这段DNA序列被插入到适当的表达载体中，以便在宿主细胞中产生糖蛋白G蛋白质。
同时，为了方便检测和纯化融合蛋白，研究人员引入了一些标签序列。
经过以上步骤，研究人员成功获得了猪伪狂犬病毒糖蛋白G的表位融合蛋白。
这种融合蛋白包含了糖蛋白G的多个B细胞表位编码序列，因此有望在机体中诱导更强的免疫应答。
接着，研究人员将融合蛋白转染到哺乳动物细胞中，利用细胞的表达机制和代谢途径，使蛋白质得以正确表达和折叠。
在融合蛋白的表达过程中，研究人员进行了一系列的实验和优化。
他们调整了转染的细胞系、转染的时间和蛋白的表达量，以确保融合蛋白在细胞内得到高效表达。
同时，为了增加蛋白的稳定性和纯度，研究人员对细胞培养基进行了优化，添加了一些特殊的培养物质，并利用亲和层析等方法对蛋白进行纯化。
经过以上实验步骤，研究人员成功获得了猪伪狂犬病毒糖蛋白B细胞表位编码序列的克隆及融合表达产物。
通过进一步的免疫学实验，研究人员将测试这些融合蛋白的免疫原性和保护性，评估其在预防猪伪狂犬病中的应用前景。
伪狂犬病病毒FJSW的分离鉴定及gG基因序列分析
福建畜牧兽医第43卷第1期2021年17伪狂犬病病毒FJSW的分离鉴定及gG基因序列分析傅星源兆丰华生物科技(福州)有限公司福州350014摘要从福建省某规模化猪场的患猪中分离到一株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为FJSW株，对其进行PCR鉴定、gG基因测序等鉴定，并与GenBank上发表的国內外毒株进行序列分析和遗传进化分析遥结果显示，病毒经Vero细胞培养可产生典型细胞病变遥该毒株gG基因核苷酸序列与国內分离毒株的同源性为99.7%〜100.0%,与国外分离毒株核苷酸同源性为98.9%〜99.1%遥遗传进化分析表明，FJSW株与国內2012年以来新分离的流行毒株属于同一分支,与国外分离的毒株亲缘关系较远遥鉴定结果表明，分离株FJSW是一株伪狂犬病变异毒株遥关键词伪狂犬病病毒分离鉴定gG基因序列分析文献标识码:A文章编号：1003-4331(2021)01-0017-03Isolation and identification of FJSW of pseudorabies virus and sequence analysis of gG geneFu Xingyuan(Jofunhwa Biotechnology(Fuzhou)Co.Ltd.,Fuzhou350014)Abstract A suspected pseudorabies virus variant,named FJSW,was isolated from dead piglets in a large-scale pig farms of Fujian province and determined by PCR identification,gG gene sequence and analyze with domestic and foreign strains from Genbank.The results showed that the virus grown on Vero cell culture can produced typical cytopathic effect.It was shown that the related genes were highly homologous among Chinese isolates(99.7%~100.0%),but relatively lower between Chinese and foreign isolates(98.9%~ 99.1%).Phylogenetic analysis showed that FJSW strain was clustered to a relatively independent branch together with newly isolated strain in recent years,and it was far from the classical strains from foreign-country.These results demonstrated that a new wild pseu-dorabies virus had been isolated.Key words Pseudorabies virus Isolation and identification gG gene Sequence analysis伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。
伪狂犬病病毒Kaplan株糖蛋白gG基因的克隆与表达
