伪狂犬病毒上海株糖蛋白G(gG)基因的克隆及序列

伪狂犬病毒上海株糖蛋白G (gG )基因的克隆及序列分析

黄伟坚1,2,姜焱1,陈德胜1,芦银华1,张雪莲1,陈溥言13

(11南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室,江苏南京210095;

21广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005)

摘要:应用PCR 方法从PRV SH (上海株)病毒培养物扩增了gG 基因,克隆入pcDNA3质粒,并进行了序列测定。结果表明,扩增的gG 基因片段长1719bp ,包含一个1491

bp 的开放阅读框(ORF ),在起始密码子上游有TA TAAAA 盒,在终止密码子下游有AA TAAA 的poly (A )尾,编码由496个氨基酸组成的蛋白质。与Rice 株相应的gG 片段相比,核苷酸序列同源性达9711%。但推导的氨基酸序列同源性仅有8716%,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸,出现了突变和移码,导致氨基酸序列同源性降低。gG 具有膜蛋白的结构特点。

关键词:伪狂犬病毒;gG 基因;PCR 扩增;核苷酸序列;氨基酸序列

中图分类号:S852165+911 文献标识码:A 文章编号:10002030(2003)01010704

Cloning ,sequence analysis of the gG gene

of Pseudorabies virus SH strain

HUAN G Wei 2jian 1,2,J IAN G Yan 1,CHEN De 2sheng 1,L U Y in 2hua 1,

ZHAN G Xue 2lian 1,CHEN Pu 2yan 13

(1.Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology ,Ministry of Agriculture ,

Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.College of Animal Science

and Technology ,Guangxi Univ ,Nanning 530005,China )

Abstract :The gG gene of PRV SH strain was am plified by PCR technique and cloned into pcDNA3,moreover ,it was sequenced by Sanger ′s sequencing technique 1The amplified DNA fragment was 1719bp included an ORF which encoded a protein of 496amino acids with a characteristics of TA TAAAA box in u pstream and AA TAAA poly (A )in downstream of codon 1Compared with gG gene of Rice strain ,the homology of nucleotides sequence was 9711%,however ,because of inserts or deletion in the nu 2cleotides sequence of ORF ,the homology of the deduced amino acids between PRV SH strain and Rice strain was onl y 8716%1The gG was one of membrane proteins 1

K ey w ords :Pseudorabies virus ;gG gene ;PCR amplification ;nucleotide sequence ;amino acids sequence

伪狂犬病毒(PRV )又称猪疱疹病毒Ⅰ型,引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病,对猪的危害最为严重。PRV 基因组为长150kb 的线性双链DNA 分子,可编码70～100种蛋白质。其中最受关注的是位于病毒表面的糖蛋白,其不仅与病毒的吸附、复制、释放有关,而且与病毒的毒力、诱发机体产生免疫有密切关系[1]。糖蛋白G (gG 旧称gX )是伪狂犬病毒在体外复制的非必需蛋白,是惟一分泌到病毒外的糖蛋白[2],可刺激机体产生抗体。gG 与病毒的毒力无关,其缺失不会导致毒力下降,且缺失gG 对病毒免疫原性的影响比缺失gE 要小[3]。但对gG 在PRV 的生命活动过程中的作用了解甚少。在有些α2疱疹病毒中,如HSV 21中已发现g G 在病毒侵入细胞过程中有重要作用[4]。在BHV 1中影响病毒在宿主细胞内有效增殖、细胞间扩散及细胞凋亡[5]。g G 具有很强的抗原性[6],且在自然界没有发现g G 缺 收稿日期:20020203

基金项目:上海市农委重点攻关课题(998057)

作者简介:黄伟坚(1963),副教授,在职博士生,从事动物分子病毒学研究。3通讯作者Corresponding author ,E 2mail :aid @

njau 1edu 1cn

　南京农业大学学报　2003,26(1):107～110Journal of N anjing A gricultural U niversity

失的野毒株。因此可以利用g G作为疫苗株的缺失标志蛋白,用血清学方法鉴别野毒株感染或疫苗株免疫猪。为深入了解g G的结构特点,构建g G缺失株,建立g G血清学鉴别诊断方法,对PRV SH(上海株)g G基因进行克隆和序列测定,并从核苷酸和氨基酸水平上进行了分析比较。

1　材料和方法

111　实验材料

猪PRV SH株、兔肾传代细胞株(R K13)、大肠杆菌DH5α株、质粒pcDNA3由南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室保存。p GEM T easy载体及连接试剂购自Promega公司。112　主要试剂

限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR反应试剂、DNA marker均为大连Takara公司产品,DNA 胶回收试剂盒为上海华舜公司产品。

113　病毒的培养和模板制备

接种适量PRV SH株种毒至R K细胞中,待80%细胞病变后收获,冻融3次;低速离心去除细胞碎片,上清液加入终浓度为1%的SDS、100μg・mL-1蛋白酶K,50℃水浴1h;用酚/氯仿混合物和氯仿各抽提一次,上清用无水乙醇沉淀DNA;待DNA干燥后溶解于适量灭菌双蒸水中,作PCR模板。114　引物设计与合成

根据G enBank上发表的Rice株g G基因序列[2]设计一对引物,并在5′端分别加上Eco RⅠ和XbaⅠ酶切位点。包括完整的g G基因及部分非编码序列,由大连Takara公司合成。引物序列为:g G1:5′CGG AA TTCTTTG A TCCCGTCCGCCGCCCTTC3′;g G2:5′GCTCTA G ACCCGGTAA GCAA G2 GCCGTAC3′。

115　gG基因的PCR扩增和回收

PCR反应体积50μL,依次加入2×GC缓冲液25μL,dN TP混合物(均为215mmol・L-1) 8μL,引物g G1和g G2(20μmol・L-1)各1μL,LA Taq酶015μL,双蒸水1215μL。模板DNA先在沸水中煮10min,冰浴冷却后取2μL加入PCR系统中,先在95℃预变性240s,再按95℃50s,64℃60s,72℃150s进行35个循环,最后一次循环72℃延伸10min。取8μL经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,分子量大小符合的PCR产物用胶回收试剂盒回收。

116　基因的克隆和序列分析

纯化的PCR产物按Promega公司使用说明与p GEM T2easy载体连接,总体积10μL,4℃过夜。转化DH5α大肠杆菌感受态细胞涂布于加有氨苄青

霉素的平板,培养14～16h;挑取菌落培养,抽提质粒,用Eco RⅠ酶切筛选阳性质粒。用Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切出117kb的克隆片段,插入pcDNA3的相同酶切位点上,得到重组质粒pCg Gsh,送大连Takara公司测序。得到的g G序列用DNAStar 生物软件与Rice株的g G基因进行核苷酸和氨基酸水平比较。

2　结　果

211　PCR扩增和克隆结果

从PRV SH株病毒培养物总DNA中扩增出一条约117kb的产物,符合设计要求。产物连接到p GEM T2easy载体后,用Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切,切出的117kb片段克隆到pcDNA3质粒,

得到重组质粒pCg Gsh(图1)。图1　PRV gG基因PCR扩增和重组质粒pCgG sh酶切结果Fig.1　PCR product and enzyme digestion of pCgG sh

1.Plasmid pCgGsh;

2.pCgGsh digested with Eco RⅠand

XbaⅠ;3.PCR product of gG gene;41DL2000

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・ 南　京　农　业　大　学　学　报 第26卷