伪狂犬病病毒Kaplan株糖蛋白gG基因的克隆与表达赵培;魏园园;兰德松;魏澍【摘要】The glycoprotein G (gG) gene of pseudorabies virus Kaplan strain was amplified by PCR followed by sequence analysis. The results revealed that the gene fragment was 1314 base pairs (bp) in length. The full-length gG gene was cloned into the prokaryotic expression vector pET-30a(+) , and expressed in E.coli induced by IPTG. The molecular weight of the gG protein was approximately 54ku identified by SDS-PAGE and Western-Blot.The results are helpful for investigat-ing the structure and function of gG protein and preparation of diagnostic reagents for pseudora-bies.%本试验利用PCR技术扩增了伪狂犬病病毒（PRV）Kaplan株的糖蛋白G（gG）基因，结果显示，扩增的片段长约为1314 bp。
将gG基因克隆到原核表达载体pET-30a中，转入大肠杆菌中并经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE蛋白电泳和Western-Blot免疫印迹分析，证实表达了分子量大小约为54 ku的特异性gG蛋白，并能被特异性抗体所识别。
本研究为深入阐明PRV gG基因结构与功能及诊断试剂的研发奠定了基础。
伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gK基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达
伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gK基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达徐引弟;陈焕春;肖少波;何启盖;钱平【期刊名称】《中国兽医学报》【年(卷),期】2003(23)2【摘要】根据伪狂犬病病毒 (PRV) Ka株序列 ,合成 1对包含 g K基因完整编码区的引物 ,以 PRV Ea株Bam H 5′片段为模板 ,扩增出 0 .9kb特异性带。
将纯化的扩增产物克隆到 p Bluescript SK+ 中 ,构建了重组质粒 p SKg K,用双脱氧末端终止法进行序列测定 ,并同国外 Ka株进行比较。
结果表明 ,Ea株 g K基因全长939bp,编码 313个氨基酸 ,与 Ka株比较 ,Ea株 g K基因有 2 2处点突变 ,但无插入突变和缺失 ,同源性达 97.78%。
将 g K基因克隆到原核表达载体p GEX- 2 T中 ,构建了 g K全基因原核表达载体 p2 Tg K939。
再用 Bam H 、Xho 酶切 p2 Tg K939,回收 5 88bp g K小片段 ,克隆到原核表达载体 p GEX- KG中 ,构建了 g K部分基因原核表达载体 p KGgk5 88。
经 IPTG诱导 ,g K全基因不表达 ,而 g K 部分基因表达约 4 0 0 0 0融合蛋白。
用 PRV高免血清经 Western blotting证明 ,g K有免疫原性。
提取 g K包涵体并制备高免血清 ,EL ISA检测抗体效价为1∶ 6 4【总页数】4页(P138-141)【关键词】Ea株;糖蛋白;gK基因;大肠杆菌;伪狂犬病病毒;序列分析;基因表达;基因克隆【作者】徐引弟;陈焕春;肖少波;何启盖;钱平【作者单位】华中农业大学畜牧兽医学院【正文语种】中文【中图分类】S852.659.1【相关文献】1.伪狂犬病病毒Ea株EP0基因的克隆序列分析及其在大肠杆菌中的表达 [J], 方六荣;陈焕春;肖少波;马相如;王革飞2.伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达 [J], 薛念波;肖少波;江云波;常天明;刘曼莉;赵骞;罗锐;陈焕春;方六荣3.伪狂犬病病毒Ea株UL31基因克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达 [J], 马相如;胡勤芹;肖少波;方六荣;陈焕春4.伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析 [J], 刘正飞;陈焕春;琚春梅;吴斌;何启盖5.伪狂犬病病毒Ea株gE基因主要抗原表位区的克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 肖少波;陈焕春;方六荣;何启盖;徐引娣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
伪狂犬病病毒湖北株糖蛋白gD基因的克隆及序列测定
伪狂犬病病毒湖北株糖蛋白gD基因的克隆及序列测定王家富;张楚瑜;丁建华;周荣;温淑娟;黄镇华【期刊名称】《病毒学报》【年(卷),期】2000(16)1【摘要】According to the sequence of gD gene of PRV Rice strain, the primers of 22bp were ing PRV genomic DNA of Hubei and Shuangcheng virus strains which infected BHK 21 cell separately as template, the gD gene of PRV was amplified sucessfully by PCR and cloned into pGEM T vector. Restriction enzyme analysis showed that the cloned gD gene at SmaⅠ,SalⅠ,KpnⅠ,PvuⅡ sites was the same as that of PRV Rice strain. The gD gene consisted of 1,263 nucleotides including an open reading frame spanning 1,197 nucleotieds which could encode a protein of 398 amino acids. The ORF didn′t include an amino acid sequence directing N linked glycosylation (NXT or NXS). Comparison of our complete Hubei strain gD gene sequence with the Rice strain gD gene sequence showed that the nucleotide and deduced amino acid homology were about 97% and there was an 12 basepair deletion in 835 846 nucleotide sites that coded Arg Pro Arg Pro. A region of the amino acid sequence and the positions of the cysteine residues of PRV HB gD were homologous to HSV I glycoprotein D. This work laid foundation for PRV gene immunization and studying PRV sub unit vaccine.【总页数】5页(P65-69)【关键词】伪狂犬病病毒;gD基因;PCR扩增;基因克隆;序列【作者】王家富;张楚瑜;丁建华;周荣;温淑娟;黄镇华【作者单位】武汉大学生命科学院病毒所;广州同和南方医院基因室【正文语种】中文【中图分类】S852.65;S858.292【相关文献】1.伪狂犬病病毒鄂A株包膜糖蛋白gD基因的克隆与表达 [J], 陈新华;杨林;洪文洲;陈焕春;陈曲侯;龙綮新;王章2.猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白gD主要抗原表位区基因的克隆及原核表达 [J], 罗飞;李宇琴;周洁;南文龙;陆明哲;陈义平3.伪狂犬病病毒闽A株糖蛋白gD基因去信号肽片段在大肠埃希氏菌中的表达 [J], 娄高明;邓汉虹;杨承槐4.伪狂犬病病毒gG-gD基因片段的扩增及克隆和序列测定 [J], 罗满林;黄毓茂;刘镇明;吴红专;袁少华5.伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的表达及基因免疫 [J], 洪文洲;陈焕春;方六荣;周复春;何启盖;吴斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
伪狂犬病病毒野毒荧光定量PCR检测方法的建立
伪狂犬病病毒野毒荧光定量PCR检测方法的建立田云;孙彦伟;任裕其;查云峰;王福广;焦颖【摘要】根据伪狂犬病病毒gE基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病病毒野毒的PCR引物和一条Taqman荧光探针,采用Li ght Cycl e 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测伪狂犬病病毒野毒的荧光定量PCR 技术。
该方法的线性范围为1.0×102～1.0×1010拷贝,灵敏度可达4拷贝。
检测速度快,仪器的运行时间仅为1 h。
对13株猪伪狂犬病病毒野毒进行了检测,结果均为阳性;与伪狂犬病gE基因缺失疫苗、猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。
与病毒分离培养比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好等优点,可望用于临床上伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒的区分,伪狂犬病病毒野毒的检测和病毒分布的研究等。
%According to the sequences of gE gene of pseudorabies virus （PRV）,one pair of primers and one Taqman probe were designed and synthesized for differentiating the wild strains of pseudorabies virus from the field samples by using LightCycle 480 real-time PCR machine.The detectable linear range of this novel qPCR method was from 1.0×102 to 1.0×1010 copies with the lowest de tectable DNA limit of 4 copies.This rapid and sensitive qPCR test could be run in one hour to acquire the results.Its specificity by detecting 13 wild strains of pseudorabies viruses isolated in our laboratory was confirmed in which no any positive amplification for swine parvovirus and duck plague virus（duck enteritis virus） were produced.This method was more highlyrapid,sensitive,specific and repeatable than the classical virus isolation andculture methods,and could be used for the detection of wild type of PRV in the field samples.【期刊名称】《广东畜牧兽医科技》【年(卷),期】2012(037)001【总页数】4页(P31-34)【关键词】猪伪狂犬病病毒野毒;荧光定量PCR;临床检测【作者】田云;孙彦伟;任裕其;查云峰;王福广;焦颖【作者单位】广东省动物防疫监督总所,广东广州510230;广东省动物防疫监督总所,广东广州510230;广东省动物防疫监督总所,广东广州510230;广东省动物防疫监督总所,广东广州510230;广东省动物防疫监督总所,广东广州510230;广东省动物防疫监督总所,广东广州510230【正文语种】中文【中图分类】S852.659.1猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由疱疹病毒科的猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽及野生动物的一种以发热、奇痒（猪除外），呼吸和神经系统疾病为特征的急性传染病，又称Aujeszky病[1]。
两株狂犬病病毒强毒株糖蛋白基因的克隆及潜在抗原表位分析
两株狂犬病病毒强毒株糖蛋白基因的克隆及潜在抗原表位分析崔艳;李忠;王雷;张守峰;扈荣良【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2007(29)6【摘要】通过RT-PCR分别获得了狂犬病病毒强毒CVS株、DRV82株糖蛋白基因,进行克隆及测序,并推导出氨基酸序列,与犬用疫苗弱毒株ERA、SRV9、犬源性街毒株CGX及人用疫苗株PG的糖蛋白序列进行比较.结果表明,以上狂犬病病毒毒株间的核苷酸同源性为83.1%～99.2%,氨基酸序列同源性为87.0%～98.5%.经Jameson-wolf抗原表位优势图分析,CVS株与其他各株相比发现在304位、372位抗原表位优势升高;而DRV82株与其它各株差异不明显.抗原优势变化可能导致狂犬病病毒糖蛋白出现新的潜在抗原位点,为下一步构建不同毒株的狂犬病病毒糖蛋白重组疫苗奠定了基础.【总页数】4页(P479-482)【作者】崔艳;李忠;王雷;张守峰;扈荣良【作者单位】军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林,长春,130062;军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林,长春,130062;军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林,长春,130062;军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林,长春,130062;军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林,长春,130062【正文语种】中文【中图分类】S855.3;Q786【相关文献】1.伪狂犬病病毒Min-A株gE主要抗原表位基因的克隆与鉴定 [J], 王丽;宋杰;刘晓燕;梅志强;何涛2.狂犬病病毒糖蛋白基因的克隆及其二级结构和B细胞抗原表位预测 [J], 李江涛;殷相平;柳纪省;胡永浩3.猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位区基因的克隆及原核表达 [J], 罗飞;陈义平;陆明哲;彭大新;周洁;李宇琴;徐宝娟;南文龙4.猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白gD主要抗原表位区基因的克隆及原核表达 [J], 罗飞;李宇琴;周洁;南文龙;陆明哲;陈义平5.猪轮状病毒OSU强毒株vp7基因的克隆及其抗原表位原核表达和免疫学活性分析 [J], 时洪艳;冯力;陈建飞;孙东波;吴波平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
狂犬病毒aG株糖蛋白膜外区基因克隆和序列分析
狂犬病毒aG株糖蛋白膜外区基因克隆和序列分析
明文玉;黎孟枫
【期刊名称】《广东药学院学报》
【年(卷),期】1995(11)3
【摘要】本文应用聚合酶链反应技术获得了狂犬病毒ａＧ株糖蛋白膜外区基因克隆并进行了序列分析。
测出其核苷酸序列与其他株相应区序列的同源性在９０．１２％到９３．０３％之间，推导氮基酸序列的同源性在９１．４１％到９３％、２３％之间，经分析发现成熟肽推导氨基酸第１８２位的替代，导致了乙酰胆碱受体结合序列的构象改变，可能是造成ＲＶａＧ毒力减弱的分子基础。
【总页数】6页(P146-151)
【作者】明文玉;黎孟枫
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R373.9
【相关文献】
1.狂犬病毒3aG株糖蛋白基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 张海;李六金;施新猷;娄清林;李秦;姜焕宏;赵世君
2.狂犬病毒3aG株核蛋白基因的克隆及序列分析 [J], 张新梅;王树蕙
3.狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区的原核表达及纯化 [J], 鞠美芳;殷相平;柳纪省
4.弓形虫上海株SAG2基因克隆和序列分析 [J], 陈志强;程天印;王权;陈永军
5.日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶(SjC-TPI)基因克隆与序列分析 [J], 余传信;朱荫昌;殷旭仁;司进
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
伪狂犬病病毒gG-gD基因片段的扩增及克隆和序列测定
伪狂犬病病毒gG-gD基因片段的扩增及克隆和序列测定罗满林;黄毓茂;刘镇明;吴红专;袁少华
【期刊名称】《中国兽医科技》
【年(卷),期】2001(31)8
【摘要】以伪狂犬病病毒 (PRV)HB 93 0 4株的基因组为模板 ,利用聚合酶链反应(PCR)对其gG gD基因片段进行扩增 ,获得了预定大小的片段 ,将这一片段克隆到质粒载体 pPK中。
对重组质粒pPKGD进行限制性内切酶分析、PCR鉴定和克隆片段的序列测定 ,证实了克隆片段的可靠性。
【总页数】3页(P3-5)
【关键词】伪狂犬病病毒;聚合酶链反应;gG-gD基因片段;分子克隆;序列测定【作者】罗满林;黄毓茂;刘镇明;吴红专;袁少华
【作者单位】华南农业大学动物医学系
【正文语种】中文
【中图分类】S852.659.1
【相关文献】
1.抗人肝癌单克隆抗体链可变区基因的体外扩增,克隆及序列测定 [J], 杨萍;刘彦仿
2.对虾白斑症病毒(WSSV)部分克隆片段的序列测定及PCR扩增 [J], 谢数涛;何建国;吕玲
3.抗膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因扩增克隆及序列测定 [J], 俞莉章;萧飒;黄华梁
4.伪狂犬病病毒蛋白激酶基因部分序列的克隆和序列测定及转移质粒载体的构建[J], 黄伟坚;陈德胜;姜焱;芦银华;张雪莲;陈溥言
5.伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定 [J], 娄高明;敖敬群;杨林;杜伟贤;王珣章
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
狂犬病病毒核蛋白和糖蛋白基因的克隆及其腺病毒穿梭载体的构建
狂犬病病毒核蛋白和糖蛋白基因的克隆及其腺病毒穿梭载体的构建殷相平;柳纪省;胡永浩;王辉;李志勇;兰喜;李宝玉;杨彬【期刊名称】《中国兽医科技》【年(卷),期】2005(35)7【摘要】用狂犬病病毒CVS毒株经小鼠脑腔攻击后从发病鼠脑组织中提取总RNA,用带接头的特异性引物分别扩增出了狂犬病病毒核蛋白(N)基因和糖蛋白(G)基因。
将N基因和G基因分别克隆入质粒载体pMD18T后,对筛选的含有N基因和G基因的重组质粒进行了全基因序列测定和分析。
随后将狂犬病病毒N基因和G基因分别从其各自的克隆载体上双酶切消化,同时亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV。
经卡那霉素抗性和酶切筛选,最终成功构建了含有N基因和G基因的重组穿梭载体pAdTrackCMVNG。
【总页数】5页(P507-511)【关键词】狂犬病毒;N基因;G基因;腺病毒穿梭载体【作者】殷相平;柳纪省;胡永浩;王辉;李志勇;兰喜;李宝玉;杨彬【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所;甘肃农业大学动物医学院【正文语种】中文【中图分类】S855.3;Q785【相关文献】1.狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白基因的克隆和重组腺病毒的构建 [J], 张云;李文辉;王树惠;刘力;杨帆2.狂犬病毒3aG株糖蛋白基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 张海;李六金;施新猷;娄清林;李秦;姜焕宏;赵世君3.狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3区缺失转移表达载体的构建及表达 [J], 牛建强;夏咸柱;扈荣良;张守峰;黄耕4.狂犬病病毒核蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建研究 [J], 李海涛;扈荣良;张守峰;肖跃强;袁慧君;涂长春5.狂犬病毒糖蛋白和核蛋白主要免疫活性位点的质粒载体构建 [J], 杨裕华;汪天虹;赵世立;解力因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
伪狂犬病病毒Min-A株gE基因的克隆及序列分析
伪狂犬病病毒Min-A株gE基因的克隆及序列分析胡涛;崔保安;王学斌;杨明凡;张素梅;王岩【期刊名称】《中国兽医科技》【年(卷),期】2003(33)8【摘要】参考GenBank中伪狂犬病病毒 (PRV) gE基因的序列设计了 1对引物 ,对PRVMin A株进行了PCR扩增 ,扩增产物克隆于 pGEM TEasy载体。
对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序 ,证实了克隆片段的可靠性。
测序结果表明 ,目的片段包含 1个 174 0bp的开放性阅读框(ORF) ,编码由 5 79个氨基酸组成的多肽。
同源性分析表明 ,PRVMin A株与PRVEa株、SH株gE基因的核苷酸同源性分别为 99.2 %、98.7% ;推导氨基酸的同源性分别为 98.6 %、97.2 %。
【总页数】5页(P15-19)【关键词】伪狂犬病病毒;Min—A株;gE基因;基因克隆;序列分析;伪狂犬病【作者】胡涛;崔保安;王学斌;杨明凡;张素梅;王岩【作者单位】河南农业大学畜牧兽医工程学院;郑州牧业高等专科学校【正文语种】中文【中图分类】S852.659.1【相关文献】1.伪狂犬病病毒Min-A株TK基因的克隆与序列分析 [J], 胡涛;崔保安;王岩;杨明凡;王学斌;张素梅2.猪伪狂犬病病毒河南分离株gE全基因的克隆与序列分析 [J], 高晓云;顾阳;潘鑫龙;郭小参;崔保安;陈红英3.伪狂犬病病毒Min-A株gE主要抗原表位基因的克隆与鉴定 [J], 王丽;宋杰;刘晓燕;梅志强;何涛4.猪伪狂犬病病毒XIN-W株gD和gE基因的克隆及序列分析 [J], 陈磊;赵铁柱;张鲁安;李岩5.猪伪狂犬病病毒NP株gE、gI基因的克隆及序列分析 [J], 林群群;郑小香;陈鹏强;陈秋勇;曾显成;胡崇伟;修金生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
伪狂犬病毒上海株糖蛋白G (gG )基因的克隆及序列分析黄伟坚1,2,姜焱1,陈德胜1,芦银华1,张雪莲1,陈溥言13(11南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室,江苏南京210095;21广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005)摘要:应用PCR 方法从PRV SH (上海株)病毒培养物扩增了gG 基因,克隆入pcDNA3质粒,并进行了序列测定。
结果表明,扩增的gG 基因片段长1719bp ,包含一个1491bp 的开放阅读框(ORF ),在起始密码子上游有TA TAAAA 盒,在终止密码子下游有AA TAAA 的poly (A )尾,编码由496个氨基酸组成的蛋白质。
与Rice 株相应的gG 片段相比,核苷酸序列同源性达9711%。
但推导的氨基酸序列同源性仅有8716%,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸,出现了突变和移码,导致氨基酸序列同源性降低。
gG 具有膜蛋白的结构特点。
关键词:伪狂犬病毒;gG 基因;PCR 扩增;核苷酸序列;氨基酸序列中图分类号:S852165+911 文献标识码:A 文章编号:10002030(2003)01010704Cloning ,sequence analysis of the gG geneof Pseudorabies virus SH strainHUAN G Wei 2jian 1,2,J IAN G Yan 1,CHEN De 2sheng 1,L U Y in 2hua 1,ZHAN G Xue 2lian 1,CHEN Pu 2yan 13(1.Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology ,Ministry of Agriculture ,Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.College of Animal Scienceand Technology ,Guangxi Univ ,Nanning 530005,China )Abstract :The gG gene of PRV SH strain was am plified by PCR technique and cloned into pcDNA3,moreover ,it was sequenced by Sanger ′s sequencing technique 1The amplified DNA fragment was 1719bp included an ORF which encoded a protein of 496amino acids with a characteristics of TA TAAAA box in u pstream and AA TAAA poly (A )in downstream of codon 1Compared with gG gene of Rice strain ,the homology of nucleotides sequence was 9711%,however ,because of inserts or deletion in the nu 2cleotides sequence of ORF ,the homology of the deduced amino acids between PRV SH strain and Rice strain was onl y 8716%1The gG was one of membrane proteins 1K ey w ords :Pseudorabies virus ;gG gene ;PCR amplification ;nucleotide sequence ;amino acids sequence伪狂犬病毒(PRV )又称猪疱疹病毒Ⅰ型,引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病,对猪的危害最为严重。
PRV 基因组为长150kb 的线性双链DNA 分子,可编码70～100种蛋白质。
其中最受关注的是位于病毒表面的糖蛋白,其不仅与病毒的吸附、复制、释放有关,而且与病毒的毒力、诱发机体产生免疫有密切关系[1]。
糖蛋白G (gG 旧称gX )是伪狂犬病毒在体外复制的非必需蛋白,是惟一分泌到病毒外的糖蛋白[2],可刺激机体产生抗体。
gG 与病毒的毒力无关,其缺失不会导致毒力下降,且缺失gG 对病毒免疫原性的影响比缺失gE 要小[3]。
但对gG 在PRV 的生命活动过程中的作用了解甚少。
在有些α2疱疹病毒中,如HSV 21中已发现g G 在病毒侵入细胞过程中有重要作用[4]。
在BHV 1中影响病毒在宿主细胞内有效增殖、细胞间扩散及细胞凋亡[5]。
g G 具有很强的抗原性[6],且在自然界没有发现g G 缺 收稿日期:20020203 基金项目:上海市农委重点攻关课题(998057) 作者简介:黄伟坚(1963),副教授,在职博士生,从事动物分子病毒学研究。
3通讯作者Corresponding author ,E 2mail :aid @njau 1edu 1cn 南京农业大学学报 2003,26(1):107～110Journal of N anjing A gricultural U niversity失的野毒株。
因此可以利用g G作为疫苗株的缺失标志蛋白,用血清学方法鉴别野毒株感染或疫苗株免疫猪。
为深入了解g G的结构特点,构建g G缺失株,建立g G血清学鉴别诊断方法,对PRV SH(上海株)g G基因进行克隆和序列测定,并从核苷酸和氨基酸水平上进行了分析比较。
1 材料和方法111 实验材料猪PRV SH株、兔肾传代细胞株(R K13)、大肠杆菌DH5α株、质粒pcDNA3由南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室保存。
p GEM T easy载体及连接试剂购自Promega公司。
112 主要试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR反应试剂、DNA marker均为大连Takara公司产品,DNA 胶回收试剂盒为上海华舜公司产品。
113 病毒的培养和模板制备接种适量PRV SH株种毒至R K细胞中,待80%细胞病变后收获,冻融3次;低速离心去除细胞碎片,上清液加入终浓度为1%的SDS、100μg・mL-1蛋白酶K,50℃水浴1h;用酚/氯仿混合物和氯仿各抽提一次,上清用无水乙醇沉淀DNA;待DNA干燥后溶解于适量灭菌双蒸水中,作PCR模板。
114 引物设计与合成根据G enBank上发表的Rice株g G基因序列[2]设计一对引物,并在5′端分别加上Eco RⅠ和XbaⅠ酶切位点。
包括完整的g G基因及部分非编码序列,由大连Takara公司合成。
引物序列为:g G1:5′CGG AA TTCTTTG A TCCCGTCCGCCGCCCTTC3′;g G2:5′GCTCTA G ACCCGGTAA GCAA G2 GCCGTAC3′。
115 gG基因的PCR扩增和回收PCR反应体积50μL,依次加入2×GC缓冲液25μL,dN TP混合物(均为215mmol・L-1) 8μL,引物g G1和g G2(20μmol・L-1)各1μL,LA Taq酶015μL,双蒸水1215μL。
模板DNA先在沸水中煮10min,冰浴冷却后取2μL加入PCR系统中,先在95℃预变性240s,再按95℃50s,64℃60s,72℃150s进行35个循环,最后一次循环72℃延伸10min。
取8μL经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,分子量大小符合的PCR产物用胶回收试剂盒回收。
116 基因的克隆和序列分析纯化的PCR产物按Promega公司使用说明与p GEM T2easy载体连接,总体积10μL,4℃过夜。
转化DH5α大肠杆菌感受态细胞涂布于加有氨苄青霉素的平板,培养14～16h;挑取菌落培养,抽提质粒,用Eco RⅠ酶切筛选阳性质粒。
用Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切出117kb的克隆片段,插入pcDNA3的相同酶切位点上,得到重组质粒pCg Gsh,送大连Takara公司测序。
得到的g G序列用DNAStar 生物软件与Rice株的g G基因进行核苷酸和氨基酸水平比较。
2 结 果211 PCR扩增和克隆结果从PRV SH株病毒培养物总DNA中扩增出一条约117kb的产物,符合设计要求。
产物连接到p GEM T2easy载体后,用Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切,切出的117kb片段克隆到pcDNA3质粒,得到重组质粒pCg Gsh(图1)。
图1 PRV gG基因PCR扩增和重组质粒pCgG sh酶切结果Fig.1 PCR product and enzyme digestion of pCgG sh1.Plasmid pCgGsh;2.pCgGsh digested with Eco RⅠandXbaⅠ;3.PCR product of gG gene;41DL2000・81・ 南 京 农 业 大 学 学 报 第26卷212 gG 基因核苷酸序列分析经测序,克隆的gG 片段长1719bp ,G+C 含量69141%,包含一个1491bp 的开放阅读框(ORF ),在起始密码子上游有一个TA TAAAA 盒,在终止密码子下游有一个AA TAAA 的poly (A )尾。
该片段与Rice 株相应片段的同源性为97161%。
在g G 编码区内,SH 株与Rice 株有19个核苷酸不同,而且在687～696位缺少9个核苷酸,在786,1001和1018位各插入1个核苷酸,在895～896位插入2个核苷酸,在1119～1120位缺少2个核苷酸,这些插入与缺少导致了突变与移码(图2)。
图2 PRV SH 株与Rice 株gG 基因核苷酸序列比较Fig.2 Comparison of the nucleotide sequences of the gG gene betw een SH strain and Rice strain(Note :(1)S :Shanghai strain ;R :Rice strain (2)“1”代表相同的核苷酸;“”代表缺失的核苷酸。
“1”denotes identical nucleotides ;“”denotes deleted nucleotides 1)213 氨基酸序列分析PRV SH 株g G 基因推导的氨基酸序列与Rice 株相比,不仅长度减少2个,只有496个氨基酸,而且同源性仅有8716%,差异较大。
这主要是由于在1001和1018位各插入一个核苷酸,导致氨基酸序列图3 PRV SH 株与Rice 株gG 基因氨基酸序列比较Fig.3 Comparison of the amino acid sequences of gG gene of SH strain and Rice strain(“1”代表相同的氨基酸;“”代表缺失的氨基酸;下划线代表糖基化位点。